微生物工程资料

1、什么是微生物工程？

，应用生物科学，特别是微生物学的理论和方法，

结合现代工程技术手段，利用微生物的某种特定性状和功能，按照人们设计的蓝图，改良、加工、繁殖微生物，以获取微生物体本身或其代谢产物等有用物质，为人类生产、生活为目的的一门新兴学科。它的最终目的是由微生物的生命活动来实现工业生产。

2、微生物工程主要应用在哪些领域？试举例说明。

1.微生物工程在食品工业中的应用。其中包括传统的含醇饮料、调味品、乳制品等，

2.微生物工程在医药卫生中的应用。抗生素

3.微生物工程在轻工业中的应用。蛋白酶、果胶酶、脂肪酶 4.微生物工程在化工能源产品中的应用。有机酸、清洁能源 5.微生物工程在农业中的应用。生物农药、生物除草剂

6.微生物工程在环境保护中的应用。如沼气发酵、好气发酵法

7.微生物工程在细菌冶金中的应用。利用化能自养细菌如铁细菌、硫化细菌等把亚铁氧化为高铁，将合硫金属矿石中的金属离子形成硫酸盐而释放出来。 8.微生物工程在高技术研究中的应用。如基因工程中用的限制性内切酶、连结酶、DNA探针等；

3、什么是半合成抗生素？试举例说明。

半合成抗生素：某些天然抗生素在去侧链后，可用化学合成法接上新的侧链而改变原有抗菌谱或其它特性，这样的抗生素就被称为半合成抗生素。 常用的半合成青霉素：甲氧苯青霉素(新青Ⅰ )、乙氧萘青霉素(新青Ⅱ )、苯唑青霉素(新青Ⅲ)、氨苄青霉素、羟氨苄青霉索等。 4、深层培养技术 又称沉没培养法。有时也称液体培养法。在深沉的液体培养中进行的一种发酵培养方法。操作时将无菌空气通入容器中，不断搅拌，使微生物充分与氧气接触而迅速繁殖。占地面积小、劳动力省，产量高，适用于机械化和自动化生产。

第二章、菌种来源

1、微生物工程的工业生产具有哪三要素？ 生产菌种的性能、发酵及提纯工艺条件、生产设备。其中优良的菌种是最重要的。 2、一般菌种分离纯化和筛选的步骤是什么？

标本采集、标本材料的预处理、富集培养、菌种初筛、菌种复筛、性能鉴定、菌种保藏。

3、常用的标本预处理的方法有哪些？举例说明。 (1)采用热处理方法减少材料中的细菌数 (2)采用膜过滤和离心的方法浓缩水中的细胞 (3)采用化学方法

(4)诱饵法：将固体基质（如蛇皮、花粉）等加到待检的土壤或水中，待其菌落长出后再铺平板分离。

(5)空气搅拌法：在空气中搅拌，收集孢子沉淀，如稻草的处理。 4、菌种分离的方法有哪些？ 施加选择性压力分离法 随机分离法

5、什么是施加选择性压力分离法 、分批式富集培养和恒化式富集培养？

施加选择性压力分离法：利用不同种类的微生物对环境和营养要求的不同，人为控制这些条件，使之利于某类或某种微生物的生长，而不利于其他种类微生物的生存，以达到使目的菌种占优势，而得以快速分离纯化的目的。 摇瓶培养（分批式富集培养）：是指将富集培养物转接到新的同一种培养基中，重新建立选择性压力，如此反复转种几次后，再取此富集培养物接种到固体培养基上，以获得单菌落。

连续培养（恒化式富集培养）：通过改变限制性基质的浓度来控制两类不同菌株的比生长速 率。

6、.设计试验方案，筛选出你所需要的目的菌株？

第三章、代谢调节

1、微生物的代谢类型、调节方式、调节部位 类型：分解代谢和合成代谢

方式：细胞透性的调节、代谢途径区域化 、代谢流向的调控、代谢速度的调控 调节部位：细胞质：糖酵解、磷酸戊糖途径、糖原合成、脂肪酸合成；

线粒体：丙酮酸氧化、三羧酸循环、B-氧化、呼吸链电子传递、氧化磷酸化；

细胞核：核酸合成；

内质网：蛋白质合成、磷脂合成。 2、酶活调节和酶量调节的区别

酶活性调节:是对现有的酶在活性变化上进行调节，它不会涉及酶量的变化， 酶量的调节:不涉及现有酶活性的变化，只是通过影响酶合成或酶合成速率以控制酶量变化，达到控制代谢过程的目的。

