紫花苜蓿抗旱耐盐碱转基因抗性苗耐盐性研究

２００６年１Ｏ月　甘肃农业大学学报　第５期９１～９４　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＧＡＮＳＵ　ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　第４　１卷　双月刊　紫花苜蓿抗旱耐盐碱转基因抗性苗耐盐性研究　晏石娟，马晖玲，曹致中　（甘肃农业大学草业学院，甘肃兰州　７３００７０）　摘要：在紫花苜蓿抗旱、耐盐碱转基因抗性苗和对照苗的组织培养过程中模拟盐胁迫生境，经０　、０．３％、０．５　、　０．７％、０．９％、１．１　、１．３　、１．５　、１．７　、１．９　ＮａＣ１处理１５　ｄ后，苜蓿转化苗和苜蓿对照苗的盐适应性生长性能　发生变化．观察统计了转基因抗性苗和无菌苗在盐胁迫下的成活率；测定了这２组苜蓿植株的根长和叶片的电导率．结　果表明：转化苗比对照苗耐受盐胁迫的能力要高，转化苗能够耐受１．３　的ＮａＣ１盐浓度，在ＮａＣ１浓度为１．５　时其生　长才开始受到损伤．而对照苗只能在ＮａＣ１浓度０．５％以下正常生长，在ＮａＣ１浓度为０．７　时其生长即开始受到伤害．　同时，在盐胁迫下，转化苗的根生长能力要强于对照苗．在同一盐浓度下转化苗的细胞膜透性比对照苗的细胞膜透性要　低，表明苜蓿转基因抗性苗比对照苗耐受盐伤害的能力强．　关键词：紫花苜蓿；转基因；耐盐性　中图分类号：Ｓ　５４１　文献标识码：Ａ　文章编号：１００３—４３１５（２００６）０５—００９１－０４　Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｓａｌｔ—・ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ　ｏｆ　ａｌｆａｌｆａ　ＹＡＮ　Ｓｈｉ—ｊｕａｎ，ＭＡ　Ｈｕｉ—ｌｉｎｇ，ＣＡＯ　Ｚｈｉ—ｚｈｏｎｇ　（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｐｒａｔａｃｕｌｔｕｒｅ．Ｇａｎｓｕ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ　７３００７０，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｈａｂｉｔａｔ　ｗａｓ　ｓｉｍｕｌａｔｅｄ　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ　ｏｆ　ａｌｆａｌｆａ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓａｍｐｌｅ，ａｎｄ　ｇｒｏｗｉｎｇ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ａｎｄ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｒａｔｅｓ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｇｒｏｕｐｓ　ｏｆ　ａｌｆａｌｆａ　ｗｅｒｅ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ａｆｔｅｒ　１５　ｄａｖｓ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ＮａＣ１　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓａｌｉｎｉｔｙ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　０　，０．３　，０．５　，０．７％，０．９％，１．１　９，６，１．３　０，４，１．５　，１．７　９，６，１．９　９，６，ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｔｈｅｉｒ　ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ　ｏｆ　ｌｅａｆ　ａｎｄ　ｌｅｎｇｔｈ　ｏｆ　ｒｏｏｔ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｒ—　ｍｉｎｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔＳ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｓａｌｔ—ｔｏｌｅｒａｎｔ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔＳ　ｏｆ　ａｌｆａｌｆａ　ｗｅｒｅ　ｓｔｒｏｎｇｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓａｍｐｌｅ．ｔｈｅ　ｆｏｒｍｅｒ　ｃｏｕｌｄ　ｔｏｌｅｒａｔｅ　ｔｈｅ　ｓａｌｉｎｉｔｙ　ｏｆ　１．