3,5—水杨酸法测纤维素酶活性

实验目的

1、掌握3,5-二硝基水杨酸测定纤维素酶活力的原理和方法 2、掌握3,5-二硝基水杨酸测定还原糖的原理和方法

实验原理

1、纤维素酶水解纤维素，产生纤维二塘，葡萄糖等还原糖，能将3,5-二硝基水杨酸中的硝基还原成橙黄色的氨基化合物，利用比色法测定其还原物生成量来表示酶的活力。

2、酶活力单位：在35℃，0.1mol/L乙酸钠缓冲液（pH4.6）中每分钟能使2.5%蔗糖溶液释放1 mg还原糖的酶量定义为一个活力单位（U）。

3、单糖和某些寡糖含有游离的醛基或酮基，有还原性，属于还原糖，而多糖和蔗糖则为非还原性糖。利用多糖能被酸水解为单糖的性质可以通过测定水解后的单糖含量对总糖进行测定。

4、还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，氢氧化钠碱性溶液中此物呈橘红色，在540nm处有最大吸光值。在一定浓度范围中还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量和总糖的含量。

实验用品

试剂：3,5-水杨酸显色液，

标准葡萄糖溶液 西瓜汁 CMC 纤维素酶 蒸馏水

器材：移液管，水浴锅，滴管，比色管，容量瓶（100ml），分光光度计，电炉子，

大理石板，量筒，烧杯，橡皮筋，比色杯，卫生纸，吸耳球

实验步骤

1、纤维素酶活力的测定

1.1 取四支比色管，分别编号空白,样品1,样品2,样品3。各加入1ml纤维素酶

液，将空白比色管沸水浴10min（做参比）,冷却后加入3ml0.5%CMC 1.2 向样品管中分别加入3ml0.5%的羧甲基纤维素钠溶液，1ml酶液，摇匀 1.3 将四支比色管一起放入50℃水浴中糖化30min，取出，立即置于沸水中沸

水浴10min使酶失活

1.4 冷却后加入3ml显色液，再沸水浴10min，再次冷却后，定容至25ml，混

匀，进行比色 2、还原糖含量的测定

2.1 取西瓜汁3ml，定容至100ml备用

2.2 取6支比色管，分别标号1,2,3,4,5,6。如表一加入标准葡萄糖溶液以及蒸

馏水，分别加入3ml显色剂，沸水浴10min

2.3 取出，冷却后，定容至25ml进行比色，以葡萄糖微克数为横坐标，光密

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度为纵坐标，绘出标准曲线

2.4 取三支比色管，分别标号7,8,9.分别加入0.5ml定容好的西瓜汁以及0.5ml

蒸馏水，分别加入3ml显色剂，沸水浴10min 2.5冷却后加水定容至25ml，混匀，进行比色

实验结果

1、纤维素酶活力的测定 表一：

3,5-二硝基水杨酸测定纤维素酶活力 酶/ml 0.5%CMC 显色剂/ml 空白 1.0 3.0 3.0 样品1 1.0 3.0 3.0 0.551 样品2 1.0 3.0 3.0 0.537 样品3 1.0 3.0 3.0 0.547 550nm吸光值OD 0.000

2、果糖含量的测定 表二：

3,5-二硝基水杨酸测定还原糖 编号 试剂 1 2 3 4 5 6 7 8 9 标准葡萄糖溶液/ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 — — — 西瓜汁/ml — — — — — — 0.5 0.5 0.5 蒸馏水/ml 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.5 0.5 0.5 显色剂 分别加入3ml显色剂，沸水浴10min，冷却后加水定容至25ml，混匀 550nm 吸光值OD 0 0.118 0.246 0.398 0.523 0.662 0.324 0.344 0.342 以还原糖（mg）数为横坐标，比色值为纵坐标，绘制葡萄糖浓度—吸光值标准曲线：

葡萄糖浓度—吸光度标准曲线0.70.60.50.40.30.20.10-0.100.20.40.60.811.2吸光度线性 (吸光度)y = 0.6681x - 0.0096R2 = 0.999

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结果分析

1、纤维素活力：

酶液浓度为：10µg/ml

550nm处比色OD平均值为0.545，根据葡萄糖浓度—吸光度标准曲线得：x=0.830

1g酶每分钟水解CMC生成1µg葡萄糖定义为1个活力单位，纤维素酶的活力为8.3*107/30=2.77*106 2、西瓜中还原糖的量：

550nm下比色OD平均值为0.337，根据葡萄糖浓度—吸光度标准曲线得：x=0.519

3ml西瓜汁中还原糖的含量为：0.337/0.5*100/3=22.47mg/ml

产生误差的原因可能有：

①所提取的西瓜汁样品中含有还原性物质 ②溶液中含有杂质，影响吸光度

注意事项

1、在进行纤维素酶活性测定时，1号试管中先加入酶液进行沸水浴是为了使酶失活，与其余的进行对照

2、在进行葡萄糖含量的测定时，要注意使用的西瓜汁为稀释后的，而不是直接使用榨好的西瓜汁

3、标准葡萄糖浓度梯度和西瓜汁样品要保证基本上同时进行，时间差别不能过大，因为吸光度随时间会有一定改变，以防出现误差

4、在水浴时，确保每一组中的试管水浴时间相同，因为酶反应灵敏而迅速，否则可能产生较大误差

5、在水浴时掌握好温度，50℃水浴时就是50℃，沸水浴时就是100℃ 6、使用分光光度计时的注意事项：

①向杯中加样品时，注意加样到比色杯的2/3处； ②如样品外溢，用卫生纸向一个方向擦至透明； ③测定样品时，从浓度低到高测定；

④测定完成后，一定用洗瓶中的蒸馏水洗干净,然后倒置在滤纸上吸干； ⑤任何情况下都不许把比色杯放在仪器盖上 ⑥比色时设定空白管是为了减小系统误差

思想感悟

通过这次试验，我熟悉了722型分光光度计的操作过程，同时掌握3,5-二硝基水杨酸测定纤维素酶活力以及还原糖含量的原理和方法。同时在做纤维素酶活力测定的时候，沸水浴的时候我们的谁还没有沸，只能在其他同学的水浴锅中进行了沸水浴，这也是我认识到了做实验时提前做好准备的重要性。而且在此次试验中比色管的数量相对较多，也是我认识到了小组之间成员相互合作的重要性。收获颇丰。

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