LC_MS_MS法测定人血清中石杉碱甲的浓度及应用

・临床研究・

LC2MS/MS法测定人血清中石杉碱甲的浓度及应用

霍　强,李见春,高　署,蒋志文

1

1

2

1

(1蚌埠医学院药学系,安徽蚌埠233030;2合肥合源医药科技有限公司,合肥230088)

　　[摘要]　目的:建立人血清中石杉碱甲浓度的高效液相色谱2质谱(LC2MS/MS)测定方法,研究石杉碱甲在健康人体内的药动学行为,评价2种制剂的生物等效性。方法:乙酸乙酯提取,LC2MS/MS内标法分析,检测离子为m/z243.2→210.9,m/z229.9→212.9。20例健康志愿者交叉口服试验制剂或参比制剂石杉碱甲片剂200μg,血药浓度2时间数据经DAS2.0统计软件处理,计算主要药动学参数,并对2种制剂进行等效性评价。结果:石杉碱甲的线性范围为0.08～8ng・mL,石杉碱甲片试验制剂与参比制剂的主要药动学参-1

数分别是:Cmax为(2.596±0.914)和(2.675±0.848)ng・mL,Tmax为(1.125±0.329)和(1.113±0.358)h,

-1AUC0～72h为(31.275±6.889)和(30.476±7.051)ng・h・mL。结论:该方法操作简单、灵敏度高、专属性强;

-1

统计学分析结果显示2种制剂具有生物等效性。[关键词]　石杉碱甲;液质联用法;生物等效性[中图分类号]R969.11;R978.11　[文献标识码]A　[文章编号]1003-3734(2009)11-1016-05

DeterminationofhuperzineAinhumanserumbyLC2MS/MSand

itsapplicationtorelativebioavailability

HUOQiang,LIJian2chun,GAOShu,JIANGZhi2wen

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1

2

1

(1DepartmentofPharmacy,BengbuMedicalCollege,Bengbu233030,China;

2HefeiCon2sourceMedicineTechnologyCorp,Hefei230088,China)

[Abstract]　Objective:TodevelopaLC/MS/MSmethodfordeterminingtheconcentrationofhuperzineAinhumanserumandtoinvestigatethepharmacokineticsandbioequivalenceoftwotabletsinChinesehealthyvolun2teers.Methods:LC/MS/MSwasusedtodeterminetheconcentrationintheselected2reactionmonitoringmodelaf2terthesampleswereextractedwithethylacetate.Targetionswereatm/z243.2→210.9forhuperzineAandm/z229.9→212.9fortheinternalstandard.Twentyvolunteerswererandomlydividedintotwogroups(testandrefer2ence)inadoublecross2overdesign.PharmacokineticparameterswerecalculatedwithDAS2.0program.Results:Thecalibrationcurvewaslinearovertherangeof0.08～8ng・mL.Themainpharmacokineticparametersofhu2

-1

perzinetabletswereasfollows:Cmax(2.596±0.914)and(2.675±0.848)ng・mL,Tmax(1.125±0.329)and-1(1.113±0.358)h,AUC0～72h(31.275±6.889)and(30.476±7.051)ng・h・mL.Conclusion:Themethod

-1

wasconvenient,sensitiveandspecific.Thestatisticalanalysisshowedthatthetestandreferencepreparationwerebioequivalent.

[Keywords]　huperzine;LC2MS/MS;bioequivalence

[作者简介]　霍强,男,硕士,讲师,主要从事药物合成工艺和药动学

研究。联系电话:(0552)3175232,E2mail:huoqiang3@sohu.com。

[通讯作者]　蒋志文,男,博士,教授,主要从事生化药理和药动学研

　　石杉碱甲(huperzineA),化学名为(5R,9R,

11E)52氨基2112乙叉基25,6,9,102四氢272甲基25,92甲撑环辛并(6)吡啶22(1H)酮,是从中国石杉科石杉属蛇足杉(俗称千层塔)中分离得到的一种天然

究。联系电话:(0552)3175228,E2mail:zzwwjj51@yahoo.com.cn。

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新型石松类生物碱有效单体,是强效可逆的乙酰胆碱酯酶抑制剂,原用于治疗重症肌无力,现主要用于

[1]

治疗良性记忆障碍及老年性痴呆。石杉碱甲的日均给药剂量为300μg左右,因此其血药浓度较低检测的难度大。目前文献报道的方法有氘气标记纸层析法、高效液相色谱法、HPLC2UV2MS法和液2质联用。本实验根据其化学结构特征和参考

