毒理学水生毒性试验设计

(1) 设计水生生物的急性毒性实验

(2) 如果测定含A物质的废水急性毒性,应该如何进行.

毒理学设计性实验

由于化合物A在生产和使用的过程中随着工业废水,农药径流流入水体,对水生生物的生长和繁殖有着潜在的危害.容易造成水质,土壤,植被的污染.如果人们不慎饮用或是食用含有残余化合物A的污染水体或鱼类,将严重威胁人体健康.因此,在水生生物急性毒性实验中,研究该类化合物A在水体中的毒性机理具有必要性. 鱼是水生生态系统的重要组成部分,是人类主要的食物来源,所以,鱼类的急性毒理资料是常用的评价有毒化学物质和工业废水对水生生物危害的资料.在我国鱼类毒性实验中经常使用的有白鲢(Hypophthalmichthysmolitrix,),金鱼(Gold fish)、鲤鱼Cyprinus carpio、鲫鱼Carassius auratus等。由于这些材料体型较大，饲养起来不是很方便，而且受到繁殖季节的限制难以常年获得。而斑马鱼是国际标准化组织(ISO)推荐的实验鱼种，其个体较小，性成熟期短，繁殖能力强，价格便宜。被广泛的应用于生命科学的研究，也是实验室标准毒理学检验最常用的实验动物。

1 实验方法与材料 1.1 实验材料

受试污染物：化合物A。 1.2 实验仪器

气相色谱-质谱联用，pH计(PHS-3B),溶解氧测定仪(JYD-1A)，水硬度计，温度计，电子分析天平,烧杯（25，50ml）、移液管（1，10ml）、量筒等。 1.3 实验用水

由于该化合物在水中的溶解度为10%，而在丙酮中的溶解度为100%，故采用丙酮作为助溶剂，丙酮助溶剂含量不超过0.1mg/L。再加入10%的吐温-80乳化剂配成母液，实验用水为经活性炭过滤后强制充氧48h以上的自来水，溶解氧>5.4mg/L,pH值为6.4-7.0，水温(22±2)℃。总硬度125~250mg/L(以CaCO3计)。自然光照，实验周期96h，实验方式采用静水式，96h之内不更换试液。 1.4 实验生物

受试斑马鱼购于上海市杨浦区花鸟虫鱼市场，体长为(30.00±0.75)mm，体重量为（0.20±0.01）g.行为活泼，反应灵敏，无畸形，逆水性强。鱼苗经w=5%食盐水消毒后进入实验室，用曝气48h的自然脱氮自来水在实验室经过驯养7~10d后方可实验，驯养期间死亡率应小于3%。实验前24h停止喂饲，实验期间不喂食，每天清除粪便及食物残渣,保证每天实验期间光照12h。 2 实验方法

先做预实验，以确定化合物A对斑马鱼24h100%致死的最低浓度和96h不引起死亡的最高浓度。实验在2L的烧杯中进行，设置间隔较大的浓度梯度，尽可能使LC50在设置的浓度范围内，每个浓度设平行。实验开始后每隔一段时间观察记录，整理24h、48h，72h，96h观察记录，需要统计各容器试验鱼的存活情况和行为特征，实验观察时发现死鱼需要及时捞出。 浓度/(mg/l) 0 1 4.5 5.0 7.0 10 死亡率/% 0 0 0 80 100 100

从预实验得到的无死亡浓度和100%死亡浓度之间，以实验配置好的母液以及稀释水，按照一定的间隔设置6个实验浓度组（4.5mg/L, 5.0mg/L, 5.5mg/L, 6.0mg/L, 6.5mg/L, 7.0mg/L）和一个空白对照组（曝气自来水）以及助溶剂（丙酮）对照组，每组设三个平行。每组10条斑马鱼，以96h为一个实验周期，采用静水流的方式，在24h，48h，72h，96h后分别观察斑马鱼存活状况，并记录溶解氧、pH、温度情况，鱼的死亡情况及行为变化等等，还要及时捞出死鱼。最终确定鱼死亡50%时受试物的浓度，半数致死浓度用24h-LC50、48h-LC50、72h-LC50、96h-LC50来表示，判断斑马鱼死亡需要用玻璃棒轻轻按压斑马鱼的尾部，如果没有反应即认为斑马鱼已经死亡。 24h 死 亡 率 X1 x2 x3 平浓度 均（mg/L） 值 48h x1 x2 x3 平均值 72h x1 x2 X3 平均值 96h x1 x2 x3 平均值 丙酮空白 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 根据化合物A对斑马鱼的致死数据计算出其平均死亡率，再转化为概率单位，求出概率单位与化合物A浓度对数的回归方程，计算出化合物A的LC50，具体结果见表3. 自来水空白 污染物 实验时间/h 相关系数 LC50（mg/L） 24 化合物A 48 72 96 根据鱼类毒性分级标准，LC50<1mg/l为剧毒，1~100mg/l为高毒；100~1000mg/L为中等毒性；1000~10000mg/L为低毒，>10000mg/L为微毒或无毒。再以此判断含

该化合物的废水的毒性.

关于含化合物A的废水毒性实验,实验设计废水浓度100％、50％、40％、20％、10％、5％和0(CK)7个处理，3次重复。每组废水中均放入10尾斑马鱼,实验周期为96h,开始暴露前,试验鱼逐条测量全长和体重,各组之间试验鱼的全长和体重均无显著性差异.采用自然光照,对照组和实验组同时进行试验,试验期间每24h更换一次试液.为防止饵料影响,试验期间不喂食.每两小时观察记录1次斑马鱼的生活作息;分别于4h,8h,12h,24h,48h,96h时统计斑马鱼的死亡率. 废水浓度 (%) 0 4h 8h 不同实验时间鱼的死亡率(%) 12h 24h 48h 96h 5 10 20 40 50 100 根据斑马鱼在各观察时间段的死亡率,计算出LC50, SC,MAC和Tua急性毒性特征参数。

（1） 半致死浓度（LC50）：采用概率单位-质量浓度直线回归计算。 （2） 安全浓度(SC):SC=0.1×各观察时段的半致死浓度。

（3） 毒性累积程度（MAC）:MAC=某观察时段的半致死浓度差值/最初观察点

与实验结束时的半致死浓度差值×100%。分析斑马鱼对含A废水的蓄积与降减动态。

（4） 急性毒性单位(Tua)=100%/LC50

总结：在上环境毒理学的时候，老师讲到，对于水生生物的毒性试验的一般程序：1，实验条件的准备。2，实验生物的选择与准备。3，稀释水。4，毒物准备。5，测试方法选择与测试重点的确定。6，实验浓度的选择与设计。7，指标观测。8，数据分析与统计。9，得出相应结论。综合比较来看，我还是紧紧围绕着这条主线走。当然此次设计试验，除了结合平时尹老师课堂上所讲的知识之外，本人也查阅了大量的相关毒性实验文献，其中还有向刘树深老师请教，与同学们的交流的过程，个人感觉是学到了很多课本以外的东西，也体会到了实验设计的难度。如同平常所做的实验，那些都是老师事前准备好实验步骤，我们只要依葫芦画瓢就行，自己思考的成分很少，在这种研究生模式的实验中，我觉得把实践和理论相结合起来就相当好，当然，这里面不可避免的存在一些问题，还希望尹老师能够不吝赐教。