直投式乳酸菌发酵剂的应用与发展前景

徐丹丹

浙江万里学院 食品科学091 2009016443

摘要：活性直投式乳酸菌发酵剂是指为生产发酵食品而制备的一种活性干燥乳酸菌，并将其浓缩为体积微小、含菌量高、活力较强的冻干培养物。本文综述了直投式乳酸菌发酵剂在酸奶加工、泡菜加工、橄榄菜加工中的应用，同时关于一种新型发酵剂—浓缩型直投式乳酸发酵剂的探讨。 关键词：乳酸；发酵剂；直投式乳酸菌发酵剂；酸奶；泡菜；橄榄菜

乳酸菌是益于人体健康的益生菌，主要存在于人体肠道，当达到一定数量时，它能改善或调节肠道微生物菌群的平衡，乳酸菌的代谢产物能降低肠道内的p H值，抑制肠道中的腐败菌生长和减弱腐败菌在肠道的产毒作用，并有助于帮助消化、防止便秘，防止细胞老化，增强机体免疫力，降低胆固醇水平，缓解乳糖不耐症及抑制肿瘤细胞的形成等[1]。

在食品向天然型、功能型发展的今天，乳酸菌制品正越来越受到人们的重视, 这就对乳酸菌发酵剂的品质、种类提出新的要求。目前，传统的乳酸菌发酵剂由于存在种种弊端逐渐被遗弃，取而代之的将是一次性直投式粉末发酵剂。此类发酵剂具有活力高、体积小、携带使用方便的特点，不仅可以直接用于生产发酵乳制品，也可以作为食品添加剂使用或直接食用 ，省去扩大培养的复杂操作过程，从而简化产品生产工艺，有利于保持产品质量的稳定，防止菌种的退化和污染。

1. 直投式酸奶发酵剂

近年来, 人们对发酵乳制品有了越来越多的认识, 酸奶产量正以平均每年25%的速度增长,这对酸奶发酵剂的品质、特性、种类提出了新的要求。目前我国酸奶发酵剂的制备大都是多次传代, 在多次传代过程中极易发生菌种污染和退化, 而且菌种活力不易掌握, 造成产品质量不稳定, 生产效率低, 阻碍了酸奶产业的发展。而国外广泛采用的直投式发酵剂则可避免以上现象的发生, 直投式发酵剂活菌含量高、活力强、使用方便快捷, 必然要成为酸奶生产的最佳选择[2]。因此, 发酵剂的产业化生产将成为必然趋势, 具有不可估量的前景。

酸奶是新鲜牛奶经酸奶发酵剂发酵而成的乳制品。酸奶发酵剂是制作酸奶所用的特定的微生物培养材料。发酵剂在酸奶生产过程中的作用非常重要，发酵剂是酸奶产品产酸和产香的基础和主要原因。酸奶质量的好坏主要取决于酸奶发酵剂的品质类型及活力[1]。

1.1 酸奶发酵剂的种类

酸奶发酵剂按照物理形态的不同可分为液体酸奶发酵剂、冷冻酸奶发酵剂和直投式酸奶

发酵剂这3种。液体酸奶发酵剂比较便宜，但是菌种活力经常发生改变，存放过程中易染杂菌，保藏时间也较短，长距离运输菌种活力降低很快；冷冻酸奶发酵剂乃经深度冷冻而成，其价格也比直投式酸奶发酵剂便宜，菌种活力较高，活化时间也较短，但是其运输和贮藏过程中都需要-45~-55℃左右的特殊环境条件；而直投式酸奶发酵剂不仅可以直接投入到发酵罐中生产酸奶，而且贮藏在普通冰箱中即可，运输成本和贮藏成本都很低，其使用过程中的方便性、低成本性和品质稳定性特别突出[3]。

