利用BIOLOG系统对不同种类细菌鉴定的研究

利用BIOLOG系统对不同种类细菌鉴定的研究

杜昕波,赵耘,李伟杰,康凯,陈敏,张媛

(中国兽医药品监察所,北京 100081)

[收稿日期]200806-13 [文献标识码]A [文章编号]1002

1280(2008)09003103 [中图分类号]S854.43

[摘 要] 为完善细菌鉴定工作,本试验通过利用BIOLOG细菌自动微生物分析系统(简称BI2OLOG系统)对13株大肠杆菌、15株巴氏杆菌和7株金黄色葡萄球菌进行了鉴定,并与传统方法

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包括形态学观察、革兰氏染色、生化实验等的鉴定结果进行了比对。实验结果表明,与传统

方法相比BIOLOG系统具有准确、快捷、简便的优点,同时也有一定的局限性,从而为BIOLOG系统的更好使用提供了实验依据。

[关键词] 细菌鉴定;BIOLOG微生物自动分析系统;传统方法

ResearchofIdentificationofSeveralStrainsBacteriawithBIOLOG

AutomaticMicrobiologyAnalysisSystem

DUXin-bo,ZHAOYun,LIWei-jie,KANGKa,iCHENMin,ZHANGYuan

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081;China)

Abstract:Todevelopthemethodofidentificationofbacteria,thisexperimentusedtheBIOLOGautomaticmicrobi2ologyanalysissystemtoidentify13strainsofEscherichiacoli,15strainsofPasteurellamultocida,7strainsofStaphylococcusaureus,whichwereisolatedfromswine,bovine,chicken,sheep.Comparedwithconventional

methods,theBIOLOGsystemisefficientandconvenien.tKeywords:bacteriaidentification;BIOLOGautomaticmicrobiologyanalysissystem;conventionalmethods 近年来随着仪器分析技术的不断进步,各种商品化的自动化分析鉴定系统相继成功建立,上述鉴定系统的推广应用大大降低了人为因素在细菌鉴

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定过程中的影响。本试验所用的BIOLOG微生物自动分析系统是美国Biolog公司从1989年开始推出的一套微生物鉴定系统,该系统主要根据细菌

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对糖、醇、酸、醋、胺和大分子聚合物等95种碳源的利用情况进行鉴定。细菌利用碳源进行呼吸时,会将四哇类氧化还原染色剂(TV)从无色还原成紫

色,从而在鉴定微平板(96孔板)上形成该菌株特征性的反应模式或/指纹图谱0,通过纤维光学读取设备)))读数仪来读取颜色变化(分为/自动0和/人工0两种读取方式),由计算机通过概率最大模拟法将该反应模式或/指纹图谱0与数据库相比较,

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可以在瞬间得到鉴定结果,确定所分析的菌株的属名或种名。该系统在一定程度上提高了工作效率,节省了工作时间,同时更利于细菌鉴定工作标准化的实现。本研究正是利用BIOLOG细菌自动

基金项目:自然科技资源平台项目(2005OKA212053)