３　ＮａＣ１，ｔｈｅｉｒ　ｇｒｏｗｔｈ　ｂｅｇａｎ　ｔｏ　ｂｅ　ｄａｍａｇｅｄ　ａｔ　ｔｈｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　１．５　９／６　ＮａＣ１，ｂｕｔ　ｔｈｅ　ｌａｔｔｅｒ　ｃｏｕｌｄ　ｇｒｏｗ　ｎｏｒｍａｌｌｙ　ｏｎｌｙ　ｂｅｌｏｗ　ｔｈｅ　ｓａｌｉｎｉｔｙ　ｏｆ　０．　５　９，６　ＮａＣ１，ｔｈｅｉｒ　ｇｒｏｗｔｈ　ｂｅｇａｎ　ｔｏ　ｂｅ　ｄａｍａｇｅｄ　ａｔ　ｔｈｅ　ｓａｌｉｎｉｔｙ　ｏｆ　０．７　ＮａＣ１，ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ｔｈｅ　ｒｏｏｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ａ—　ｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔ　ｏｆ　ａｌｆａｌｆａ　ｗａｓ　ｓｔｒｏｎｇｅｒ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓａｍｐｌｅ　ｕｎｄｅｒ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ．Ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｐｌａｓｍａ　ｍｅｍｂｒａｎｃｅ　ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓａｍｐｌｅ　ｗａｓ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｗｈｉｃｈ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓ—　ｇｅｎｉｅ　ｐｌａｎｔ　ｏｆ　ａｌｆａｌｆａ　ａｔ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｓａｌｉｎｉｔｙ．Ｔｈｅ　ｆａｃｔｓ　ａｂｏｖｅ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔ　ｏｆ　ａｌｆａｌｆａ　ｈａｄ　ｍｕｃｈ　ｓｔｒｏｎｇｅｒ　ｓａｌｔ—ｔｏｌｅｒａｎｔ　ａｂｉｌｉｔｙ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄ：ａｌｆａｌｆａ；ｇｅｎｅ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ｓａｌｔ—ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　科学研究结果表明，来自细菌的果聚糖合成酶　作者简介　晏石娟（１９８３一），女，硕士研究生，从事牧草种质资源及　育种的研究．　基因（ＳａｃＢ）不仅能在植物中正确表达，使植物具有　合成和积累果聚糖的能力，而且合成果聚糖具有天　然果聚糖的渗透调节功能．在这一研究领域，被转化　的植物开始于烟草和马铃薯［１，２３．近阶段，胡赞民　资助基金　国家科技部“奶业重大关键技术研究与产业化技术集成　示范”项目子课题三：“优质饲草高效生产关键技术研究　与产业化开发”（Ｚ００２ＢＡ５１８Ａ０３）资助．　通讯作者；马晖玲，从事牧草育种研究．Ｅ—ｍａｉｌｔｍａｈｌ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．　ｃｎ　等嘲尝试向小麦中导入枯草杆菌果聚糖合成酶基　因，以增强其耐早性，但有关果聚糖合成酶基因在苜　收稿日期ｔ　２００５—１２—２２　维普资讯 http://www.cqvip.com

甘　肃　农　业　大　学　学　报　蓿中的报道，迄今为止国内外尚未见到．　马晖玲等　以紫花苜蓿不同品种为受体，通过　农杆菌介导法，用来自土壤枯草杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔ—　ｌｉｓ）的果聚糖合成酶基因对苜蓿进行了转化的研究．　本试验在上述工作的基础上，以紫花苜蓿转基因抗　性苗为材料，测定转化植株的耐盐生长适应性及电　导率，以验证果聚糖合成酶基因在苜蓿植株体内的　表达效率．　１　材料与方法　１．１　材料　紫花苜蓿（和田苜蓿）种子，由甘肃农业大学草　业学院曹致中教授提供．　苜蓿转果聚糖合成酶基因抗性苗，由甘肃农业　大学草业学院马晖玲老师提供．　１．２试验方法　１．２．１　无菌苗的培养［。　先用自来水冲洗种子　１０　ｍｉｎ，然后用纱布包裹种子，再用回形针夹好，以　防止小种子的丢失；再在７Ｏ　的酒精中浸泡５　ｍｉｎ，　转入１　升汞中浸泡５　ｍｉｎ，用无菌水洗涤１～５次，　每次３　ｍｉｎ，洗涤过程中不断搅动种子包，将种子表　面的升汞和酒精洗涤下来；把种子置于含有无激素　的ＭＳＥ　］培养基的罐头瓶中培养，培养温度为２５℃，　光照周期为光照１６　ｈ，黑暗８　ｈ．　