从调节作用的特点上看:酶活性调节的效果既及时又迅速，但由于酶量调节涉及到酶蛋白合成，它调节的效果相应地来得慢。 3、酶合成调节的诱导和阻遏、诱导剂、阻遏物

诱导：是指在某种化合物作用下，导致某种酶合成或合成速率提高的现象。 阻遏：是在某种物质作用下导致某种酶合成停止或合成速率降低的现象。 诱导剂：能够诱导某种酶合成的化合物称为该酶的诱导剂。 阻遏物:阻遏酶合成的物质称为阻遏物

4、在工业发酵上如何应用代谢调节理论，试举例

工业发酵的目的：大量积累人们所需要的微生物代谢产物。 代谢的人工控制：人为地打破微生物的代谢控制体系，使代谢朝着人们希望的方向进行。

人工控制代谢的手段：控制发酵条件（生物化学方法）； 改变微生物遗传特性(遗传学方法）； 改变细胞膜透性； 5、前体与诱导物的区别

有时难于区分促进作用是诱导物的作用还是前体的作用。一般，可把那些能在生长期内、生产期前促进产物合成的化合物看做诱导物，而前体往往只在生产期内起作用。

另外，诱导物可以被非前体的结构类似物取代。 7、次级代谢的调节主要有哪些方式

（1）初级代谢对次级代谢的调节； （2）碳代谢物的调节作用； （3）氮代谢物的调节作用； （4）磷酸盐的调节作用；

（5）次级代谢中的诱导作用及产物的反馈作用； （6）次级代谢中细胞膜透性调节 8、代谢工程及三种方式

代谢工程是指利用基因工程技术，定向地对细胞代谢途径进行修饰、改造，以改变微生物的代谢特性，并与微生物基因调控、代谢调控及生化工程相结合，构建新的代谢途径，生产新的代谢产物的工程技术领域。 方式：改变代谢途径

、扩展代谢途径 、构建新的代谢途径

第四章、菌种的选育

菌种选育方法：自然选育、人工选育（诱变、杂交、原生质体融合、基因工程） 自然突变的原因：多因素低剂量的诱变效应、互变异构效应

自然选育的优点：简单易行，并可以达到纯化菌种、防止菌种衰退、稳定生产、提高产量的目的。缺点：效率低、进展慢。 突变包括染色体畸变、点突变 诱变育种的基本过程：选择合适的出发菌株→制备待处理的菌悬液→诱变处理→筛选→保藏和扩大试验。

