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响应面法优化恩拉霉素发酵培养基

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科技

分析与检测

响应面法优化恩拉霉素发酵培养基

□ 许铭玉　王小琴　冯疆涛　罗文伟　李　虎　邢雪岩　新疆阿克苏地区疾病预防控制中心

摘　要：本试验通过Box-Behnken Design中心组合试验对出发培养基X24进行优化，选取玉米粉、黄豆粉、硫酸铵、葡萄糖4个因素建立模型，对菌株TCCC 21101进行发酵测活并进行验证试验，最终得到优化后的培养基配方，即玉米粉7.88%、黄豆粉2.82%、硫酸铵0.4%、葡萄糖0.6%、硫酸亚铁0.01%、L-乳酸0.2%、碳酸钙0.5%、耐高温α-淀粉酶0.07%和豆油0.05%。该培养基发酵测活得出抑菌圈直径的大小约为19.35 mm，其效价约为4 147 U/g，对比工业发酵培养基，该培养基配制简单，成分廉价易得，较适合实验室研究用。

关键词：恩拉霉素；响应面；发酵培养基；抑菌圈；效价库县土壤中分离得到的一株杀真菌素B5477）发酵获得的次级代谢产物

[1-3]

恩拉霉素，是1966年自日本兵

。

链霉菌（Streptomyces fungicidicus No. 恩拉霉素对革兰氏阳性菌特别是有害梭状芽孢杆菌具有较强的抑制作用。回归方程来拟合因素与响应值之间的之间的关系，寻求最优工艺参数，解

[4]

20 min；丙酮浸提液A，参见文献[8]。

1.2　方法

1.2.1　枯草芽孢悬液的制备参见文献[8]。参见文献[8]。参见文献[8]。参见文献[8]。价计算

1.2.2　双层测活平皿的制备1.2.3　种子培养液的制备1.2.4　发酵液的制备

1.2.5　恩拉霉素含量的测定及效利用干燥滤纸片法

因素BDCA[8]

行恩拉霉素含量的测定及效价计算。试验

1.2.6　Design-X7响应面分析 1.2.6.1　玉米粉、黄豆粉、硫酸铵、采用中心组合一致精度的设计来

葡萄糖响应面分析试验Z1

响应面法（RSM）是采用多元二次模拟响应面模型，将玉米粉（A）、黄豆粉（B）、硫酸铵（C）和葡萄糖（D）作为自变量，经发酵后测活所形成的抑菌圈直径R作为响应值。本试验设计4因素3水平，共有29个试验点，其中包括5个重复试验，用以估计试验误差，具体因素与水平如表1所示。

0.0007.5%2%水平1.0009%3%函数关系，通过对函数响应面和等高线的分析，精确研究各因子与响应值决多变量问题的一种统计方法。该法不但试验次数少，周期短、精度高，对影响试验指标的各因子水平及其交到优化后的培养基。确定多因子系统的最佳条件

[5-7]