1.2 直投式酸奶发酵剂的定义

直投式酸奶发酵剂(Directed Vat Set, DVS)是指一系列高度浓缩和标准化的冷冻干燥发酵剂菌种，可直接加入到热处理的原料乳中进行发酵，而无需对其进行活化、扩培等其它预处理工作。直投式酸奶发酵剂的活菌数一般为1010 - 1012 CFU/g。由于直投式酸奶发酵剂的活力强、类型多，酸奶厂家可以根据需要任意选择，从而丰富了酸奶产品的品种，同时省去了菌种车间，减少了工作人员、投资和空间，简化了生产工艺[4]。直投式酸奶发酵剂不需扩大培养，可直接使用，便于管理。直投式酸奶发酵剂的生产和应用可以使发酵剂生产专业化、社会化、规范化、统一化，从而使酸奶生产标准化，提高酸奶质量，保障了消费者的利益和健康。

1.3 直投式酸奶发酵剂的制备

从商品酸奶或自然发酵食品中分离出保加利亚杆菌和嗜热链球菌；将保加利亚杆菌和嗜热链球菌以初菌数1∶1的比例混合，接种在特定增菌培养液液中进行发酵培养，并滴加10-20％的氢氧化钠溶液控制增菌过程的pH值保持在5.8-6.1，在41.5℃～43℃的温度下发酵培养4-5小时；对发酵液进行离心处理，得到离心沉淀物，在无菌条件下与菌体冻干保护剂均匀混合后进行冻干前预冷处理6-12小时；最后真空冷冻干燥，并采用充氮包装制成产品。采用本发明的方法制成的产品按0.003-0.005％的量接种到杀菌后的脱脂乳或鲜牛奶中，经3.5小时发酵，乳凝固并产酸70°T，并且组织状态、风味良好，可以作为优质的直投式发酵剂[5]。

1.4 酸奶生产用直投式乳酸菌发酵剂研究

对酸奶常用发酵剂菌种德氏乳杆菌保加利亚乳杆菌亚种S-1、嗜热链球菌G1208的高密度细胞培养条件, 低温真空冷冻干燥中抗冷冻保护剂的选择等进行了研究。结果发现, 德氏乳杆菌保加利亚乳杆菌亚种S-1 在改良MRS培养基中的最佳培养条件为: 培养温度43℃,起始pH 值6.0, 最高活菌数为1.2×109cfu/m L; 采用3% 蔗糖+ 3% 海藻糖+ 10% β-环糊精+ 10% 甘油+ 1% 酵母膏+ 10% 脱脂奶作为冻干保护剂,经低温冷冻干燥后, 存活率40.8% 。

嗜热链球菌G1208的最佳培养条件为: 培养温度37℃, 起始pH 值7.0, 对培养基配方进行优化后,最高活菌数为1.7×109cfu/m L; 采用3% 海藻糖+ 1% 酵母膏+ 10% 脱脂奶作为保护剂经低温冷冻干燥后, 存活率可达96% [6]。

2. 直投式乳酸菌发酵剂在泡菜制作中的应用

乳酸菌利用可发酵性糖，产生乳酸，乳酸本身酸味柔和。乳酸菌除主要产生乳酸外，还可生成醋酸、丙酸等有机酸，它们在赋予食品以酸味的同时还可与乳酸发酵中产生的醇、醛、酮等物质相互作用，形成多种新的香味物质。由于乳酸菌的产酸、生香、脱异味作用，使乳酸发酵食品具有其独特的风味，四川泡菜为其典型代表。在泡菜的发酵过程中存在多种乳酸菌的作用，乳酸发酵贯穿于整个发酵泡制过程。利用泡菜中含菌量极高的植物乳杆菌、短乳杆菌等的相互协调作用，在特殊的环境中发生复杂的生物化学变化，赋予泡菜特殊的风味。和自然发酵相比，使用冻干乳酸菌发酵剂可以稳定产品质量，缩短生产周期，通过添加二种或多种乳酸菌制成的发酵剂，在一定条件下发酵，既赋予泡菜特有的风味，又缩短了发酵时间[7]。