出发菌株应具备：对诱变剂的敏感性高；具有特定生产性状的能力或潜力。 出发菌株的来源：自然界直接分离到的野生型菌株；历经生产考验的菌株；已经历多次育种处理的菌株。

制备细胞悬液要求：菌体处于对数生长期，并使细胞处于同步生长；细胞分散且为单细胞，以避免表型迟延现象（phenotypic lag）；

表型延迟现象：指某一突变体在DNA复制和细胞分裂后，才在表型上显示出来，造成不纯的菌落。原因：分离性延迟现象，生理性延迟现象

诱变剂的作用：提高突变的频率；扩大产量变异的幅度；使产量变异朝着正突变或负突变移动。

杂交育种指将两个基因型不同的菌株经吻合或接合，使遗传物质重新组合，从中分离和筛选具有新性状的菌株。

1.细菌杂交：细菌的杂交可以通过细菌接合、F因子转导、R因子转移、转化和转导等发生基因重组。普遍性转导，双交换形成转导子。 2.放线菌的杂交育种：

放线菌的杂交原理：包括四种遗传体系：

a.异核现象 b.接合现象c.异核系的形成d.重组体的形成

放线菌的杂交方法：混合培养法（选择性平板法、异核系分析法）、平板杂交法、玻璃纸转移法。

玻璃纸转移法具体步骤为：（1）玻璃纸混合培养；（2）混合培养物的转移；（3）异核系的分离。

3.霉菌的杂交育种：

准性生殖：是指真菌中不通过有性生殖的基因重组过程。 准性生殖过程：异核体的形成，二倍体的形成，体细胞重组。

霉菌的杂交技术：选择直接亲本：具有遗传标记。异核体的形成：混菌培养。双

倍体的检出：斑点和扇面。分离子的检出：纯化、鉴别。 原生质体融合的优越性：有利于不同种属微生物的杂交。重组频率高于其他杂交方法。遗传物质传递更加充分、完善，既有核配，又有质配。可以用温度、药物、紫外线等处理、纯化亲株的一方或双方，然后使之融合再在再生菌落中筛选重组子，提高筛选效率。用微生物的原生质体进行诱变，可明显提高诱变频率。 原生质体融合步骤：原生质体制备（主要是酶法，如溶菌酶、纤维素酶等）、原生质体再生、原生质体融合、融合子的检出（直接法、间接法）

DNA重组技术的基本过程 含目的基因的DNA片断的准备、载体、含目的基因的DNA片断与载体相连接、将重组分子送入受体细胞，并于其中复制、扩增、筛选出带有重组DNA分子的转化细胞

获得目的基因的方法：鸟枪法、cDNA法、人工合成 质粒不稳定可分为分裂不稳定和结构不稳定两种情况。

质粒的分裂不稳定：是指基因工程菌分裂时，出现一定比例不含质粒的子代菌。 质粒的结构不稳定：是指外源基因从质粒上丢失、碱基重排或缺失，引起基因工程菌性能的改变。

质粒不稳定产生的原因：一是含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；二是这两种菌的比生长速率(μ)差异的大小。

提高质粒稳定性的方法：两阶段培养法；控制适当的培养条件。

第五章：菌种保藏

菌种衰退：菌种经过长期人工培养或保藏，由于自发突变的作用而引起某些优良特性变弱或消失的现象。

菌种衰退的原因是有关基因的负突变。在形态上：分生孢子减少或颜色改变。在生理上：常指产量的下降.

防止菌种衰退的方法有：控制传代次数；选择合适的培养条件；利用不同类型的细胞进行传代；选择合适的保藏方法。

菌种保藏的原理和方法：菌种保藏主要是根据微生物的生理、生化特性，在人工创造的条件下使其代谢处于不活泼的休眠状态，生长繁殖受到抑制。这样就能尽可能地减低菌种的变异率。主要是通过降低培养基营养成分（寡营养）、低温、干燥和缺氧四个手段。斜面低温保藏法（低温。弊端：短期内多次传代；容易引起菌种发生变异，杂菌污染的机会随之增多）砂土管保藏法：（干燥，寡营养）真空冷冻干燥保藏法(干燥，低温）液氮保藏法 (低温)悬液保藏法（寡营养保藏）低温保藏法、石蜡油封存法（低温、缺氧）自然基质保藏法、基因工程菌的保藏 菌种的复壮是指创造一个适合原菌株生长繁殖的条件，经分离纯化，淘汰退化型个体或挑出原种型个体的选育菌种的方法。 菌种的复壮措施：纯种分离：（平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法等）； 通过寄主体内生长进行复壮；淘汰已衰退的个体。

第六章、培养基

1、孢子培养基、种子培养基和发酵培养基及 基本配制要求 孢子培养基：是供菌种繁殖孢子的一种常用固体培养基，对这种培养基的要求是：能使菌体迅速生长，产生较多优质的孢子，并要求这种培养基不易引起菌种发生变异。所以对孢子培养基的基本配制要求是：

（1）营养不要太丰富(特别是有机氮源)，否则不易产孢子。

（2）所用无机盐的浓度要适量，不然也会影响孢子量和孢子颜色。 （3）要注意孢子培养基的pH和湿度。

种子培养基：是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌体长得粗壮，成为

活力强的“种子”。 所以种子培养基的营养成分要求比较丰富和完全，氮源和维生素的含量也要高些，成分要考虑在微生物代谢过程中能维持稳定的pH，其组成还要根据不同菌种的生理特征而定。 发酵培养基是供菌种生长、繁殖和合成产物之用。它既要使种子接种后能迅速生长，达到一定的菌丝浓度，又要使长好的菌体能迅速合成所需产物。发酵培养基的要求：

