・１０８・ 科技论坛 细胞培养技术及避免污染的方法 马艳南阎雪莹殷悦蔡丽杰 （黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨１５００４０） 摘要：细胞培养技术是医学研究过程中不可或缺的技术手段，也是分子生物学研究的主要方法手段。主要介绍细胞培养过程中的 几种基本技术方法，细胞培养过程中的常见污染的来源、起因，并阐述了避免污染的方法，为细胞培养操作者提供参考。 关键词：细胞培养技术；污染；无菌技术 Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｓ ｉｎｄｉｓｐｅｎｓａｂｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｍｏｄｅｍ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｉｔ ｉｓ ａｌｓｏ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｍｅａｎｓ．ｒｒｈｉｓ ｐａｐｅｒ ｍａｉｎｌｙ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｓ ｓｅｖｅｒａｌ ｂａｓｉｃ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ．ａｎｄ ｔｈｅ ｃａｕｓｅｓ ｏｆ ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ，ｅｘｐｏｕｎｄｓ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ａｖｏｉｄ ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ．Ｐｒｏｖｉｄｅ ｔｈｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍａｊｏｒｉｔｙ ｏｆ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｗｏｒｋｅｒｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ；Ａｓｅｐｔｉｃ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ １细胞培养技术 ①从液氮保存罐中取出冻存管后，须立即投入３７℃水浴中，用 １．１细胞的原代培养 镊子夹住冻存管快速摇晃，直至冻存液完全融化。②将细胞悬液移 原代培养是从供体获取组织后的首次培养。利用原代培养做各 入离心管中，缓慢加入４ｍｌ培养液，离心（１Ｏ００ｒ／ｍｉｎ，１０分钟）。③用 种实验，如药物测试、细胞分化及病毒学方面的试验效果很好。原代 培养液混悬沉淀细胞，调整细胞密度，将细胞接种于培养皿或培养 培养的基本程序如下：①处理组织，将组织洗涤，剪碎成１￣２ｍｍ大 瓶，放入培养箱中培养。待细胞贴壁后（或过夜），换培养液再次培 小组织块。②用分散剂消化分散组织块，如加比组织量大３Ｏ一５０倍 养。细胞长满后可进行传代培养。 的胰酶消化３０～６０分钟（冷｝肖化液过夜）。③过滤与洗涤：将消化的 ２污染的产生 组织块吹打混匀，用８０—２００目不锈钢筛网过滤，离心洗涤过滤的细 微生物无处不在。细菌可以几乎存在于任何表面，包括无生命 胞与细胞团。④根据细胞计数用培养基制备适当浓度卜 般为（０．５—２） 的物体和人体皮肤上。真菌孢子和少量营养菌丝可以通过空调管道 ＊１０ ／ｏｒｌｌ。⑤分装，在温度为３７ｃＣ，二氧化碳浓度为５％的二氧化碳 和打开的门进入到实验室。支原体感染最常来源于灭菌不彻底的培 培养箱中培养。⑥长成单层后可换维持液。施炜【１］等参照Ｓｉｎｇｈ悬浮 养液和血清。由于细胞培养初学者没有微生物学技术的训练而诱发 培养法（胰酶消化法），分离出人脑胶质瘤细胞，人脑胶质瘤细胞，经 感染的风险，到处都存在着微生物污染的可能性。成功的培养细胞， 过初次分离培养后活细胞比例大于９５％。惠敏 等运用组织块培养 最基础的就是要了解，一切和细胞接触的东西都必须是无菌切无污 法，成功获得人牙龈成纤维细胞，运用此法的培养成功率为 染的。