泡菜是我国蔬菜加工的传统食品，深受广大消费者的喜爱。但长期以来，由于依靠自然发酵生产泡菜，其生产规模和质量受到极大的限制。所以研究出直投式发酵剂至关重要。

直投式发酵剂具有以下优点：菌种保存和管理简单，固体直投式发酵剂菌种活力高、体积小，在4℃保藏可达数月乃至更长，使用方便，不需要中间扩大培养环节，可直接用于生产；产品能够保持稳定的品质，避免中间扩大培养等环节；简化了生产工艺，缩短了生产周期，可以使发酵时间缩短至自然发酵的1/2～1/3，降低了成本。

2.1泡菜直投式发酵影响因素 1)

通过乳酸产量及pH 值测定，选取了菌株A 和菌株D两株菌作为泡菜发酵菌种。当两菌混合培养时表现了良好的发酵特性，产酸量明显高于单菌株发酵。且当双菌配比为1:1 时，其产酸量和活菌数均高于其它组合。

2)

经正交试验，确定了乳酸菌高密度培养的最佳配方为：2 % 葡萄糖、1 % 蛋白胨、5 % 番茄汁、0 . 2 % 磷酸盐，0 . 1 % 吐温80 。

3)

研究表明，离心条件对菌体收获影响大。当在4000r/min 转速下离心30min 的离心效果较好。

4)

冷冻是造成细胞损伤的主要原因，干燥过程中造成的损伤率较小，通过真空冷冻干燥，得到每g 含活菌数为3.4 × 1011 个的高活力的乳酸菌粉末状冻干发

酵剂。冷冻保护剂在冷冻过程中对菌体造成的损伤有一定的保护作用，在所试验的四种保护剂中，甘油的保护作用最好，但吸湿性强，选择1 0 % 的脱脂牛乳和血清蛋白保护剂。

5)

发酵剂在保存期间活菌数呈下降趋势。真空包装条件下活菌数明显高于常压包装，－ 18℃和4℃保存效果优于常温，－ 18℃的保存条件效果略优于4℃，但二者差异不显著。从生产应用考虑，发酵剂成品应真空包装，4 ℃条件下保存为宜。

6)

真空冻干发酵剂需经过较长一段时间的延长期才速产酸，但产酸总量与液体发酵剂相当。用两种发酵剂制作泡菜，二者的品质无显著差异。

2.2 泡菜活性直投式乳酸菌发酵剂的研究

研究表明，在接种量2 %，培养温度30℃，初始pH6.6，装液量40ml(100ml 三角瓶)，振荡频率120r/min 条件下培养，培养14h 后补充营养物质继续培养，到20h 时可使乳酸菌活菌数达到7.24 × 109CFU/ml。4℃、4000r/min 离心30min 为收集细胞的最佳条件，以10 %的脱脂乳和血清蛋白作为冷冻保护剂最佳[8~10]。

2.3 泡菜发酵剂的保藏条件

将真空冷冻干燥后的发酵剂，尽快装入预先灭菌的铝箔聚酯复合袋内，分别在室温、4 ℃、－ 18℃及真空和常压两个状态下贮藏。由表1 0 中可知，发酵剂在保存期间活菌数呈下降趋势，真空包装条件下活菌数明显高于常压保存，常压包装中氧气的渗入提高了发酵剂的氧化还原电势，打破了菌体的休眠状态；－ 18℃的保存条件效果略优于4 ℃，但二者差别不大，常温保存条件活菌数相对较低，从生产应用及降低成本考虑发酵剂应真空包装，4 ℃左右的条件下保存[8~10]。

