一种与辣椒簇生花序基因紧密连锁的Indel分子标记,引物及应用[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 110592255 A(43)申请公布日 2019.12.20

(21)申请号 201910905135.5(22)申请日 2019.09.24

(71)申请人 湖南农业大学

地址 410128 湖南省长沙市芙蓉区农大路1

号

申请人 湖南省蔬菜研究所

(72)发明人 欧立军　吕俊恒　刘周斌　刘宇华　

陈文超　邹学校　于会洋　陈蓉　欧阳波　李峰　(74)专利代理机构 长沙市融智专利事务所(普

通合伙) 43114

代理人 袁靖(51)Int.Cl.

C12Q 1/6895(2018.01)C12Q 1/6806(2018.01)

(54)发明名称

一种与辣椒簇生花序基因紧密连锁的Indel分子标记，引物及应用(57)摘要

本发明公开了一种与辣椒簇生花序基因紧密连锁的Indel分子标记，引物及应用。利用2份高度纯合的自交系构建F2群体。利用BSR与连锁定位的方法获得与辣椒簇生花序紧密连锁的染色体区域，并在候选区间内开发插入/缺失位点(InDel)标记进行验证。最终获得与候选基因附近紧密连锁的InDel，并根据其设计分子标记In-9258，利用该标记对F2群体100个随机抽样的单株进行基因型鉴定，符合率达到100％。研究结果不仅能够用于辣椒花序类型鉴定及分子辅助育种，且为控制辣椒簇生花序基因的图位克隆及解析簇生花序形成的分子机制提供了基础。

C12N 15/11(2006.01)

权利要求书1页 说明书5页序列表1页 附图2页

CN 110592255 ACN 110592255 A

权　利　要　求　书

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1.一种与辣椒簇生花序基因紧密连锁的Indel分子标记，是从辣椒6号染色9258832处开始的一段23bp的插入/缺失，其序列如下：TTGGTAGGATTTTGAACCATTGC。

2.一种权利要求1所述的Indel分子标记的引物，其特征在于：是根据23bp插入/缺失片段的上下游设计的引物。

3.根据权利要求2所述的引物，其特征在于，正向引物In-9258-F: 5′-TCAGTATTACACTCTACCAAACGTG-3′，反向引物In-9258-R: 5′-ATTCTCATGTATTGCTAATACCACC-3′。

4.权利要求1所述的Indel分子标记和权利要求2或3所述的引物在预测辣椒簇生花序和单生花序类型及分子辅助育种中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：(1) 提取辣椒单株DNA作为模板；(2) 加入权利要求2或3所述的引物进行PCR扩增；(3) 利用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，利用凝胶成像系统读取带型；(4) 根据步骤（3）所得带型，当仅有单一的221bp特异条带出现时，预测为簇生花序类型单株；单一的198bp特异条带出现或者同时具备221 bp与198 bp的特异条带时，预测为单生花序类型单株。

6.权利要求1所述的辣椒簇生花序基因紧密连锁的分子标记的获得方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）利用辣椒单生花序的高代自交系为父本，辣椒簇生花序的高代自交系为母本，杂交构建F2群体；（2）对F2群体进行花序表型鉴定，采用BSR法分别获得单生花序混池和簇生花序混池，并进行RNA-seq测序，对测序结果进行生物信息学分析后获得与辣椒簇生花序连锁的染色体区域；（3）利用InDel分子标记技术，开发目标染色体区域的基于PCR的InDel分子标记，获得与簇生基因紧密连锁的分子标记。

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一种与辣椒簇生花序基因紧密连锁的Indel分子标记，引物及

应用

技术领域

[0001]本发明属于辣椒育种和分子生物学领域，更具体地涉及一种与辣椒簇生花序紧密相关的Indel分子标记及引物，同时还涉及它们在预测辣椒花序及分子辅助育种中的应用。背景技术

[0002]辣椒(Capsicum annuum L.)是茄科辣椒属蔬菜作物，原产于中美洲和南美洲。辣椒由于其营养价值丰富、适应性强，所以作为一种重要的蔬菜作物在世界范围内被广泛种植，并且深受消费者喜欢。根据FAO 2014年统计结果，辣椒全世界产量已经超过4900万吨，据中国农业部大宗蔬菜体系统计，我国辣椒栽培面积不断增加，辣椒产业取得了巨大的进步，近年来我国辣椒年播种面积在150～200万hm2，目前已经占全国蔬菜总播种面积的8％～10％。育种过程中，在机械化采收品种与观赏辣椒品种的选育时簇生性状作为辣椒特殊性状，也受到了育种家的高度重视，该性状在生产应用中具有极其重要的意义。[0003]植株形态结构是一个极其重要的农艺性状，其不仅能够让不同物种得到区分，同时拥有优良植株结构的植物能够显著提高产量与品质。目前对株型的研究在水稻、玉米等作物中已经取得了一定的进展与突破。根据已有的经典遗传学研究资料表明，水稻簇生穗是一种由单基因Cl控制不完全显性突变体。在玉米选择和驯化期间TEOSINTE BRANCHED1(TB1)基因能够选择与抑制其分枝数量并增加穗大小。晚期开花和确定番茄中的基因和SELF-PRUNING(SP)基因可以调节其营养生长和生殖生长。番茄中SP基因的突变促进了无限生长型向有限生长型的转化，并且突变可以完全改变植株结构。番茄SP是金鱼草(CEN)和拟南芥TERMINAL FLOWER1(TFL1)基因的直系同源物，它编码CETS蛋白家族开花的抑制因子，同时TFL1和CEN基因的突变可调节拟南芥的花序，同时金鱼草中发现TFL1能够调节分生组织功能并进一步调节开花。在拟南芥中水稻TFL1/CEN家族基因Oscen1和Oscen2和OsGRF1的过表达导致节间数量的增加，长度的缩短，然后改变株型结构。大量的基因与确定花序类型，中间分生组织的特征和调节花器官形态有关，如LEAFY(LFY)，APETALA1(AP1，CAULIFLOWER，AP3和PISTILLATA)。