[2-7]

有关文献,选择了合适的内标,建立了简单、快速、专属性强、灵敏度高的LC2MS/MS测定法,较好地应用于石杉碱甲2种制剂的健康人体生物等效性研究。

[2-5]

材料与方法

1　药品与试剂

试验制剂:石杉碱甲片(山东鲁抗辰欣药业有限公司,批号:041011,规格:50μg/片);参比制剂:石杉碱甲片(河南竹林众生制药股份有限公司豫中制药厂,批号:060601,规格:50μg/片);石杉碱甲对照品(山东鲁抗辰欣药业有限公司,含量>9918%);盐酸可乐定对照品(内标,中国药品生物

图1　石杉碱甲和可乐定[M+H]的二级质谱图3　样本处理

+

制品检定所,批号:1007129905)。甲醇(Merck公

司,色谱纯);乙酸铵(DIMA公司,色谱纯);甲酸(DIMA公司,色谱纯);乙酸乙酯(广东汕头市西陇化工厂,分析纯);水为超纯水。2　仪器和LC2MS/MS条件

精密量取300μL血清样品,加入10μL内标溶

-1

液(可乐定,50ng・mL),涡旋30s,加入1mL乙酸

-1

乙酯,涡旋3min,14000r・min离心10min,提取有机层800μL,置于40℃水浴中N2下吹干,80μL流动相复溶,涡旋1min,14000r・min离心3min,10μL进样。4　血清标准曲线的建立

精密量取石杉碱甲标准溶液各10μL于7个空白离心管中,加入300μL空白血清,配制成石杉碱甲血药浓度为8,6,3,1,0.5,0.2和0.08ng・mL的样品,按“血清样品处理”项下操作,进样10μL,记录色谱图,以待测物浓度为纵坐标(Y),待测物与内标物的峰面积比值为横坐标(X),用加权法(W=

2[5]

1/X)进行回归计算。5　精密度与回收率的测定

-1

-1

美国Thermo公司FinniganTSQQuantumDis2

coveryMAX型LC2MS/MS联用仪,ESI离子源,Xcal2ibur1.4数据处理系统;XW80A微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂);XS105分析天平(梅特勒2

托利多仪器有限公司);TGL16H平衡离心机(珠海黑马医学仪器有限公司);DZG303A纯水机(台湾艾柯仪器厂)。

色谱条件:色谱柱为PhenomenexLunaCN柱(150mm×2.0mm,3μm,广州菲罗门科学仪器有限公司);流动相为甲醇2水(含0.2%乙酸铵,0.08%

-1

甲酸)(46∶54);流速为0.2mL・min;柱温为30℃。质谱条件:ESI离子源;电喷雾电压为4.9kV;毛细管温度为340℃;源内碰撞CID为1V;鞘

气流速为34;辅助气流速为2;正离子方式检测,扫描方式为选择反应监测(SRM),用于定量的离子分别为石杉碱甲m/z:母离子243.2,子离子210.9,碰撞能30V;内标可乐定m/z:母离子229.9,子离子212.9,碰撞能32V。质谱图见图1。扫描时间为0.5s。

以空白血清配制低、中、高(0.2,1和6ng・mL)3个不同浓度的石杉碱甲标准系列,每一浓度进行5样本分析,按“样本处理”项下操作,计算日内、日间变异系数,评价方法的精密度和准确度;同时以流动相代替空白血清,同样方法制备低、中、高(0.2,1和6

-1

ng・mL)3个不同浓度的石杉碱甲标准品,按“样本处理”项下同法操作,以样本与纯品中石杉碱甲和内标物的峰面积比值计算相对回收率。

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-1

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6　稳定性考察60,72h从静脉采血3mL置试管中,静置30min,3000r・min离心,取血清,在-20℃冰箱保存,用

-1

按“精密度与回收率的测定”项下配制低、高

-1

(0.2和6ng・mL)2个浓度血清样本各3份。1份按“血清样品处理”项下操作,分别与室温下放置0和10h测定血清中药物浓度,考察样品处理后在室温条件下放置的稳定性;1份放置-20℃冰箱,24h反复冻融3次,考察反复冻融对药物的影响;另1份在-20℃冰箱冷冻40d后,考察药物在冷冻时间下放置的稳定性。7　受试者选择