还可以建立连续变量曲面模型。利用互作用进行优化和评价，可快速有效

，即得

该法对恩拉霉素发酵培养基进行优化，

表1　响应面分析试验Z1的因素及水平

-1.0001%6%对发酵液进

名称黄豆粉葡萄糖硫酸铵玉米粉1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　试验菌株

21101；生物测定指示菌枯草芽孢杆菌CMCC（B）63501，以上两株菌均由应用微生物与酶工程实验室保藏。

1.1.2　主要试剂和仪器参见文献[8]。1.1.3　培养基和溶液

产恩拉霉素的杀真菌链霉菌TCCC

变量因素，按照方法1.2.3和1.2.4对菌株TCCC 21101进行摇瓶发酵发酵液进行效价测活，并将抑菌圈直径结果记录在相应的响应值处，为0-1。

实验，每种发酵培养基设3个平行试验，按照方法1.2.5对所得到的利用Box-Behnken Design-X7进行

1.2.6.2　Z1结果检验

按照表1中设计的试验水平及自0.4%0.2%0.5%0.3%0.6%0.4%2　结果

2.1　响应面分析试验

2.1.1　Z1实验结果分析

按照Box-Behnken Design中心组

合试验设计进行实验，并应用不同因素行发酵测活，最终得到的响应值R（抑菌圈直径）的大小，如表2所示。软件，对表2中的结果进行二次多影响可用以下二次多元回归方程表

水平下的培养基对菌株TCCC 21101进

利用Design Expert 7.0生物学

培养基，参见文献[8]；发酵培养基

GYT培养基，参见文献[8]；种子

分析，得到的最优组合培养基命名

对照培养基X24，与1.2.6.1中

X24：玉米粉8%，葡萄糖0.5%，黄

豆粉3%，硫酸铵0.4%，玉米浆粉2%，碳酸钙0.5%，豆油0.05%，耐高温α-抗生素检定培养基：25 g/L。以上培淀粉酶0.07%，灭菌前pH为7.0～7.2；养基灭菌条件均为湿灭法。121 ℃、

项回归拟合，试验因子对响应值的示：Y=18.50+0.54A+0.75B-0.10C+0.32D-方差分析见表3。

0.07CD-1.06A2-0.67B2+0.12C2-0.059D2。具体0.43AB+0.21AC+0.15AD+0.025BC+0.43BD+

Design-X7软件分析后得到的最优组试验。

合0-1进行摇瓶发酵对比，分别进行

验证性试验，每组3个平行，共3组

124 食品安全导刊 2021年2月

表2　中心组合实验设计与响应值变化

试验号1ABCD抑菌圈直径/mm15.342-1.0000.000-1.0000.0000.000340.00051.0000.0000.0000.00060.00071.000-1.0000.0000.0000.0000.0000.0000.000-1.000-1.0000.0000.00018.3518.5417.4817.48109-1.0000.0001.0000.000-1.0001.00011-1.0000.000-1.0000.0000.0001.0000.00018.561.0000.00017.971213-1.0000.0000.0000.0000.00016.2114150.000-1.0000.0001.0000.0001.00016.670.0000.00017.140.0000.00018.631617-1.0000.0000.0000.0000.0001.00017.160.00018190.0001.000-1.0000.0001.0000.00017.111.0000.00018.4719.2201.0000.000210.0000.000-1.0000.0001.00017.631.00019.07221.000230.000-1.0000.000-1.0000.000-1.0000.0001.00018.4418.4417.882425-1.0000.0001.000-1.0001.000-1.0000.0000.00017.080.00026270.0001.000280.0001.000-1.0000.0000.000-1.0000.0000.00016.9517.1816.77290.0000.0000.0000.0000.000-1.0000.00019.3317.641.0001.0001.000-1.0000.00018.5318.3619.15Feb. 2021 CHINA FOOD SAFETY 125Copyright©博看网 www.bookan.com.cn. All Rights Reserved.T

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方差来源A-玉米粉模型均方和23.263.486.72自由度1411表3　回归模型的方差分析

均方1.663.4837.97F值B-黄豆粉D-葡萄糖ABACC-硫酸铵BDCDB2D2C2A2BCAD1. 871.350.740.171.741.251.1311111116.7216.694.31＜0.000 1＜0.000 10.028 20.044 60.001 1Prob＞F显著性显著1.350.741.870.171.741.251.1332.255.996.0120.0943.554.420.833.550.042 80.080 50.039 10.763 60.378 70.018 00.0207.222.87111110.0207.222.8734.6713.780.440.113.32＜0.000 10.002 30.519 50.746 50.103 1不显著0.0910.0232.921.870.0910.0230.211.29失拟项残差144校正总和R2PredC.V./%R2R2Adj纯误差0.0430.951 80.900 20.963 11.6426.1810280.011表明该模型差异极显著，利用已求得的回归方程来描述响应面与各个因素之间的关系，发现自变量与全体自变量之间呈现出显著的线性关系，说明该方案可行。同时，A、B、C、D、于0.05，即说明这些因素对响应值及AB、AD、BC、A2及B2项的P值均小模型影响显著。失拟项为0.103 1＞0.05，表示差异不显著，则说明求得理的取值范围之内。综上，可利用该回归方程确定最佳的发酵培养基。