3. 浓缩型直投式乳酸发酵剂的制备及应用

浓缩型直投式乳酸菌发酵剂（DVS）系指不需要经过菌种活化、母发酵剂、中间发酵剂、生产发酵剂的扩大繁殖过程而直接应用于生产的一类新型发酵剂。其主要优点是：活菌含量高（1010 cfu/g～1012cfu/g）；保藏期长（冻藏发酵剂，>90d；冻干发酵剂4℃，>1年）；可以直接向专业生产厂家购买作为生产发酵剂使用；接种量较传统人工型发酵剂降低100～1000倍；在发酵生产中省略了发酵剂的制备工序；减少了菌种车间的投资和空间；防止了菌种的退化和污染；可使发酵生产的劳动生产率和产品质量大大提高。目前，西方发达国家的许多发酵乳制品（如酸奶、干酪、黄油等）均使用浓缩型直投式发酵剂进行发酵生产；其它

发酵食品行业（如发酵香肠、法式面包、酸泡菜等）也采用浓缩型直投式发酵剂进行发酵生产[11]。

3.1 菌种选育

筛选并培育具有优良性状的乳酸菌菌种或菌株是制备浓缩型直投式发酵剂的基础。 优良的乳酸菌种选育需要具备以下特性：（一）安全特性 制备浓缩型直投式发酵剂的乳酸菌种必须是无致病性、不产毒素的食品级微生物，这是菌种选择最基本的条件。另外，某些益生乳酸菌，如双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌等，还应具有：较强的细胞黏附性、产生一定量的益生代谢产物（有机酸、过氧化氢、细菌素等）、耐药性而不存在可转移的耐药因子、耐胃酸和耐胆盐特性等。（二）产酸特性 乳酸菌代谢产生乳酸能力的大小对于发酵制品的风味以及外观状态均有极其重要的影响。选择酸奶乳酸菌产酸特性的标准是：以2%的接种量将乳酸菌接入灭菌的复原脱脂乳中，42℃发酵，凝乳时间为3h左右、滴定酸度达95～100oT为宜。如果菌株产酸能力太强，将使菌体增殖的对数生长期缩短，细胞生长量降低，还会影响发酵乳制品的风味。（三）产香特性 乙醛是酸奶风味的重要成分，它主要来自保加利亚乳杆菌在代谢过程中水解蛋白产生苏氨酸，而苏氨酸是乙醛生成的前体物。一般认为：乙醛在酸奶中的最佳风味值为20mg/kg～40mg/kg。嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌可产生微量丁二酮，但它们不分解柠檬酸，糖代谢产生的丙酮酸是丁二酮生成的唯一前体物，酸奶中丁二酮的含量为0.8 mg/kg～1.5 mg/kg。因此，所选菌株应有产生这些香气物质的能力。 （四）产生粘性物质特性 发酵制品细腻的质地和良好的外观与乳酸菌在发酵过程中产生的粘性物质密切相关。研究表明，原料乳经乳酸菌发酵后粘稠度增加，这除了酪蛋白凝固外，主要是因为乳酸菌能产生粘性物质即胞外粘多糖，可形成酸奶的细腻质地和良好外观。（五）水解蛋白和脂肪特性 一般而言，乳酸菌具有弱的蛋白水解性和脂肪水解性。（六）后熟特性 乳酸菌的后熟特性即后酸化特性，系指发酵制品在保藏期间的酸度变化特性[12]。

3.2 浓缩乳酸菌的发酵剂的制备 3.2.1 控制混合培养杆菌和球菌的比例

保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌有共生作用“一般来说,保加利亚乳杆菌对发酵乳品中有机酸的形成起主导作用;嗜热链球菌在发酵过程中除进行产酸代谢外,还产生双乙酰等发酵乳制品特有的风味物质\"研究表明,适当减少接种量和降低培养温度,有利于混合培养中嗜热链球菌的生长;培养前期,嗜热链球菌生长旺盛,培养后期保加利亚乳杆菌生长旺盛”[13]。