本研究方案经安徽省肿瘤医院国家药品临床研究基地医学伦理委员会批准。20例健康志愿者,体重(64.6±6.8)kg,年龄(21.2±1.1)岁,均无药物过敏史,无肝、肾疾病史,精神状态良好,全面体格检查均正常(其中包括肺部听诊、肝脾触诊、心电图、心率、血压、肝肾功能、血尿常规等),在被告知所有与药物有关可能的不良反应后,自愿签署知情同意书。受试者在受试前2周内未服过任何药物,从开始进入试验后直至试验结束,禁烟酒及任何饮料。8　试验设计

志愿者随机分成两组,每组10例,采用单剂量双周期随机交叉试验设计,2次试验间隔期为1周。受试者于实验日的前一天晚上开始禁食12h,第二天早晨7∶00空腹受试者分别口服试验制剂或参比制剂200μg,温开水200mL送服。受试者在给药前及给药后0.5,0.75,1,1.5,2,3,4,8,12,24,36,48,

于血药浓度检测。服药2h后自由进水,4h后统一进标准餐。临床医生及研究者随时观察受试者不良事件。受试者在服药后避免长时间静卧及剧烈活动。9　数据处理

根据所测石杉碱甲血药浓度2时间数据,采用DAS2.0药动学程序,计算石杉碱甲试验制剂和参比制剂的主要药动学参数(Cmax和Tmax用实测值,AUC采用梯形法进行计算),并进行方差分析、双单

α)置信区间分析,评价2种制剂侧t检验法和(122的平均生物等效性,并进行群体生物等效性检验。

结　　果1　方法的专属性石杉碱甲与内标可乐定在ESI离子化方式下,+

主要生成[M+H]分子离子峰,分别为m/z243.2

+

和m/z229.9,选择性对分子离子峰[M+H]进行产物离子扫描,见图1,石杉碱甲和内标可乐定生成的主要碎片离子分别为m/z210.9和m/z212.9,将两者作为定量分析时监测的产物离子。在选定的试验条件下,石杉碱甲和内标可乐定的保留时间分别为2.96min和3.35min左右,见图2。石杉碱甲和内标峰形良好,无杂质峰干扰测定,基质效应影响小(小于1%),具有很好的专属性。

图2　石杉碱甲方法学专属性图谱

2　标准曲线

3　精密度与回收率

-1

血清样品低、中、高(0.2,1和6ng・mL)3个浓度日内及日间变异均<15%。低,中,高3个浓度的相对回收率在63.67%～69.85%。结果见表1。

以石杉碱甲峰面积(Ai)与内标物峰面积(As)的

-1

比值(Ai/As)对浓度(X,ng・mL),用加权(W=

2[8]

1/X)进行回归得:Y=1.498X+0.045(r=0.9960,

-1

n=5)。最低定量浓度为0.08ng・mL(SN>10)。

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表1　石杉碱甲的精密度与相对回收率

加入浓度

/ng・mL-1

0.216

n=5,珋x±s

相对回收率测得值

69.8563.6763.70

RSD/%12.733.822.56

日内精密度

测得浓度/ng・mL-1

0.2030.9085.900

RSD/%9.764.502.30

日间精密度

测得浓度/ng・mL-1

0.1930.9635.926

RSD/%10.928.388.88

4　稳定性

血样处理后放置,石杉碱甲在室温10h下反复

冻融以及长期冷冻稳定性较好,石杉碱甲在不同条

件下的稳定性结果见表2。

ng・mL

冷冻40d

0.1716.219

1.166.89

-1

表2　石杉碱甲在不同条件下的稳定性

加入浓度

0.26

室温0h

0.1735.818

室温10h

0.1815.673

变化率/%

4.622.49

24h反复冻融3次

0.1975.756

变化率/%

13.8710.66

变化率/%

5　平均血药浓度2时间曲线

20例受试者2周期交叉口服试验制剂和参比

7　生物等效性评价石杉碱甲的Cmax,AUC0～72h,AUC0～∞数值经对数转换,方差分析结果表明:ln(AUC0～72h),ln

(AUC0～∞)和lnCmax在个体间有统计学意义;双向单侧t检验显示,各参数与等效性检验的低限及高限比较均合格(P<0.05),lnAUC0～72h90%置信区间为96.5%～110.0%,lnAUC0～∞90%置信区间为9612%～110.0%,在80%～125%范围内;lnCmax90%置信区间为88.8%～104.1%,在70%～143%