① 培养基能够满足产物最经济的合成。 ② 发酵后所形成的副产物尽可能的少。

③ 培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的供应。

④ 所选用培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响通气、提取、纯化及废物处理等

2、了解发酵培养基的组成，发酵培养基常用的原料以及其中的基本概念 碳源：

作用：提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳成分，提供合成目的产物所必须的碳成分。

来源：糖类、油脂、有机酸、正烷烃。 氮源：

氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。 3、掌握发酵培养基优化与设计的思路

培养基成分选择的原则：菌种的同化能力、代谢的阻遏和诱导、合适的C、N比、pH的要求。

培养基中碳氮比的影响极为明显。氮源过多，会使菌体生长过于旺盛，pH偏高，不利于代谢产物的积累，氮源不足，则菌体繁殖量少，从而影响产量，碳源过多，则容易形成较低的pH，若碳源不足，易引起菌体衰老和自溶。

一般工业发酵培养基的C：N 为100：0.2～2.0，谷氨酸产生菌的C：N 为100：15～21。

培养基设计的步骤：

（1）根据前人的经验和培养基成分确定一些必须考虑的问题，初步确定可能的培养基成分；

（2）通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分；

（3）当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适的浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数常采用一些合理的实验设计方法如正交实验设计、响应面分析法。 4、C、N比

一般工业发酵培养基的C：N 为100：0.2～2.0，谷氨酸产生菌的C：N 为100：15～21。

5、补料的作用

（1）丰富培养基，避免了菌体过早衰老，使产物合成的旺盛期延长；（2）控制了pH值和代谢方向；（3）改善了通气效果，避免了菌体生长可能受到的抑制；（4）补料还能补足发酵液的体积。

6、促进剂:是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。

第七章、发酵工艺

1、温度对发酵的影响主要表现在哪些方面？ 1.温度对微生物细胞生长的影响：温度对菌生长和生产的影响是各种因素综合表现的结果。从酶动力学来看，温度升高反应速率加大，生长代谢加快，生产期提前。但因酶本身很易因热而失去活性，温度越高，酶的失活也越快，表现在菌体易于衰老，发酵周期的缩短，影响产物的最终产量。 2.温度对产物形成的影响：活化能E的大小说明酶反应速率受温度大小影响而变化。

根据公式可测得青霉菌生长的活化能E＝34kJ／mol，呼吸的活化能E＝116kJ／mol；青霉素合成的活化能E＝112kJ／mol。从这些数据可见，青霉素合成速率对温度最为敏感。

3.温度影响发酵液的物理性质：温度除了直接影响发酵过程中各种反应速率外，还通过改变发酵液的物理性质，间接影响菌的生物合成。例如温度会影响基质和氧在发酵液中的溶氧和传递速率，菌对某些基质的分解吸收速度等。

4.温度影响生物合成的方向：温度还会影响生物合成的方向。例如，四环素发酵中金色链霉菌同时能产生金霉素。在低于30℃温度下，该菌种合成金霉素能力较强。当温度提高，合成四环索的比例也提高。在温度达35℃则只产生四环素而金霉素合成几乎停止。

2、如何控制发酵过程中的pH值？

（1）调节基础培养基的配方：调节碳氮比（C/N）；添加缓冲剂。 （2）补料控制：直接加酸加碱；补加碳源或氮源。 3、为何说溶氧可作为发酵异常情况的指示 ？ （1）发酵中污染好气性杂菌。

（2）中间补料是否得当可以从溶氧变化看出。

（3）操作故障或事故引起的发酵异常现象，也能从溶氧变化中得到反映。 4、发酵液中的溶氧如何控制 ？ 控制溶氧水平从氧的供需着手。 OTR=KLa (C*-CL)