[0004]虽然株型结构对作物生产的重要价值是众所周知的，但其生长习性变异的遗传基础研究较为薄弱，关于辣椒株型的研究目前相对较少，株型形态结构的调控机制至今也仍然未得到有效解答。辣椒花序结构是一个重要的部分，可以改变其植物结构，有效的提高其产量和观赏价值。另一方面，具有束状果实的辣椒更适合于机械收获，有利于培育机械化收获的品种，解决人工不足以及收获成本高等问题。[0005]分子标记辅助选择(marker-assisted selection，MAS)技术目前在植物中被广泛应用于分子标记辅助育种。其能够快速高效的鉴定含有目标基因的个体，有效节省育种时间，能够在苗期鉴定得到植株的表型性状。簇生辣椒能够显著提高产量，并且有利于机械化收获，越来越得到育种家的重视，是培育高产与机械化采收的新型辣椒品种是重要的育种目标之一。利用分子标记技术，根据开发的标记在创制材料的进程中能够快速鉴定具有簇

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生性状的植株，减少播种移栽的工作量。同时，这一方法也为克隆控制辣椒簇生的基因，进而解析簇生性状的形成机理奠定了基础。

发明内容

[0006]本发明的首要目的在于提供一种新的与辣椒簇生花序基因紧密连锁的Indel分子标记。具体是从辣椒6号染色9258832处开始的一段23bp的插入/缺失，其序列如下：TTGGTAGGATTTTGAACCATTGC，见SEQ ID No.1。

[0007]本发明的分子标记以簇生花序基因紧密连锁的插入/缺失为基础，根据该插入/缺失上下游的序列设计开发引物。能够用于辣椒单簇生花序表型的鉴定。该分子标记的发现，解决了常规辣椒簇生花序育种方法中存在的选育周期长、选择效率低等问题，提高了辣椒品种遗传改良的步伐。

[0008]本发明的第二个目的在于提供上述与辣椒簇生花序基因紧密连锁的Indel分子标记的引物，是根据23bp的插入/缺失片段的上下游设计的引物。[0009]进一步的，所述的引物优选：[0010]正向引物序列In-9258-F为5′-TCAGTATTACACTCTACCAAACGTG-3′，见SEQ ID No.2，[0011]反向引物序列In-9258-R为：5′-ATTCTCATGTATTGCTAATACCACC-3′，见SEQ ID No.3。

[0012]本发明的第三个目的是提供上述的Indel分子标记和上述的引物在预测辣椒簇生花序和单生花序类型及分子辅助育种中的应用。[0013]具体包括以下步骤：[0014](1)提取辣椒单株DNA作为模板；[0015](2)采用依据分子标记上下游设计的引物进行PCR扩增；[0016](3)利用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，利用凝胶成像系统读取带型；[0017](4)根据步骤(3)所得带型，当仅有单一的221bp特异条带出现时，预测为簇生花序类型单株；单一的198bp特异条带出现或者同时具备221bp与198bp的特异条带时，预测为单生花序类型单株。[0018]进一步的，PCR反应体系：总体积为20μL，具体成分如下：PCR在20μL反应系统中进行，该反应系统由1μL 30ng/μL的基因组DNA，18μLPCR-T3-Mix和10μmol正向和反向引物各0.5μL组成。

[0019]进一步的，PCR反应扩增程序为：98℃下预变性3分钟后；在98℃的变性15秒，退火温度为55-60℃，持续10秒，延伸温度为72℃，持续30秒，30个循环；然后在72℃下进行最终延伸3分钟；反应终止。

[0020]通过辣椒簇生相关分子标记的早期鉴定和辅助选择，可以显著提高辣椒簇生品种选育的效率与准确度，极大降低品种选育期间田间材料的种植规模和后期鉴定的工作量。[0021]本发明的第四个目的是提供上述与辣椒簇生花序基因紧密连锁的Indel分子标记的获得方法。