制剂石杉碱甲片各200μg后血药浓度2时间数据见图3。从图中可见2制剂的血药浓度随时间变化趋势相近。试验期间未见不良事件的发生。范围内;Tmax经非参数检验差异无统计学意义。ln(AUC0～72h),ln(AUC0～∞)和lnCmax群体等效性分析结果均合格。

图3　口服2种石杉碱甲制剂平均血药

浓度2时间曲线6　药动学参数

讨　　论

本研究由于采用多级离子选择性检测,减少了

血样中杂质对色谱峰的干扰,定量限达到0.08ng・

-1

mL,而血清样品用量仅为0.3mL,操作简便、快速、提取回收率高,重现性好。因此,该法可用于大样本量的石杉碱甲血药浓度的检测及其药动学和生物利用度的研究。

本试验药动学结果表明,石杉碱甲2种制剂在人体内的吸收、分布、排泄性质颇为相似,经统计学检验证明两者的药动学参数无统计学差异(P>0105)。

对制剂进行生物等效性评价,各国采用的主要是平均生物等效性(averagebioequivalence,ABE)评价方法,即将比较的2种制剂的生物利用度参数的平均值进行比较,而没有考虑到个体间生物利用度

(下转第1026页)

根据所测石杉碱甲血清浓度2时间数据,利用DAS2.0药动学程序计算主要药动学参数,结果见表3。

表3　口服2种石杉碱甲药制剂的

药动学参数n=5,珋x±s

参　　数　

Tmax/hCmax/ng・mL-1t1/2/h

试验石杉碱甲片

1.125±0.3292.596±0.91414.47±3.247

-1

参比石杉碱甲片

1.113±0.3582.675±0.84815.19±4.88930.48±7.05132.57±7.410

AUC0～72h/ng・h・mLAUC0～∞/ng・h・mL

F/%

31.28±6.88933.36±7.054

-1

104.40±18.63

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出类似人类的抑郁症状,如快感缺乏、兴趣丧失,自主活动减少,学习记忆能力下降等。本实验通过检测抑郁模型小鼠的自主活动和学习记忆能力,验证了慢性应激抑郁模型的复制成功。同时,通过对动物中枢神经递质含量的测定,发现抑郁小鼠中枢神经递质NE、52HT、DA的含量降低,支持经典的抑郁症发病的单胺类神经递质减少假说。

单胺类神经递质系统包括52HT系统、NE系统和DA系统,在抑郁症发病机制中起重要作用,临床证实抑郁症患者脑中NE、52HT、DA等的含量均比

[5]

正常人低。单胺类神经递质的核团主要位于脑干,但其纤维主要投射到脑皮质及边缘系统,其中包括与学习、记忆密切相关的脑区,参与调节人的情绪、食欲、睡眠、体温、疼痛、呕吐和内分泌功能,抑郁症患者的抑郁心境、厌食、失眠、性功能减退、内分泌失调及昼夜节律紊乱可能与神经递质功能失调有关。因此增加脑内单胺类神经递质的含量将对改善抑郁症有积极的意义。路优泰是一种临床证实对抑郁症有显著疗效的药物,它对脑细胞的52HT、NE、DA的再摄取均有明显的抑制作用,作为阳性对照药可以更有效的看出黄精皂苷对抑郁症的作用。本研究中抑郁小鼠表现出自主活动减少,学习记忆能力下降,脑内神经递质含量下降,而黄精皂

[7][6]

苷可明显增加慢性应激抑郁小鼠的自主活动,提高其学习记忆的能力,同时能增加抑郁小鼠脑内单胺类神经递质的含量,这有可能是黄精皂苷改善抑郁小鼠抑郁症状的机制之一。以上研究结果为黄精皂苷用于抑郁症的治疗提供了药理学基础。

[　参　考　文　献　]

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[5]　符旭东,平其能,高永良.高效液相色谱2质谱2质谱联用法测

的差异,当仿制药在个体内变异较大时,就不能保证

药物对每一个患者的安全性和有效性,此时应对2制剂进行群体等效性(populationbioequivalence,

[9]

PBE)的检验。本试验中试验制剂的相对生物利用度为(104.4±18.6)%,ln(AUC0～72h)经方差分析,个体间差异有统计学意义。Cmax和AUC0～72h经平均生物等效性检验后,再进行群体生物等效性检验,均通过检验;Tmax经非参数检验差异无统计学意义。充分说明2种制剂具有生物等效性。由于存在个体差异较大的现象,临床应用时应注意个体化给药。

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