OTR为单位体积发酵液氧的传递速率；kL为氧传质系数；a为比表面面积； kLa体积溶氧系数；c*为氧在水中的饱和度；

cL为发酵液中的溶氧浓度；kLa和c*提高的因素都能使供氧提高。 c*提高可采取下列办法：

（1）在通入的空气中掺入纯氧,使氧分压增高； （2）提高罐压；

（3）改变通气速率，其作用是增加液体中夹持气体体积的平均成分。 Kla反映了设备的供氧能力。

5、二氧化碳对发酵有何影响？如何控制？ CO2对发酵的影响：（1）对发酵促进；（2）对发酵抑制；（3）影响发酵液的酸碱平衡。

二氧化碳浓度的控制：提高通气量和搅拌速率，有利于CO2的排出。降低通气量和搅拌速率，有利于提高CO2在发酵液中浓度。补糖可降低发酵液中CO2的浓度，并降低培养液的pH值

6、泡沫给发酵带来的副作用主要表现在那些方面？ （1）降低了发酵罐的装料系数；

（2）增加了菌群的非均一性； （3）增加了污染杂菌的机会； （4）导致产物的损失；

（5）消沫剂的加入将给提取工序带来困难。 7、如何控制发酵中泡沫的产生？

泡沫控制的方法可归结为机械消沫和消沫剂消沫两大类。也有从微生物本身的特性着手，防止泡沫的形成，如选育或混养。

一种好的消沫剂最好能同时降低液膜的机械强度和降低液膜的表面粘度

第八章、发酵动力学

1、据动力学分型方法，可将分批发酵过程分为哪 三个类型？各有何特点？ （1）生长相关型：

特点：菌体生长、碳源利用和产物形成几乎都在相同的时间出现高峰，即表现出产物形成直接与碳源利用有关。产物直接来源于产能的初级代谢（自身繁殖所必需的代谢），菌体生长与产物形成不分开。 （2）生长部分相关型： 特点：在发酵的第一时期菌体迅速增长，而产物的形成很少或全无；在第二时期，产物以高速度形成，生长也可能出现第二高峰，碳源利用中这两个时期都很高。产物也来源于能量代谢所消耗的基质，但产物的形成在与初级代谢分开的次级代谢中，出现两个峰，菌体生长进入稳定期，出现产物形成高峰。 （3）生长不相关型：

特点：产物形成一般在菌体生长接近或达到最高生长时期，即稳定期。产物形成与碳源利用无准量关系，产量远远低于碳源的消耗量。产物是在基质消耗和菌体生长之后，菌体利用中间代谢反应来形成的，即产物的形成和初级代谢是分开的 2、何谓分批培养？可分为哪几个时期？各有何特点？

分批培养的定义：分批培养指的是一次投料，一次接种，一次收获的间歇培养方式。在这一过程中，除了氧气、消泡剂及控制pH的酸或碱外，不再加入任何其它物质。发酵过程中培养基成分减少，微生物得到繁殖。

发酵过程按进行过程有三种方式：分批发酵、补料分批发酵、连续发酵。

1.分批发酵的定义：分批培养指的是一次投料，一次接种，一次收获的间歇培养方式。在这一过程中，除了氧气、消泡剂及控制pH的酸或碱外，不再加入任何其它物质。发酵过程中培养基成分减少，微生物得到繁殖。

2.分批发酵的特点：微生物所处的环境在发酵过程中不断变化，其物理，化学和生物参数都随时间而变化，是一个不稳定的过程。 3.分批发酵的优缺点：

优点：操作简单；操作引起染菌的概率低;不会产生菌种老化和变异等问题。 缺点：非生产时间较长、设备利用率低。

根据产物形成与底物利用的关系，即碳源利用与产物形成速度的关系，把微生物（分批）发酵过程分成了三个类型。 （1）第一类型（生长相关型）：

特点：菌体生长、碳源利用和产物形成几乎都在相同的时间出现高峰，即表现出产物形成直接与碳源利用有关。产物直接来源于产能的初级代谢（自身繁殖所必需的代谢），菌体生长与产物形成不分开。又分为两种情况，即菌体生长类型和代谢产物类型。

所谓菌体生长类型指的是终产物就是菌体本身，菌体增加与碳源利用平行，且两

者有定量关系。例如酵母、蘑菇菌丝、苏云金杆菌。代谢产物类型指的是产物的积累与菌体增长相平行，并与碳源消耗有准量关系。如酒精、乳酸等。 （2）第二类型（生长部分相关型）：

