一种凡纳滨对虾的免疫增强剂[发明专利]

*CN102318786A*

(10)申请公布号 CN 102318786 A(43)申请公布日 2012.01.18

(12)发明专利申请

(21)申请号 201110334934.5(22)申请日 2011.10.29

(71)申请人中国海洋大学

地址266100 山东省青岛市崂山区松岭路

238号(72)发明人张文兵 白楠 徐玮 谷珉

麦康森(74)专利代理机构青岛海昊知识产权事务所有

限公司 37201

代理人崔清晨(51)Int.Cl.

A23K 1/18(2006.01)A23K 1/16(2006.01)

权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页

(54)发明名称

一种凡纳滨对虾的免疫增强剂(57)摘要

本发明涉及一种凡纳滨对虾的免疫增强剂，为羧甲基酵母多糖，其羧甲基取代度为0.348～0.356。该免疫增强剂是在碱性的反应体系下，添加氯乙酸钠与酵母多糖反应制备的。同时本发明还包括一种同羧甲基酵母多糖免疫增强剂配合使用的饵料。本发明的免疫增强剂在对虾饲料中使用，添加量仅为0.1％-0.2％，就能明显促进凡纳滨对虾的生长，显著提高凡纳滨对虾的免疫力和抗病力。其应用效果显著好于酵母多糖。同时，本发明的免疫增强剂配合申请人制备的凡纳滨对虾饵料来使用时，能够获得更好效果。

CN 102318786 ACN 102318786 ACN 102318788 A

权 利 要 求 书

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1.一种凡纳滨对虾的免疫增强剂，其特征在于，所述的免疫增强剂为羧甲基酵母多糖，其羧甲基取代度为0.348～0.356。

2.权利要求1所述的免疫增强剂的制备方法，是在碱性的反应体系下，添加氯乙酸钠与酵母多糖反应制备羧甲基酵母多糖。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的氯乙酸钠与酵母多糖的质量比为11∶25。

4.权利要求1所述的凡纳滨对虾免疫增强剂的应用，是添加在凡纳滨对虾饲料中，与饲料的质量比为1∶500～1000。

5.如权利要求4所述的免疫增强剂的应用，其特征在于所述的饲料的配方组分及其质量百分比为：鱼粉20～24％，虾壳粉4～8％，面粉34～39％，鱿鱼内脏粉4～8％，豆粕10～14％，花生粕8～12％，鱼油2.0～2.4％，大豆软磷脂0.8～1.4％，对虾用维生素矿物质预混料4～4.5％。

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说 明 书

一种凡纳滨对虾的免疫增强剂

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技术领域

本发明属于水产饲料免疫增强剂技术领域，具体涉及一种凡纳滨对虾的免疫增强剂，即可以提高凡纳滨对虾免疫力和抗病力的羧甲基酵母多糖。

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背景技术

养殖对虾疾病是一个世界性难题，其原因在于种质的退化和由于片面追求产量造成的养殖环境恶化。1996年至2010年间，世界范围内由于对虾疾病造成的损失达到27.5亿美元。免疫增强剂是指具有促进或诱发宿主防御反应，增强生物机体抗病能力的一类物质，主要作用于水生无脊椎动物的非特异性免疫系统，激活机体自身的免疫机能从而达到防御效果，增强其抗病力。与抗生素和疫苗相比，免疫增强剂具有安全、无残留、作用范围广和使用方便等优点。但是免疫增强剂在凡纳滨对虾养殖生产中效果不佳，主要表现在当疾病爆发时，使用免疫增强剂往往没有预期效果。酵母多糖是水产养殖中常用的免疫增强剂，但也存在对养殖对虾免疫力和抗病力提高不显著等缺点。因此，急需一种对凡纳滨对虾具有显著免疫效果的免疫增强剂。

[0002]

发明内容

[0003] 本发明的目的是提供一种提高凡纳滨对虾免疫力和抗病力的羧甲基酵母多糖，从而弥补现有技术的不足。

[0004] 本发明的凡纳滨对虾的免疫增强剂，为羧甲基酵母多糖，其羧甲基取代度为0.348～0.356。

[0005] 本发明免疫增强剂的制备方法，是在碱性的反应体系下，添加氯乙酸钠与酵母多糖反应制备羧甲基酵母多糖。

[0006] 上述制备方法中添加的氯乙酸钠与酵母多糖的质量比为11∶25。[0007] 本发明的免疫增强剂，添加在凡纳滨对虾饲料中，与饲料的质量比为1∶500～1000。