１．２．２转化苗的继代培养　当转化苗生长到８～　１０　ｅｍ时，移入１／２ＭＳ培养基中．转移过程中应尽　量减少对根和叶片的损伤．每４～５周继代１次．　１．２．３　转化苗的盐胁迫处理　在３００　ｍＬ三角瓶　中倒入１００　ｍＬ的１／２　ＭＳ培养基，每瓶中按０　，　０．３　ｏＡ，０．５　，０．７　，０．９　，１．１　，１．３　，　１．５　９／６，１．７　９／６，１．９　浓度梯度加入ＮａＣ１，每一浓　度处理重复３次．把生长强壮的转化苗移植到三角　瓶中，封口后置于培养箱中培养，以未转化苗为对　照，对照苗处理与转化苗处理一样．　１．２．４　苜蓿转基因抗性苗叶片电导率的测定　］　选取苜蓿的功能叶片，一份放入水中作为对照，另一　份放入４Ｏ℃烘箱中使其萎蔫，作为处理．对照和处　理各取些许叶片，将叶片剪取１　ｃｍ的片段１２个，放　入试管内，用去离子水冲洗１次，然后加入ｌＯ　ｍＬ　去离子水．　将试管放入真空干燥器内，开动真空泵抽气　１０　ｍｉｎ，以抽出细胞间隙空气．缓慢放入空气，水即　渗入细胞间隙．取出试管，间隔几分钟振荡一次，在　室温下保持３０　ｍｉｎ．　将ＤＤＳ一１ｌＡ型电导仪电极插入试管，测定外　渗液的电导值．测定之后将试管放入沸水中５　ｍｉｎ　以杀死组织．待冷却至室温后，再次测定外渗液的电　导值．　通过电导值计算细胞膜相对透性，以细胞膜相　对透性大小表示细胞受害的程度．　细胞膜相对透性一Ｌ　／Ｌ２　Ｘ　１００　．式中，Ｌ　表　示１１－ｒ片杀死前外渗液的电导值；Ｌ。表示叶片杀死后　外渗液的电导值．　２　结果与分析　２．１　苜蓿转基因抗性苗在不同ＮａＣＩ浓度下的生　长适应性　苜蓿转化苗在０　～０．９　的ＮａＣ１浓度下生　长良好，从１．５　ＮａＣ１浓度开始，苗的成活率接近　于０，见图１．　图２显示，对照苗在ＮａＣ１浓度０　ｏＡ～Ｏ．５　处　理下生长良好，ＮａＣ１浓度为１．１　ｏＡ时成活率降　到０．　研究结果表明，抗性转化苗比对照苗耐盐胁迫　的能力要高，能够耐受１．３　ＯＡ的ＮａＣ１盐浓度，在　ＮａＣ１浓度１．５　９／６时生长开始受损；而对照只能在　ＮａＣ１浓度０．５　以下正常生长，在ＮａＣ１浓度　０．７　时生长开始受到伤害．这说明苜蓿转基因抗　性苗中ＳａｃＢ基因表达了功能，在细胞内积累了渗　透调节物质，以抵御盐胁迫．植物在盐胁迫下会合成　或积累一些平衡渗透溶质来调节细胞的渗透势　．　２．２盐胁迫对苜蓿转基因抗性苗生根的影响　试验结果显示，在盐胁迫下，苜蓿转化苗的根生　长率从ＮａＣ１浓度为１．１％时才逐渐下降；而对照　苗根生长率在ＮａＣ１浓度为０．５　时就开始下降．　３Ｏ株转化苗在ＮａＣ１浓度为０　时平均根长为　５．６　ｃｍ，在ＮａＣ１浓度为０．３　９／６时平均根长５．２　ｃｍ，　在ＮａＣ１浓度为０．５　，０．７　，０．９　ｏＡ时平均根长　均为４　ｃｍ；３０株对照苗在ＮａＣ１浓度为０　ｏＡ时平均　根长为３．２　ｃｍ，在盐浓度０．３　９／６时平均根长为３　ｃｍ　（表１）．　维普资讯 http://www.cqvip.com

第５期　晏石娟等：紫花苜蓿抗旱耐盐碱转基因抗性苗耐盐性研究　９３　圈溷墨圈■　圈圈圈国圈　图１不同ＮａＣＩ浓度对苜蓿转基因抗性苗生长的影响　Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｅ　ｐｌａｎｔｓ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓａｌｉｎｉｔｙ　注；Ａ－－Ｅ表示转化苗分别在ＮａＣＩ浓度０　，０．３　，０．５　，０．７　，０．９　时生长良好｝　羞嚣圈■　圈圈圈圈圈　图２不同ＮａＣ！浓度对苜蓿对照苗生长的影响　Ｆｉｇ．２　Ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｏｎｔｒｏｌ　ｓａｍｐｌｅ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓａｌｉｎｉｔｙ　注ｔＡｏ—Ｃｏ表示对照苗分别在ＮａＣｌ浓度０％，０．３　，０．５　时生长良好｝　Ｆ０一Ｊ。：对照苗分别在ＮａＣｌ浓度为１．１　。１．３　。１．５　。１．７　，１．９　时枯黄死亡．　表１在不同的ＮａＣＩ浓度下苜蓿的平均根长　Ｔａｂ．１　Ｔｈｅ　ａｖｅｒａｇｅ　ｒｏｏｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｇｒｏｕｐｓ　ｏｆ　ａｌｆａｌｆａ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓａｌｉｎｉｔｙ　平均电导率，计算出其平均细胞膜相对透性（表２）．　于卓［。］对盐胁迫下苜蓿细胞膜透性的测试表明：苜　蓿的膜透性随盐浓度的增加而增加，膜透性增加多　的苜蓿品种其细胞膜的破坏程度也就越严重，故耐　盐能力也较弱．　０．９　不同ＮａＣ１浓度下苜蓿的平均根长／ｅｒａ　０　０．３％０．５％０．７　转化苗　对照苗　５．６　３．２　５．２　３　４　２．８　４　０　４　０　从表２可以看出，苜蓿转基因抗性苗的细胞膜　相对透性比苜蓿对照苗要低一些。植物组织在受到　各种不利环境条件（如干旱，盐碱）的危害时，细胞膜　以上结果表明，在盐胁迫下，转基因抗性苗的根　生长适应性要强于对照苗．　２．３苜蓿转基因抗性苗电导率与耐盐性的关系　通过测定３Ｏ株苜蓿转基因抗性苗和对照苗的　的结构和功能首先受到伤害，细胞膜透性增大［１　．　本研究结果显示，转化苗的细胞膜相对透性要比同　维普资讯 http://www.cqvip.com