特点：在发酵的第一时期菌体迅速增长，而产物的形成很少或全无；在第二时期，产物以高速度形成，生长也可能出现第二高峰，碳源利用中这两个时期都很高。产物也来源于能量代谢所消耗的基质，但产物的形成在与初级代谢分开的次级代谢中，出现两个峰，菌体生长进入稳定期，出现产物形成高峰。例如，柠檬酸和某些氨基酸的发酵。

（3）第三类型（生长不相关型）：

特点：产物形成一般在菌体生长接近或达到最高生长时期，即稳定期。产物形成与碳源利用无准量关系，产量远远低于碳源的消耗量。产物是在基质消耗和菌体生长之后，菌体利用中间代谢反应来形成的，即产物的形成和初级代谢是分开的。次级代谢产物如抗生素、维生素多属此类。 分批发酵的分类对实践的指导意义： 从上述分批发酵类型可以分析：

如果生产的产品是生长关联型（如菌体与初级代谢产物），则宜采用有利于细胞生长的培养条件，延长与产物合成有关的对数生长期； 如果产品是非生长关联型（如次级代谢产物），则宜缩短对数生长期，并迅速获得足够量的菌体细胞后延长稳定期，以提高产量。

分批培养动力学：细胞生长动力学、基质的消耗动力学、产物的生成动力学。 细胞生长动力学：

1.延滞期：刚接种后的一段时间内，几乎未见菌体浓度的增加，这过程一般称为延滞期或适应期。 2.对数期：在这一阶段中，由于培养基中的营养物质比较充足，有害代谢物很少，所以细胞的生长不受到限制，细胞浓度随培养时间指数增长，称为指数生长期，也称对数期。

3.减速期：细胞的比生长速率逐渐下降。从指数生长到生长稳定期有一过渡，称为减速期，

4.稳定期（静止期）：当细胞浓度达到最大值，生长速率下降到零时，便进入该期，这一时期菌体代谢十分活跃，许多次级代谢产物在此期合成。 5.衰亡期：细胞开始死亡，活细胞的浓度不断下降。 分批培养中基质的消耗动力学

如果限制性基质是碳源，消耗的碳源中一部分形成细胞，部分形成产物，一部分形成能量。

3、什么是补料分批发酵、连续发酵？各有何优缺 点？

补料分批发酵：又称半连续发酵或流加分批发酵，是指在分批发酵过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵方式。

优点：使发酵系统中维持很低的基质浓度；不会产生菌种老化和变异等问题。 缺点：存在一定的非生产时间；和分批发酵比，中途要流加新鲜培养基，增加了染菌的危险。

连续发酵：在培养过程中，连续的向发酵罐中加入培养基，同时以相同流速从发酵罐中排出含有产品的培养基，这种操作方式称为连续培养。 优点：（1）可以提高设利用率和单位时间的产量，节省发酵罐的非生产时间。

（2）发酵中各参数趋于衡值，便于自动控制。

（3）易于分期控制。可以中不同的罐中控制不同的条件。 缺点：（1）容易染菌：发酵周期长，杂菌污染机会多。

（2）容易引起菌种的变异，使生产能力下降：长时间的培养，也就是多次数的传代，培养条件的变化等。

5、连续培养中μ与D之间有何关系？

第九章、下游加工

1、微生物工程下游加工工程有何特点？

（1）培养液中所含欲提取的生物物质浓度很低，杂质含量却很高； （2）下游加工过程的代价昂贵，回收率不高；

（3）欲提取的生物物质通常很不稳定。遇热、极端pH、有机溶剂会引起失活或分解；

（4）发酵或培养都是分批操作、生物变异性大，各批发酵液不尽相同，这就要求下游加工有一定的弹性，特别是对染菌的批号，也要能处理。 2、微生物工程下游加工过程应遵循哪几条原则？ （1）是胞内产物还是胞外产物； （2）原料中产物和主要杂质浓；

（3）产物和主要杂质的物理化学特性及差异； （4）产品用途和质量标准； （5）产品的市场价格； （6）废液的处理方法等。

3、微生物工程下游加工过程分为几个阶段？ （1）培养液（发酵液）的预处理和固液分离； （2）（2）初步纯化（提取）； （3）（3）高度纯化（精制）； （4）（4）成品加工。