[0008] 上述的饲料配方优选为：鱼粉20～24％，虾壳粉4～8％，面粉34～39％，鱿鱼内脏粉4～8％，豆粕10～14％，花生粕8～12％，鱼油2.0～2.4％，大豆软磷脂0.8～1.4％，对虾用维生素矿物质预混料4～4.5％。[0009] 本发明的免疫增强剂在对虾饲料中使用，添加量仅为0.1％-0.2％，就能明显促进凡纳滨对虾的生长，显著提高凡纳滨对虾的免疫力和抗病力。其应用效果显著好于酵母多糖。同时，本发明的免疫增强剂配合申请人制备的凡纳滨对虾饵料来使用时，能够获得更好的效果。

[0010] 说明书附图[0011] 图1：本发明的羧甲基酵母多糖的结构式。具体实施方式

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说 明 书

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下面对本发明的免疫增强剂羧甲基酵母多糖进行详细描述[0013] 实施例1：不同取代度的羧甲基酵母多糖的制作[0014] 取6.2ml 30％的氢氧化钠溶液和62.5ml异丙醇，在10℃下将二者混匀，制成反应体系。向反应体系中慢慢加入5g酵母多糖，在10℃下反应1小时，反应期间不断搅拌，使反应得以充分进行。另取2.2克氯乙酸钠溶解于7ml去离子水中，将此7ml氯乙酸钠水溶液迅速加入上述反应体系中。将反应体系置于70℃下反应2小时，在此期间，不断搅拌，使反应得以充分进行。2小时后，用6mol/L盐酸溶液将反应体系pH调至7.0；最后将反应体系用去离子水透析72小时，得到不含有氯离子的羧甲基酵母多糖的溶液。将此溶液真空干燥，得到羧甲基酵母多糖A。

[0015] 为制作不同取代度的羧甲基酵母多糖，在反应中，增加氯乙酸钠的量，同时保持制备步骤和其它参数不变。氯乙酸的添加量，分别选取3.95g、7.15g和10.11g，制得羧甲基酵母多糖B、羧甲基酵母多糖C、羧甲基酵母多糖D。[0016] 实施例2：羧甲基酵母多糖取代度的测定[0017] 将1g羧甲基酵母多糖溶解于15ml丙酮中，充分混匀。向上述体系加入3ml6mol/L盐酸溶液，反应30分钟，在此期间内，不断搅拌，使之充分反应。将反应液过滤，以80％的甲醇洗涤滤渣，使滤渣呈中性。将滤渣在50℃下烘烤2小时，使其充分干燥。取0.5g滤渣，溶于20ml 0.2mol/L氢氧化钠溶液，并用蒸馏水定容到100ml。取25ml定容液，加入1滴酚酞试剂，以0.05M盐酸滴定至无色，记下所用体积V1。另取20ml 0.2mol/L氢氧化钠溶液，并用蒸馏水定容到100ml。取25ml定容液，加入1滴酚酞试剂，以0.05mol/L盐酸溶液滴定至无色，记下所用体积V2。取代度的计算如下：

[0018] 取代度＝162×(V2-V1)×0.05×4/(0.5-58×(V2-V1)×0.05×4)[0019] 经过测量和计算，羧甲基酵母多糖A的取代度为0.348-0.356。羧甲基酵母多糖B的取代度为0.446-0.453。羧甲基酵母多糖C的取代度为0.768-0.775。羧甲基酵母多糖D的取代度为0.941-0.947。[0020] 实施例3：酵母多糖和羧甲基酵母多糖溶解率的测定[0021] 取2g酵母多糖或羧甲基酵母多糖，加入到10ml去离子水中，振荡20分钟。20分钟后，将上述混合液于离心20分钟，取上清液，于100℃下烘干。称量干燥出的粉末，计M。[0022] 溶解率＝M/2×100％[0023] 经过测量和计算，羧甲基酵母多糖A的溶解率为33.76％。羧甲基酵母多糖B的溶解率为41.06％。羧甲基酵母多糖C的溶解率为62.69％。羧甲基酵母多糖D的溶解率为86.56％。酵母多糖的溶解率为4.07％。[0024] 实施例4：筛选适用于凡纳滨对虾的羧甲基酵母多糖

[0025] 以不添加免疫增强剂的凡纳滨对虾饲料作为对照组饲料。在对照组饲料中，分别加入0.1％酵母多糖和0.1％的羧甲基酵母多糖A、B、C、D，制成酵母多糖饲料和羧甲基酵母多糖饲料A、B、C、D。以这六种饲料作为实验饲料，进行养殖实验。[0026] 选用当年人工孵化的同一批凡纳滨对虾，体重约0.65g左右，作为实验用虾。经1周的驯养后，挑选出体格健壮、规格一致的凡纳滨对虾进行分组实验。共分为6组，分别投喂一种实验饲料。每组设3个平行，每个平行为1个250L的玻璃钢桶，放养30尾实验用凡纳滨对虾。实验过程中，每天换水一次，换水量为总体积的3/4，充气。在为期4周的养殖实