3.2.2 浓缩培养的方法

制备浓缩型乳酸菌发酵剂,需要获得高浓度的细胞培养物,因此必须对乳酸菌进行培养,

基本原理:在乳酸菌培养过程中,通过追加营养物质，排除代谢产物，调节p H 值等措施, 解除代谢产物乳酸对细胞的抑制作用,延长乳酸菌对数生长期,获得高浓度的细胞培养物,主要有化学中和法:在培养过程中向培养液加入缓冲盐,使培养液的酸度在一定范围内;膜渗析法:向乳酸菌培养液不断加入营养物质,代谢产物通过膜除去“膜渗析法是目前国内外最先进的方法,但该法对膜材料和操作技术要求高”在缓冲盐法浓缩培养研究领域中,美国和意大利处于领先水平,但其配方保密\"。

3.2.3生物保藏技术 1) 冷冻保藏法

影响浓缩型冻藏发酵剂活力的贮藏稳定性因素主要有:冷冻保护介质!冻结速度和冷冻温度。乔发东等人研究发现有甘油、脱脂乳、蔗糖、酵母膏、蛋白胨、VC和谷氨酸钠组成的冷冻保护介质,可使浓缩型发酵剂在冻藏时间保持较高细胞存活率“慢速冻结可提高细胞的存活率”一般认为细胞悬液在-20℃— -40℃1h左右达到冻结为适宜的慢速冻结方式[11]。

2) 干燥保藏法

冻干法的基本原理是:菌体与保护介质混溶,在共溶点以下预冻,然后在低于三相点压力的高度真空下,使菌品中的冰晶升华,除去菌品中的多余水分,获得一定含水量的干燥发酵剂\"影响关键因素是冻干保护介质。它不仅影响发酵剂在冻干过程中细胞存活率,还影响保藏期间细胞的稳定性。

3.2.4 影响乳酸菌生长的因素 1) 培养基

乳酸菌是具有严格营养要求的化能异养菌，只有很好地了解其对营养物质的要求，分析各种生长辅助因子的特性，才能在研究和生产中正确地选择增菌培养基和培养条件，得到满意结果。 由于乳酸菌缺乏分解淀粉等大分子碳水化合物的酶系，能够利用的碳源主要是乳糖等简单糖类。此外，因碳源对乳酸菌来说还兼有能源的作用，是需要量最大的营养，所以其比例往往远高于氮源。但若碳源浓度超过3%，乳酸菌的生长则会因细胞脱水而开始下降，并且产生碳分解代谢物阻遏效应。乳酸菌蛋白质分解能力有限，增殖速度快慢和培养基中氨基酸的含量密切相关，因此其最适氮源主要是水解蛋白类物质。氮源中以酵母膏的增菌效果最好，其中多含辅酶与核酸的组成成分（如氨基酸类、肽类和B族维生素），有助于从多方面满足乳酸菌生长要求。

2) 共生与拮抗作用

自然界中广泛分布的乳酸菌能适应各个生存环境，如肉制品、乳制品、面食、酒类和蔬菜等发酵制品中的乳酸菌几乎都存在巧妙的共生或拮抗关系。搭配菌种组合时不仅因制品的种类而异，还必须注意使各菌种间产生理想的共生效果而不是彼此竞争。

3) 噬菌体污染

在发酵过程中经常因噬菌体侵袭乳酸菌，致使菌体产酸能力严重下降乃至菌体破裂而致使发酵迟缓或发酵失败，给生产厂家造成巨大的经济损失。发酵工厂预防噬菌体污染时一般考虑以下两点：其一是菌体自带噬菌体（特别是溶源性细菌）；其二是生产环境和自然条件中存在的噬菌体。