作者简介:杜昕波(1980年2),研究实习员,本科,从事细菌、病毒鉴定及方法研究和制备工作。E-mai:lduxinbo@ivdc.gov.cn

通讯作者:赵耘,主要从事病毒、细菌鉴定及检测方法研究和防治工作。E-mai:lzhaoyun@ivdc.gov.cn

#32#中国兽药杂志 2008,42(9):31~33/杜昕波,等

微生物分析系统对13株大肠杆菌、15株巴氏杆菌和7株金黄色葡萄球菌进行鉴定,并与传统鉴定方法进行比较,以期为细菌快速、准确的鉴定提供试验依据。

1 材料与方法1.1 菌种 大肠埃希氏菌13株,菌号分别为197、198、200、208、215、223、224、245、248、249、1490、1531、1546;多杀性巴氏杆菌15株,菌号分别为460、432、466、339、471、439、433、403、444、1766、405、474、1788、408、409;金黄色葡萄球菌7株,菌号分别为545、548、2821、2824、2833、2836、2838,以上菌株均由中国兽医药品监察所保藏。1.2 试剂及培养基 微量生化发酵管,购自北京陆桥生物技术有限公司。1.3 菌种的开启及初培养 大肠埃希氏各菌株分别用0.4mL普通肉汤溶解后,分别接种1支普通肉汤小管,1支普通琼脂斜面,0.2mL/支;多杀性巴氏杆菌各菌株分别用0.4mL马丁肉汤溶解后,分别接种1支马丁肉汤小管、1支马丁琼脂斜面,0.2mL/支;金黄色葡萄球菌分别用0.4mL普通肉汤溶解后,分别接种1支普通琼脂斜面、1支普通肉汤小管,0.2mL/支,均置37e温箱培养。1.4 细菌的纯培养及形态观察 用接种针挑取大肠埃希氏菌普通琼脂斜面上的培养物、多杀性巴氏杆菌马丁琼脂斜面上的培养物和金黄色葡萄球菌普通琼脂斜面的培养物,分别划线接种麦康凯琼脂平板、马丁琼脂平板和普通琼脂平板进行纯培养。1.5 革兰氏染色及镜检 挑选各株菌培养平板上的单菌落,大肠埃希氏菌在普通琼脂斜面上进行增殖,多杀性巴氏杆菌在马丁琼脂斜面上进行增殖后刮取各菌株斜面上的培养物进行革兰氏染色。1.6 生化试验 用各菌株纯培养物进行糖发酵试验,参照微量生化发酵管说明书进行。1.7 BIOLOG系统鉴定 菌株在BUG鲜血琼脂平板上培养后生长良好。按照BIOLOG微生物鉴定样品处理步骤,用特定的接种液制备成菌悬液加入鉴定板,经过培养,上机读取结果。具体操作如下:大肠埃希氏菌,按照革兰氏阴性肠道菌样品操作步骤,用长杆棉签挑取大肠埃希氏菌的单菌落加入GN/GP-IF接种液管并滴加巯基乙酸钠,浊度计用特定浊度标准管校正后调整其浊度为61%T?3%,制备成菌悬液,用移液器加入GN2鉴定板,置37e温箱培养18h后上读板器进行读板;多杀性巴氏杆菌,按照革兰氏阴性非肠道菌样品操作步骤,

用长杆棉签挑取多杀性巴氏杆菌的单菌落加入GN/GP-IF接种液管,浊度计用特定浊度标准管校正后调整其浊度为52%T?3%,制备成菌悬液,用移液器加入GN2鉴定板,置30e温箱培养18h后上读板器进行读板;金黄色葡萄球菌,按照革兰氏阳性球菌样品操作步骤,用长杆棉签挑取金黄色葡萄球菌的单菌落加入GN/GP-IF接种液管并滴加巯基乙酸钠,浊度计用特定浊度标准管校正后调整其浊度为20%T?3%,制备成菌悬液,用移液器加入GP2鉴定板,置37e温箱培养18h后上读板器进行读板。2 结果2.1 细菌纯培养 麦康凯平板上的大肠埃希氏菌菌落为粉红色中等大小表面湿润的圆形菌落,多杀性巴氏杆菌在马丁琼脂平板长成淡灰白色、中等大小、圆润、光滑、边缘整齐的菌落,金黄色葡萄球菌在普通琼脂平板长成金黄色、圆形、光滑、表面光亮的菌落。2.2 革兰氏染色结果 大肠埃希氏菌各菌株均为革兰氏阴性,短杆菌,菌体两端稍深染。多杀性巴氏杆菌各菌株均为革兰氏阴性球杆菌或短杆状菌。金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性单个或成堆球菌。2.3 生化试验2.3.1 大肠埃希氏菌生化检验结果 245、200、1490、248、215、1546、249菌株的海藻糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖、L阿拉伯糖、乳糖、果糖、D木糖、七叶苷、丙二酸盐试验为阳性,D山梨醇、水杨素、侧金盏花醇、棉子糖、肌醇、尿素酶、精氨酸双水解酶、VP试验为阴性。198、1531棉子糖试验为阳性,其他试验结果同上述7株。197、224、223、208D山梨醇试验为阳性,其余试验结果同245等结果。上述结果

[5]

符合文献对大肠埃希氏菌的描述,在棉子糖以及D山梨醇出现的不同试验结果,属于不同菌株的正常差异。结合菌落培养特性、菌落形态观察、菌体观察、革兰氏染色观察基本可以判定这13株菌为大肠埃希氏菌。2.3.2 多杀性巴氏杆菌生化检验结果 460、432、466、471、403、444、474菌株的果糖、甘露醇、葡萄糖、甘露糖、半乳糖试验结果为阳性,乳糖、尿素酶、七叶苷、肌醇、木糖、V.P、山梨醇、纤维二糖、明胶、阿拉伯糖试验结果为阴性。339、439、433菌株的木糖、山梨醇试验为阳性,其余试验结果同上述7株。1766、405、1788、408、409菌株的山梨醇试验结果为阳性,其余试验结果同460等7株结果。上述结果 2008,42(9):31~33/杜昕波,等 中国兽药杂志#33#