这包括培养基，玻璃器皿，设备，以及细胞在转移过程中暴露 ８６．７％。 的环境也同样重要。 １．２细胞的传代培养 人体运行的一系列物理、生化反应，免疫防御排除微生物，避免 离体培养的细胞群体增殖达到一定密度时，细胞的饿生长和分 引起损坏和生命威胁的感染，让有益的东西停留在一些区域，例如 裂速度就会减慢甚至停止，如不及时分离传代培养，细胞将逐渐衰 粘膜上皮细胞，例如口腔和肠道和生殖道。体外细胞培养的单菌种 老死亡。传代培养是指细胞从一个培养瓶以１：２或其他比率转移， 环境与人体组织有很大不同。它的维持依赖于各种各样的物理凶 接种到另一个培养瓶即称为传代培养。一般步骤是：①吸弃旧培养 素、保护流程和化学品控制用来防止和抑制污染。要想保持无菌状 液，用ＰＢＳ缓冲液冲洗细胞２次。②加人０．２５％胰蛋白酶溶液进行 态，必须控制各种已知和未知来源的污染挑战。实验室中的操作人 消化，倒置于显微镜下观察，当细胞呈圆粒状时，去掉胰酶溶液，或 员可能是最大风险的污染源之一。从实验室工作人员脱落的皮肤鳞 直接加入适量新鲜含血清培养基，反复吹打瓶壁，使细胞脱离瓶壁， 片，持续地向环境中注入微生物以及人口腔中携带的大量的共生的 均匀悬浮于培养液中。将此培养液分装于新的培养瓶，按稀释比例 微生物甚至都会伴随着你的说话而成为潜在的污染源。此外，一个 加入新鲜培养液。待细胞贴壁后，给细胞更换新鲜培养液，之后隔日 已经被病毒或细菌感染的实验室操作人员个体或许会成为更危险 换液，见细胞增殖到一定密度时，重复上述操作。 的污染源。进入实验室的人员和各种通道（例如排水管，通风网栅， １．３细胞的冻存 天花板上未封Ｅｌ的洞）都必然持续地提供着新的污染，这些污染将 细胞冻存是细胞保存的重要方法。细胞冷存储存在一８００Ｃ冰箱 累积在实验室表面并且叠加在潮湿的区域（例如冰箱，水槽，恒温水 中可以保存一年之久，细胞储存在液氮中，温度达一１９６￣Ｃ，理论上 槽，潮湿培养箱等）。 储存时间是无限的，从增殖期到形成致密单层以前的细胞都可以用 试剂也是一个潜在的污染，当采购进行细胞培养的试剂和培养 于冻存。冻存细胞前，需配置细胞冻存液。冻存液的一般比例是７０％ 基，是否无菌或需要灭菌，这一点是很重要。有些试剂不是灭菌的， 培养液＋２０％ＦＢＳ＋Ｉ％甘油（或ＤＭＳＯ）。细胞冻存具体操作方法如 例如血清和生长因子，这些都很容易引起病毒污染，这些都取决于 下：①选择对数生长期的细胞，在冻存细胞前一天换一次培养液。② 生产方法和原材料的来源。通过收集信息的因素包括原产地叶肉组 吸弃旧培养液，加入细胞消化液，收集细胞悬液离心（１０００ｒ／ｍｉｎ，１０ 织和组织，地理起源，试剂处理的元素像减少污染，灭菌步骤的可靠 分钟）。悬浮生长细胞可直接离心。③去上清液，用冻存液重新混悬 性，最终试剂污染物的检测等都可以评估风险进而减少污染的叮能 细胞，凋整细胞密度为１０６～１０７个／ｍｌ。④按ｌ～１．５ｍｌ将细胞悬液 性。要特别注意未处理过的牛血清和猪胰蛋白酶，有些携带动物病 分装于冻存管内，拧紧冻存管盖。在冻存管上标明细胞名称、代数、 毒将会影响到细胞的培养。 培养液名称和冻存日期。⑤在４℃下将冻存管放置３０分钟。之后将 ３避免污染的方法 冻存管移入一２０℃下放置１小时⑥然后将冻存管立即移人一８０％超 姜彬 从培养的室内环境、细胞培养的试剂用品、无菌操作对 低温冰箱内，放置２４小时。也可将冻存管放入电子计算机程控降温 实验人员的要求这三个方面分别阐述的如何避免污染的策略。 仪内降温。⑦将冻存管放入液氮保存罐内，可长期保存。冻存液的配 Ｒｏｓａｌｉｅ Ｊ．Ｃｏｔ ６ 地介绍了一些细胞培养的无菌技术。综合他们的 制也有２０％ＤＭＳＯ＋８０％胎牛血清这种比例的，张颖丽１３］等采用此种 研究，以及查阅大量资料，避免污染的方法大概分为以下几个方面。 冻存液冻存牙髓成纤维细胞，复苏后细胞状态良好，可以达到８０％ ３．１操作者和环境 成活率。 １．４细胞的复苏 进行细胞培养的操作人员必须经过无菌技术的培训，进入实验 室之前要用消毒剂彻底清洗手和手臂，带一次性橡胶手套，穿灭菌 作者简介：马艳南，女，黑龙江中医药大学２０１２级药剂学在读硕士研究生 通讯作者简介：阎雪莹，女，教授，黑龙江中医药大学中医药研究院院长。 