９４　甘　肃　农　业　大　学　学　报　ｃｏ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１９９４，（１２）：２７２～２７５　２００６芷　浓度下对照苗的细胞膜相对透性低，说明转化苗的　细胞受害程度要小于对照苗，苜蓿转基因抗性苗细　胞膜透性受害后的修复机制和能力要强一些．从以　［２］Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｍｅｅｒ　Ｉ　Ｍ，Ｅｂｓｋａｍｐ　Ｍ　Ｊ　Ｍ．Ｖｉｓｓｅｒ　Ｒ　Ｇ　Ｆ．ｅｔ　ａ１．Ｆｒｕｃｔａｎ　ａｓ　ａ　ｎｅｗ　ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　ｓｉｎｋ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　上结果可以判定，果聚糖合成酶基因（ＳａｃＢ）在苜蓿　植株体内已得到表达．　表２盐胁迫下２组苜蓿苗的电导率和细胞膜相对透性　ｐｏｔａｔｏ　ｐｌａｎｔｓＤ］．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ，１９９４．（６）：５６１￣５７０　［３］胡赞民，刘伟华．枯草杆菌果聚糖蔗糖酶基因转化小麦　的研究口］．中国农业科学．２００６，（２）：２３１￣２３６　［４］马晖玲．紫花苜蓿抗旱耐盐碱转基因植株选育的研究　Ｔａｂ．２　Ｔｈｅ　ａｖｅｒａｇｅ　ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ　ｏｆ　ｌｅａｆ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｅｌ１　ｐｌａｓｍａ　ｍｅｍｂｒａｎｃｅ　ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｔＷＯ　ｇｒｏｕｐｓ　ｏｆ　ａｌｆａｌｆａ　ｕｎｄｅｒ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ　注；Ｃ１表示对照苜蓿叶片杀死前外渗液的电导率；Ｃａ表示对照　苜蓿叶片杀死后外渗液的电导率・Ｔｉ表示转基因苜蓿叶片杀死前外　渗液的电导率・Ｔｚ表示转基因苜蓿叶片杀死后外渗液的电导率．　参考文献　［１］Ｅｂｓｋａｍｐ　Ｍ　Ｊ　Ｍ，ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｍｅｅｒ　Ｉ　Ｍ，Ｓｐｒｏｎｋ　Ｂ　Ａ，ｅｔ　ａ１．　Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ　Ｏｆ　ｆｒｕｃｔｏｓｅ　ｐｏｌｙｍｅｒｓ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｔｏｂａｃ－　［Ｄ］．兰州：甘肃农业大学，２００４　［５］马晖玲，卢欣石，曹致中，等．紫花苜蓿不同栽培品种植　株再生的研究［Ｊ］．草业学报，２００４，１３（６）：９９～１０５　［６］　Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　Ｔ，Ｓｋｏｏｇ　Ｆ．Ａ　ｒｅｖｉｓｅｄ　ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　ｒａｐｉｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｂｉｏａｓｓａｙｓ　ｗｉｔｈ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｃｕｌｔｕｒｅｓＤ］．Ｐｈｓｉｏ—　ｌｏｇｉａ　Ｐｌａｎｔａｒｕｍ。１９６２。（１５）：４７３～４７９　［７］谈常，杨惠东．余叔文．植物细胞（质膜）差别透性的　测定［Ａ］．植物生理学实验手册［Ｍ］．上海ｔ上海科学　技术出版社，１９８５：６７～７Ｏ　［８］沈艳，谢应忠．牧草抗旱性和耐盐性研究进展［Ｊ］．宁　夏大学学报（农业科学版），２００４，（１）：６５￣６９　［９］　于卓．苜蓿品种间种子萌发及苗期耐盐性差异的研　究［Ｊ］．干旱区资源与环境，１９９３，７（２）；１０６～１１１　［１Ｏ］张德罡＋盐胁迫对五个早熟禾草坪草品种苗期细胞膜　伤害性的研究［Ｊ］．甘肃农业大学学报，１９９８，３３（１）：　３８～４１　［１１］杨秀玲，郁继华．李雅佳，等，ＮａＣｌ胁迫对黄瓜种子萌　发及幼苗生长的影响［Ｊ］．甘肃农业大学学报，２００４，　３９（１）：６～９