2.1.2　Z1实验两因素效应分析的回归方程拟合度较好，试验误差较小。预测R2的值为0.900 2，也在合

由表3可知，模型P＜0.000 1，

注：P＜0.01表示差异极显著，P＜0.05表示差异显著。

量对抑菌圈直径的影响

2.1.2.1　玉米粉和黄豆粉的添加取回归方程中的硫酸铵（C）和葡萄

即Y=18.50+0.54A+0.75B-0.43AB-得到玉米粉（A）和黄豆粉（B）对形成图1。

1.06A2-0.67B2。根据该子模型可以抑菌圈直径（R）影响的响应面图，即

糖（D）添加量为0%，可以得到因素A

和因素B对抑菌圈直径R的子模型，

然后对剩余因素的相互作用进行结构分析。

对回归方程的两个因素取零水平，

图1　玉米粉和黄豆粉的添加量对抑菌圈直径的影响

126 食品安全导刊 2021年2月

由图1可知，将硫酸铵（C）和葡

加量不变，抑菌圈直径随着黄豆粉的添加量增多而增大。量对抑菌圈直径的影响

2.1.2.2　玉米粉和葡萄糖的添加取回归方程中的黄豆粉（B）和硫酸

和因素D对抑菌圈直径R的子模型，得到玉米粉（A）和黄豆粉（B）对形成图2。

萄糖（D）的添加量分别固定在0.3%、0.5%时，当玉米粉添加量小于7.5%，米粉添加量大于7.5%，抑菌圈直径与抑菌圈直径与其添加量呈正比，当玉其添加量呈反比。若固定玉米粉的添

即Y=18.50+0.54A+0.32D+0.15AD-1.06A2-0.059D2。根据该子模型可以抑菌圈直径（R）影响的响应面图，即

铵（C）添加量为0%，可以得到因素A

铵（C）的添加量分别固定在2%、0.3%时，当玉米粉添加量小于7.5%，抑菌

由图2可知，将黄豆粉（B）和硫酸

图2　玉米粉和葡萄糖的添加量对抑菌圈直径的影响

加量不变，只改变葡萄糖的添加量，但这种变化的效果并不明显。量对抑菌圈直径的影响

虽反应体系会呈现出一定的变化趋势，

2.1.2.3　黄豆粉和硫酸铵的添加取回归方程中的玉米粉（A）和葡萄

糖（D）添加量为0%，可以得到因素B0.67B2+0.12C2。根据该子模型可以得

和因素C对抑菌圈直径R的子模型，到黄豆粉（B）和硫酸铵（C）对形成抑菌圈直径（R）影响的响应面图，即图3。

圈直径与其添加量呈正比，当玉米粉的添加量大于7.5%时，抑菌圈直径与其添加量呈反比。若固定玉米粉的添

即Y=18.50+0.75B-0.10C+0.025BC-

萄糖（D）的添加量分别固定在7.5%、0.5%，当黄豆粉添加量小于2.5%时，抑菌圈直径随黄豆粉添加量的增多而抑菌圈直径会随黄豆粉添加量的增多添加量不变，只改变硫酸铵添加量，但这种变化并不明显。

2.1.2.4　水平响应因素优化增大，而当黄豆粉添加量大于2.5%时，呈略微下降的趋势。若固定黄豆粉的虽反应体系会呈现出一定的变化趋势，

利用软件分析可知，发酵培养基的最

由图3可知，将玉米粉（A）、葡

图3　黄豆粉和硫酸铵的添加量对抑菌圈直径的影响

硫酸铵0.4%、葡萄糖0.6%、硫酸亚铁

0.01%、L-乳酸0.2%、碳酸钙0.5%、耐酵测活后，理论上将获得19.46 mm的抑菌圈直径，相应的效价约为4 205 U/g。

批次119.3919.3119.35219.3719.3419.380-1319.3319.3719.352.1.2.5　Z1验证实验

高温α-淀粉酶0.07%、豆油0.05%，将

此培养基命名为0-1。在该种培养基上发

基组合进行验证试验，即对优化发酵得到的抑菌圈直径大小如表4所示。

119.1319.1219.16219.1119.1619.15X24319.1519.1519.11平均值19.1319.1419.1419.14对通过响应面优化后的发酵培养