第十章、发酵液预处理

1.发酵液预处理的目的是什么？ 改变发酵液的物理性质，加快悬浮液中固形物沉降的速度；尽可能使产物转入便于以后处理的相中（多数是液相）；能够除去部分杂质。

2.在发酵液的预处理过程中，杂蛋白的去除方法主要有哪些？

等电点：蛋白质不带电荷，蛋白质凝聚。这种方法一般和其他方法共用，如调节pH的同时，加入有机酸盐或重金属盐等使蛋白质沉淀。 变性：

（1）加热，加热还能使液体粘度降低，加快过滤速度； （2）大幅度改变pH；

（3）加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。 利用吸附作用除去蛋白质： 4.发酵液的凝聚和絮凝：

3.何谓凝聚和絮凝？絮凝方法有何优缺点？

凝聚：是在中性盐作用下，由于双电层排斥电位的降低，而使胶体体系不稳定的现象。这种方法形成的颗粒较小，不能有效分离。

絮凝：是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝

团的过程，是一种以物理的集合为主的过程。

4.影响发酵液过滤的因素有哪些？如何提高过滤性能？

菌种、发酵条件、培养基的组成、未用完培养基的数量、消沫剂、发酵周期。 改善过滤性能的方法：等电点、蛋白质变性、吸附、凝聚和絮凝、加入助滤剂、添加填充凝固剂、酶解作用。

5.微生物细胞破碎的常用方法主要有哪些？ 机械方法：球磨机、高压匀浆器（法）、X-press法、超声波破碎。 非机械方法：酶解法、渗透压冲击、冻结和融化、干燥法、化学法。 6.如何测定细胞对破碎率？ 直接测定法： 间接测定法：（1）测定释放的蛋白质量或酶的活力；（2）测定导电率

第十六章、灭菌

1、常用的灭菌方法有哪些？

(1)化学药剂灭菌 一些化学药剂能与微生物发生反应而具有杀菌作用。

(2)射线灭菌 即利用紫外线、高能电磁波或放射性物质产生的高能粒子进行灭菌的方法。 (3)干热灭菌 常用的干热灭菌的条件为在160℃--180℃下保温1h。进行干热灭菌时，微生物主要是由于氧化作用而死亡。

(4)湿热灭菌 即利用饱和蒸汽进行灭菌。由于蒸汽有很强的穿透力，而且在冷凝时放出大量冷凝热，很容易使蛋白质凝固而杀灭各种微生物。 (5)过滤除菌 即利用过滤方法阻留微生物，达到除菌的目的。 2、如何选择培养基灭菌的温度？ 达到要求的无菌程度

尽量减少营养成分的破坏，在灭菌过 程中，培养基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引起的：培养基中不同营养成分间的相互作用；对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等 的分解。因此,必须选择既能达到灭菌目的，又能使培养基的破坏降至最低的工艺条件。一般情况下，培养基灭菌采用高温短时间的方法，以减少营养成分的破坏。

3.什么是分批灭菌和连续灭菌？试简述其过程，并比较其优缺点。 培养基的分批灭菌就是将配制好的培养基放在发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行灭菌的操作过程，也称实罐灭菌。 分批灭菌的过程包括升温、保温和冷却三个阶段，灭菌主要是在保温过程中实现的，在升温的后期和冷却的初期，培养基的温度很高，因而也有一定的灭菌作用。 培养基的连续灭菌就是将配制好的培养基在向发酵罐输送的同时加热、保温和冷却，进行灭菌。过程：预热、加热、保温、冷却。 优缺点比较： 连续灭菌的优缺点