3.3 不同类型浓缩型直投式乳酸菌发酵剂的应用 3.3.1 乳酸乳球菌发酵剂（1actococcistarters）

这是一类广泛应用于发酵生产黄油、酸奶油、硬质和软质奶酪以及农家干酪的乳酸菌发酵剂。作为典型的直投式发酵剂（direct-vat-set，或DVS），通用的包装量是70 mL～150mL，活菌细胞数为5×109cfu/ml～50×109cfu/ mL。一般，用360mL浓缩型的乳脂乳球菌（Lactococcus lactis）发酵剂可直接接种到2273kg原料乳中，发酵生产硬质契达奶酪（cheddar cheese）。如果按传统的继代培养方式接种该发酵剂（接种量按1 ％计），则生产同样产量的契达奶酪将需要21kg的生产发酵剂。

3.3.2 乳杆菌发酵剂（1actobacillistarters）

乳杆菌是乳酸细菌中的一个重要属，约有54个种，广泛用于乳制品、肉制品、谷物类和果蔬食品的发酵生产中。其中，最具商业应用价值的乳杆菌发酵剂有保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillusacidophilus）和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）等。酸乳制品以及意大利式干酪产品（如mozzarella、provolone和romano）常采用保加利亚乳杆菌进行发酵。嗜酸乳杆菌是能够定植于人体肠道中的典型的益生菌，近年来被广泛应用于生产加工甜性嗜酸乳杆菌奶。通常是将130mL嗜酸乳杆菌浓缩型发酵剂（含有50×109cfu/mL活细胞）直接接种于2250L的巴氏灭菌奶中，即可加工制作出最终细胞浓度为3×106cfu/mL的甜性嗜酸乳杆菌奶。甜性嗜酸乳杆菌奶不再进行发酵，直接在7℃条件下贮藏，货架期维持在7d左右。浓缩型的植物乳杆菌发酵剂是广泛应用于果蔬制品生产的发酵剂。通常是将130mL植物乳杆菌浓缩发酵剂（活细胞数为6.5*1012cfu/mL）直接接种到9.0t的黄瓜中进行发酵，发酵温度通常保持在26℃～29℃，7～12d就可以终止发酵。与传统的自然发酵相比，利用浓缩型植物乳杆菌直投式发酵剂不仅缩短了发酵周期，而

且改善了最终发酵产品的质量[11]。

3.3.3 片球菌发酵剂（pediococci starters）

啤酒片球菌（Pediococcus cerevisiae）是一种应用于制作发酵香肠的发酵剂。目前多采用啤酒片球菌浓缩型发酵剂直接接种进行香肠发酵。一般，70mL的啤酒片球菌发酵剂（含有100×109cfu/mL活细胞）可以发酵136kg的香肠。采用直投式啤酒片球菌发酵剂不仅能有效的控制金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）在香肠制品上的生长与存活，提高食品的安全性，而且能够减少亚硝酸盐和其他辅助材料的用量，并缩短发酵时间。

4. 前景展望

目前西方乳业发达国家对发酵剂的研制已具有相当的深度和广度：欧盟在生物技术应用于乳酸菌这一领域占据一定优势。以爱尔兰A> B > C > D 实验室为主体，对乳酸菌基因序列的分析、功能基因的确定、碳氮源代谢途径和所需工业特性基因改造等进行了全面细致地研究，预从基因角度了解发酵机理和过程；乳酸菌尤其是双歧杆菌和嗜酸乳杆菌等肠道有益菌分泌的代谢产物对消化道健康、免疫和抑癌的积极作用已引起世界范围的重视，使得研究者跳出单纯利用发酵剂改善产品风味和质构的框架，进一步开发出具有高附加值的功能型乳制品；与发酵剂生产相配套的工程技术不断改进，诸如代谢调控技术、高密度培养技术、发酵与产物分离偶联技术和冷冻干燥生物技术等，不仅使乳酸菌进行自动化和连续化发酵生产成为可能，还大大降低了机械设备和冷冻干燥对菌体的损伤，提高了发酵剂保藏过程中菌体的存活率；随着发酵剂的制备在国内逐渐形成专业化和规模化的工业生产体系，必将为发酵乳制品整体技术水平的提高奠定基础。

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