科技论坛 ・１０９・ 服和拖鞋，袖口需要系紧。实验开始前，需要将所用到的用具在无菌 菌台上，关盖前需要在酒精灯上灼烧瓶口几秒，防止污染试剂。不要 操作台照射３０分钟以灭菌。实验过程参照严格的无菌流程。接触培 再打开口的容器上方进行操作，移液管口在移液时不要碰到容器 养时每一个东西都必须是无菌的。这包括直接接触（例如用来转移 口，其他操作器械在使用前也需要在酒精灯上灼烧。 细胞的移液管）也包含非直接接触的（例如用于盛装无菌药物加入 细胞培养试剂主要是从试剂商那里购进，例如牛血清和培养 到无菌培养基中的瓶子和容器）。理想情况，所有的无菌工作都应在 基，药品等要考虑到是否灭菌，产地及生产批次，确保用品的无菌性 个层流的操作台中，然而，预备室也同样需要一个操作台。在开放 和安全性。有些试剂不是灭菌的，这些都很容易引起病毒污染，这些 的工作台上进行无菌工作，过火灭菌通常有很直接，局部的净化作 都取决于生产方法和原材料的来源。通过收集信息的因素包括原产 用。它可以最大限度的剔除那些存在于培养基瓶子，培养瓶，或者试 地组织，试剂处理的方法，灭菌步骤的可靠性，最终试剂污染物的检 管表面的污染，给例如医用钳子，接种环和针这样的小器具的灭菌。 测等都可以评估风险进而减少污染的可能性。要特别注意未处理过 细胞培养室的布局可以降低污染的风险，比如在远离过道的地方放 的牛血清和猪胰蛋白酶，有些动物病毒将会影响到细胞的培养。配 人细胞培养操作台，远离清洁区放置废物处理回收处，和无菌培养 制培养液和细胞清洗液、胰酶等的实验用水，要用三蒸水或者符合 基储存柜子，将任何可能存在污染的东西与清洁的细胞培养分开。 标准的灭菌水。 将平时的细胞与原代细胞隔离，以避免从动物体取组织时携带的污 参考文献 染物的污染。理想的实验室空气是要经过空气过滤器进来的空气， ［１】施炜，王中，陈娟等．人脑胶质瘤细胞的分离、培养、冻存与复苏『Ｊ１． 这样降低的微尘来避免污染，在空气清洁的环境中操作，才能有效 江苏医药，２０１０ ３６（１３）：１５４２． 降低污染的产生。此外，需要定期检测水槽及冰箱是否有污染，ＣＯ： 【２】惠敏．倪莹．郑静等．人牙龈成纤维细胞原代培养及冻存和复苏［Ｊ］． 钢瓶的压力，培养箱的温度、二氧化碳浓度、水盘是否有污染。 中国组织工程研究，２０１２，１６（４６）：８６２１—８６２２． ３．２细胞培养的用品和试剂 ［３】张颖丽，郭世梁，张影杰等．牙髓成纤维细胞传代培养与冻存复苏 次性用无菌塑料制品，例如试管，培养瓶，过滤器和移液管都 后生长情况比较『Ｊ１．口腔医学研究，２００９，２５（６）：７１４． 可以减少污染的产生。一定要确保这些无菌塑料制品一旦被拆开包 【４】姜彬，细胞培养技术简介及避免污染的策略ｆＪＩ．生物学通报，４３（３）， 装，必须分装，而不是都贮存在不的环境中。细胞培养的用品和 ５５．试剂要用７５％～８０％酒精喷擦过后才能拿进无菌台。操作实验时，注 ［５］Ｒｏｓａｌｉｅ Ｊ．Ｃｏｔ６．Ａｓｅｐｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ Ｃｅｌｌ Ｃｕｈｕｒｅ『Ｊ１．Ｃｕｒｒｅｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９８，１．３．１－１－３．１０． 意要在操作台操作，培养瓶和试剂瓶开盖后，盖口朝下放在无 一一（上接２４６页） 由图得最大应力为７５．６ ＭＰａ＜【ｏｒ］＝１４０ＭＰａ。满足要求 ４．３．３反力图（单位ｔ） 显示半跨结构。 由图得最大力为１１．Ｉｔ，以此进行钢柱的计算。 ４．４柱子验算 由图得最大应力为１５．１ ＭＰａ＜［盯］＝１４０ＭＰａ满足要求。 ４．５地基承载力验算 考虑３２工字钢自重的影响，传递的荷载按ｌ１．２ｔ计算。柱子选 用３２５ Ｘ ８ｍｍ螺旋钢管。斜撑选用１２６槽钢。 ４．４．１钢柱验算模型（ｔ—ｍ） 反力图（ｔ） 钢架的最大压力为１ １．１ｔ（１ １０ＫＮ），由于基础墩平面尺寸为１×ｌｍ，则 黝４．４．２应力图（ＭＰａ） 为Ｐ： Ｓ： １一 １＿１１。＝ｌ ｌ＇Ｊ… Ｉ（Ｐ × ａ 地质条件为中风化砂质页岩，承载力为４００—８００ ＫＰａ，满足要求。