培养基0-1与出发培养基X24进行验

证性试验，每组3个平行，共3组试验，

表4　Z1验证试验结果

平均值19.3619.3419.3619.35佳组合为玉米粉7.88%、黄豆粉2.82%、

（问题）产品流入市场，及时消除危害的，应及时移送公安机关。各相关部门要及时掌握动向，加强协调配合，强化溯源追查，一旦出现代表性、群安办[4]。

3.3　加强食品安全意识宣导和培训

项目阴离子合成洗涤剂（以十二烷基苯磺酸钠计）镉（以Cd计）恩诺沙星（恩诺沙星与环丙沙星之和）大肠菌群脱氢乙酸及其钠盐（以脱氢乙酸计）表5　问题样品数在10批次以上的样品及样品类型

批次6217151212和控制风险。发现涉嫌食品安全犯罪

3.4　加大食品安全抽检信息公开力度

加大信息公开力度，严格按照相

涉及样品类型餐饮具水产品水产品餐饮食品粮食加工品年江苏省食品安全监督抽检情况分析及社会共治思路[J].现代食品,2020(14): 147-153.

[2]王西,傅晶依,孙赫.食品安全监督管理问题分析及其对策研究[J].福建茶叶,2019,41(12):227.

[3]刘欢.2019年四川省食品监督抽检情况分析[J].现代食品,2020(8): 153-155.

[4]姜毓君,庄柯瑾,张微,等.我国婴幼儿配方乳粉质量安全监管政策现状与趋势分析[J].食品科学技术学报,2017,35(5):1-6,24.

[5]周家伟.高职院校学生食品安全知识态度行为调查及防护措施应用研究[J].现代食品,2020(10):223-225.

作者简介：王敏红（1988—），女，汉族，江苏昆山人，本科，中级工程师。研究方向：基层食品安全监管。

关要求每周公布抽检信息。公布内容食安办每月组织汇总全市食品安全抽检情况，在主流媒体发布信息公告，监督，引导社会各界力量参与共治，发挥抽检监测工作的效力。参考文献

体性的隐患和问题要及时上报市食

不断提高食品生产者、经营者和

包括产品合格信息和不合格信息。市针对不合格情况进行风险解读，及时发布风险提示或消费提示，鼓励公众对企业违法违规行为形成威慑，充分

消费者的食品安全意识，多渠道多形式开展食品安全法律法规知识培训，增强食品生产者、经营者的食品安全主体责任意识，引导消费者增强自我保护和安全消费意识[5]。

[1]李清光,林少伟,刘霄霄,等.2019

（上接127页）

经优化后的培养基0-1发酵测活后，

由表4可知，菌株TCCC21101用

Shibata,et al. Enduracidin, a new antibiotic Streptomyces fungicidicus No.B-5477, an enduracidin producing organism[J].Journal Antibiot,1968,21(2):126-137.

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[8]许铭玉,宋淑婷,张莹.恩拉霉素生物检测方法的改进[J].中国畜牧兽医,2017,44(2):384-390.

作者简介：许铭玉（1991—），女，汉族，新疆阿克苏人，硕士，实验师。研究方向：微生物生化药学。

通信作者：邢雪岩（1991—），男，汉族，河南开封人，硕士，实验师。研究方向：微生物理化检验。

抑菌圈直径平均值为19.35 mm，其效价约为4 147 U/g，且数值较为稳定，与预测值相差1.3%，比出发培养基所获21101形成的抑菌圈直径的实际情况。效价高2.78%。由该结果可知，该模型

的建立能在一定程度上反映菌株TCCC

3　讨论

积累起到显著作用的四个因素，即玉米粉、黄豆粉、硫酸铵、葡萄糖进行Box-Behnken Design中心组合试验，建立分析模型，模型差异极显著，经优化后的培养基具有较高的恩拉霉素同时，对比工业发酵培养基，该培养基配制简单，成分廉价易得，较适合实验室中研究用。参考文献

选取培养基X24中对恩拉霉素

发酵水平，获得抑菌圈直径的大小约

为19.35 mm，其效价约为4 147 U/g。

[1] E Higashide,K Hatano,M

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