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说 明 书

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验中，海水的溶氧在7.8-8.2mg/L，pH 7.5-8.0，盐度30-32，温度27-31℃。每天投喂四次，分别在06:00、12:00、18:00、24:00，饱食投喂，每日清除残饵及排泄物。[0027] 实验开始和结束时对每个平行的凡纳滨对虾进行计数、称重，计算凡纳滨对虾的特定生长率。计算方法如下：

[0028] 特定生长率＝(LnWt-LnW0)×100/t

其中，W0和Wt分别为每个平行凡纳滨对虾初始体重和终末体重，t为实验天数。

[0030] 实验结束后，每个平行随机选取5尾虾，用于免疫力的测定。首先抽取凡纳滨对虾血液，与抗凝剂(27mmol/L柠檬酸钠、385mmol/L氯化钠、115mmol/L葡萄糖，pH调至7.5)按照体积比1∶9混匀。将5尾虾的抗凝血混合均匀，进行酚氧化酶和呼吸爆发的测定。[0031] (1)呼吸爆发的测定

[0032] 在96孔板中先加入50μl抗凝血液，离心，去除上清，然后每个孔加入100μl酵母多糖溶液，反应30min。加入200μl的0.2％的四唑氮蓝(NBT)溶液，反应30min。离心去掉上清液，向每个孔加入200μl 100％(体积百分浓度)甲醇，固定10min，再以70％(体积百分浓度)的甲醇水溶液洗2次，将96孔板自然风干。风干后，每孔加入120μl 2mol/l的氢氧化钾水溶液和140μl的二甲基亚砜(DMSO)，沉淀溶解后于室温下用酶标仪在630nm波长下读取吸光值。

[0033] (2)酚氧化酶活力的测定

[0034] 在96孔板中先加入50μl抗凝血上清液，加入200μl左旋多巴(L-DOPA)溶液。后于室温下用酶标仪在490nm波长下测定20min内吸光值的变化。

[0035] 采用患对虾白斑综合症而致死的凡纳滨对虾来检测本实验用的凡纳滨对虾的抗病力。取患对虾白斑综合症致死的凡纳滨对虾，去除虾头和外壳，将虾肉打碎、混匀。每个平行随机选取14尾凡纳滨对虾，用于抗病力的测定。按每尾凡纳滨对虾投喂0.1g病虾肉的剂量投喂，连续观察7天，计算凡纳滨对虾的累积死亡率。

[0036] 采用SPSS 13.0 for Windows软件对上述测定数据进行单因素方差分析。实验结果用平均值±标准差(mean±S.D.)表示。具体实验结果见表2。[0037] 表2：投喂酵母多糖和不同取代度的羧甲基酵母多糖对凡纳滨对虾生长、免疫力和抗病力的影响。结果以平均数±标准差表示，同一行数据标有不同字母，表示差异显著(P＜0.05)。

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实验结果表明：羧甲基酵母葡聚糖A的效果显著好于酵母多糖和其它取代度的羧

甲基酵母多糖。相比酵母多糖，一定取代度的羧甲基酵母多糖可以显著提高凡纳滨对虾的生长、免疫力和抗病力。而实验结果表明最适合凡纳滨对虾的取代度为0.348-0.356。

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说 明 书

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另外，根据凡纳滨对虾的生活习性专门配制了如下配方的饲料，其配方为鱼粉20-24％，虾壳粉4-8％，面粉34-39，鱿鱼内脏粉4-8％，豆粕10-14％，花生粕8-12％，鱼油2.0-2.4％，大豆软磷脂0.8-1.4％，对虾用维生素矿物质预混料4-4.5％。上述的各个组分可以选用市场上出售的商品，也可以按照水产饲料的教科书进行自己配制。例如对虾用维生素矿物质预混料可以选用中国公开专利CN 1875747中描述的预混料，本发明实施例中选用来自山东省青岛金海力水产科技有限公司生产的海维特对虾专用维生素矿物质预混料。将本发明的免疫增强剂羧甲基酵母多糖按质量百分比0.1％加入到配制的饲料中，与目前使用的、同样添加了质量百分比0.1％的羧甲基酵母多糖凡纳滨对虾饲料相比，本发明配制的饲料不但免疫力和抗病力有提高，而且凡纳滨对虾的生长率也有3～5％的提高。即本发明制备的免疫增强剂与配制的饵料表现出明显的配合作用。

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说 明 书 附 图

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图1

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