符合文献对多杀性巴氏杆菌的描述。2.3.3 金黄色葡萄球菌生化检验结果 545、548、2821、2824、2833、2836、2838菌株的乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖、蕈糖、硝酸盐还原试验结果为阳性,H2S反应、水杨素、卫茅醇、阿拉伯糖试验结果为阴性。上述结果符合文献对金黄色葡萄球菌的描述。2.4 BIOLOG系统鉴定结果(16~24h读板结果)13株大肠埃希氏菌鉴定结果:223、249、1546为Escherichiacoli(USP5-7085)且1546的鉴定结果SIM小于0.5,其余菌株的鉴定结果均为Escherichia

StrainNO.

197198200208

21522322424524824914901531

Species

M R E.coli E.coli E.coli E.coli E.coli

E.coli(USP5-7085) E.coli E.coli E.coli

E.coli(USP5-7085) E.coli E.coli

E.coli

E.coli0157BH7E.coliE.coliE.coli

E.coli(USP5-7085)E.coliE.coliE.coli

E.coli(USP5-7085)E.coli

E.coli(USP5-7085)

[5]

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coli(大肠埃希氏菌)且SIM大于0.5。15株多杀性巴氏杆菌鉴定结果:405为Pasteurelladagmatis(达可马巴斯德氏菌),其余各株均为Pasteurellamulto2cidassmultocida(多杀性巴氏杆菌),其中471鉴定结果的SIM小于0.5,其余各株鉴定结果的SIM大于0.5。7株金黄色葡萄球菌鉴定结果:各株均为Staphylococcusaureusssaureus(金黄色葡萄球菌金黄亚种)且SIM大于0.5。2.5 /人工0与/自动0对比读板 结果表明人工读板与机器读板结果存在一定差异。具体结果见表1。

表1 12株大肠埃希氏菌18h培养后人工读板与机器读板结果

PROB M R 867010090808910010092969477

100))9999)10010099)73)

SIM

M R 0.70.50.520.510.560.730.670.890.560.810.640.51

0.530.420.460.590.610.480.540.760.580.450.530.29

DIST M R 2.804.497.656.844.512.655.031.586.102.265.025.21

7.518.008.516.27

6.068.057.343.566.457.544.147.64

注:M(Manual);R(Reader)。

3 分析与讨论

菌型、培养特性、菌落形态、染色结果以及生化特性等是传统的细菌鉴定方法,本研究中所有涉及到菌株的利用以上传统方法基本能够判断出结果。BIOLOG系统直接给出鉴定结果。通过本试验中BIOLOG系统的鉴定结果与传统鉴定方法鉴定结果的比对,得出两套鉴定方法的鉴别结果均比较准确可靠。但采用上述传统鉴定方法耗时较长,从开菌种到得出结果一般至少需要1周的时间。而BI2OLOG系统一般用3天即可得出结果,而且简单的操作步骤客观减少了人为的误差。

BIOLOG系统在读板时可设/人工0与/自动0两种读板模式,相对于人工读板,自动读板较为客观标准,但在四哇类氧化还原染色剂(TV)从无色还原成紫色的过程中,其还原程度处于中等时就很难把握阴性、中性、阳性的判断,在人工读板过程中就出现了96孔板上的某一个孔中性和阳性的不同判定结果,导致最终系统判定结果的截然不同,因

此需要人为调整。所以读板最好采取/自动0与/人工0互补的方式进行。针对本试验所列的12株大肠埃希氏菌经过18h培养后进行BIOLOG系统的/人工0与/自动0读板的试验比对,其中有5株菌自动读板未得出结果,而手动读板5株菌均能得出结果。参考文献:

[1] 陆承平.兽医微生物学[M].第3版.北京:中国农业出版社,

2005:201,215-216,249-250.

[2] 冯瑞华,樊蕙,李力,等.Biolog细菌自动鉴定系统应用初探

[J].微生物杂志,2000,20(6):36-38.

[3] 程池,杨梅,李金霞,等.Biolog微生物自动分析系统细菌鉴

定操作规程的研究[J].食品与发酵工业,2006,32(5):50-54.

[4] 薛青红,刘燕,杜昕波.猪源粪肠球菌的BIOLOG系统鉴定及

其生物学特性[J].中国兽医科学,2006,36(11):876-879.[5] R.E.布坎南,N.E.吉本斯.伯杰细菌鉴定手册[M].第8版.

北京:科学出版社,1983:516-518.