优点：保留较多的营养质量、容易放大、较易自动控制、糖受蒸汽的影响较少、缩短灭菌周期、在某些情况下，可使发酵罐的腐蚀减少、发酵罐利用率高、蒸汽负荷均匀、

缺点：设备比较复杂，投资较大。 分批灭菌的优缺点：

优点：设备投资较少、染菌的危险性较小、人工操作较方便、对培养基中固体物质含量较多时更为适宜

缺点：灭菌过程中蒸汽用量变化大，造成锅炉负荷波动大，一般只限于中小型发酵装置。

4.影响灭菌的因素有哪些？

培养基成分对灭菌的影响；微生物细胞中水分对灭菌的影响。

附加一、染菌

发酵染菌的防止

一、种子带菌的原因及防止

1.带菌的原因：无菌室的无菌条件不符合要求、培养基灭菌不彻底、操作不当. 2.种子带菌的防止： 严格控制无菌室的污染；

对每一级种子进行严格的无菌检验； 种子培养基和器具严格灭菌。 二、空气带菌的防治

主要是完善空气净化系统、加强卫生管理、设计合理的空气预处理工艺、设计和安装合理的空气过滤器，防止过滤器失效。 三、操作失误导致的染菌防治

三、培养基或设备灭菌不彻底导致染菌的防治

四、发酵设备、管件的渗漏或卫生死角导致的染菌防治 引起噬菌体感染的原因： 设备的渗漏；

空气系统、培养基灭菌不彻底。 预防噬菌体感染的措施：

1.发酵罐的排气管要用汽封或引入药液槽中。

2.取样、洗罐或倒罐的带菌液体要处理后才允许排入下水道。 3.把好种子关，实现严格的无菌操作。 4.搞好生产场地的环境卫生。

判断发酵是否染菌应以无菌试验结果作为依据。 不同染菌时间对发酵的影响：

种子培养期染菌：菌体浓度低、培养基营养丰富。

发酵前期染菌：杂菌与生产菌争夺营养成分，干扰生产菌的繁殖和产物的形成。 发酵中期染菌：严重干扰生产菌的繁殖和产物的生成。 发酵后期染菌：如杂菌量不大，可继续发酵。如污染严重，可采取措施提前放罐。

附加二、发酵参数

1、发酵过程的参数分为哪几类？各举几个例子。 物理参数、化学参数、生物参数和间接参数。 物理参数:温度、压力、流量、转速、补料速度 化学参数:pH、溶氧和尾气组成 生物参数：

间接参数:好氧速率、二氧化碳释放率和呼吸商，出菌体浓度和基质消耗速率等。 2、什么是传感器？传感器的作用是什么？

传感器通常是指能够将非电量转换为电量的器件，它实质上是一种功能块。 作用：是感受被测量的变化，并直接从被测对象中提取检测信息，也即将来自外界的各种信号转换成电信号。

3、测定DO的氧电极需满足那些条件？其读数有那些表示方法？

（1）在长时间内能稳定工作；

（2）电极输出电流足够大并与DO成正比； （3）电极功能受液流影响小； （4）电极响应快速灵敏；

（5）测量时不易受培养基中温度的影响；

（6）电极必须能耐高温（不超过120℃）灭菌消毒； （7）电极应具有合理的结构和合适的外形。 电极的指示读数：

（1）百分饱和浓度表示法：这种方法是目前实际生产中最常用的方法。 （2）氧分压表示法。 （3）氧浓度表示法。

4、菌浓度的测定有那些方法？在使用浊度法测量菌的浓度时要注意那些问题？ （1）浊度法。

在设计使用中应注意如下几个问题：

1）传感器（流通式薄层比色杯）壁生长问题。2）气泡对浊度测量的影响。3）灭菌操作问题。 （2）荧光测量。

附加三、种子扩大培养

1、种子扩大培养的目的是什么？ 使发酵周期缩短，设备利用率提高。 2、何谓种子接种龄、接种量？

接种量是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。

接种龄是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。

3、为什么种子要逐级扩大培养？

得到纯而壮的培养物即获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物

菌种发酵有一般需要2-3代的复壮过程，因为保存时的条件往往和培养时的条件不相同，所以要活化,让菌种逐渐适应培养环境

逐级扩大培养也有利于在短时间内得到较多的培养物

4、影响种子质量的因素有哪些？

培养基、培养条件、培养时间和冷藏时间、接种量、接种龄。 5、保证种子质量有哪些措施？

种子质量的最终指标是考察其在发酵罐中所表现出来的生产能力。因此首先必须保证生产菌种的稳定性，其次是提供种子培养的适宜环境保证无杂菌侵入，以获得优良种子。