[0022]本发明的分子标记是通过如下方式获取的：[0023](1)利用单生花序的辣椒高代自交系为父本，簇生花序的辣椒高代自交系为母本，杂交构建F2群体；

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(2)四世代群体(两个亲本，F1，F2)种植于玻璃温室，苗期取新鲜嫩叶于2.0ml离心

管中，于液氮中保存备用；[0025](3)F2群体盛花期时统计单株花序表型，选取单生与簇生花序的单株各30株，取花蕾提取RNA，等量混匀构建单生花序混池与簇生花序混池用于RNA-seq，同时取亲本DNA构建DNA文库进行全基因组重测序；[0026](4)利用CTAB法提取两个亲本DNA，利用TruSeq DNA LT Sample Prep Kit(Illumina)分别建库，在Illumina Hiseq4000平台测序。利用Trizol法提取选定混池的60个单株花蕾RNA，等量混合。构建单花池与簇生花池两个cDNA文库，在HiSeq 4000(Illumina,San Diego,CA,USA)进行测序双末端150bp测序，插入片段大小为300bp。利用获得的RNA-seq数据分析簇生基因所在染色体区域。Δ(SNP-index)的值通过单生池与簇生池的SNP-index差值获得，最终选取Δ(SNP-index)大于0.5的区间为候选区域。并结合两个亲本的重测序数据分析目的区段内InDel。[0027](5)根据获得的InDel差异，利用Primer Premier 5.0设计引物开发标记，我们在候选区段内一共开发了12对多态性的InDel标记，利用该系列标记对F2群体中的隐性簇生花序单株进行基因分析，鉴定重组单株，发现在目的区段内与控制簇生性状基因目的基因高度连锁的标记In-9258，其正向引物序列为：5′-TCAGTATTACACTCTACCAAACGTG-3′：反向引物序列为5′-ATTCTCATGTATTGCTAATACCACC-3′。[0028]与现有技术相比，本发明具备以下优点：

[0029]本发明提供了一种辣椒簇生花序紧密相关的分子标记In-9258，及其在辣椒簇生花序品种选育中的应用。有效解决了常规育种方法中存在的鉴定周期长、选择效率低等缺点，通过辣椒簇生相关分子标记的早期鉴定和辅助选择，可以显著提高品种辣椒簇生品种选育的效率与准确度，极大降低了田间材料的种植规模和后期鉴定工作量。附图说明

[0030]图1为辣椒单生花与簇生花亲本表型；

[0031]图2为Δ(SNP-index)分析单花混池和簇生花混池，箭头所指为候选QTL；[0032]图3为候选区段内标记开发与连锁定位示意图；

[0033]图4为利用In-9258标记对F2群体单株花序表型鉴定。部分F2单株鉴定结果如图所示，33个单株仅具备221bp的条带预测为簇生花序表型，其余10个F2单株含有198bp带型预测为单生花序表型，基因型鉴定结果与表型鉴定结果100％一致。具体实施方式

[0034]本发明实施例的举例不构成对本发明的任何限制。在下面的实验步骤中，除非特别说明，否则所有操作均按照《分子克隆实验指南》(第三版)(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002)所提供的方法进行。[0035]实施例1：

[0036]一种辣椒簇生分子标记InDel-9258，通过以下方法获得：[0037]1.群体构建[0038]利用辣椒LS20单生花序自交系为母本，XJ10辣椒簇生花序自交系为父本杂交获得

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F1，F1自交得到F2，完成F2群体构建(图1)。[0039]2.花序表型鉴定[0040](1)亲本LS20与XJ10，F1以及F2群体播种于穴盘，待成苗后移栽于玻璃温室，常规栽培管理。[0041](2)待盛花期时对F2群体进行表型鉴定，同时选取单生与簇生花序的F2单株各30株构建两个混池。

[0042]3.簇生花序QTL分析

[0043]分别提取选定混池单株花蕾RNA，并等量混合构建cDNA两个文库，在Illumina Hiseq4000平台测序，获得的数据利用BSR的方法分析簇生花序基因候选区间。Δ(SNP-index)的值由簇生混池与单生混池的SNP-index差值获得(图2)。[0044]4.分子标记开发

[0045]CTAB法提取两个亲本DNA，利用TruSeq DNA LT Sample Prep Kit(Illumina)分别建库，在Illumina Hiseq4000平台测序。根据混池RNA-seq数据分析获得的候选区间，以两个亲本重测序数据为参考分析获得候选目的区段的InDel。然后根据获得的InDel差异，利用Primer Premier 5.0设计引物开发标记，我们在候选区段内一共开发了12对多态性的InDel标记(图3)，利用该系列标记对F2群体中的隐性簇生花序单株进行基因分析，鉴定重组单株，发现在目的区段内与控制簇生性状基因高度连锁的标记In-9258(图4)，其对应的辣椒参考基因组物理图谱的位置为6号染色体的9258832处开始的一段23bp的插入/缺失，其序列如下：TTGGTAGGATTTTGAACCATTGC。根据该段序列上下游设计的引物序列如下：[0046]其正向引物为：5′-TCAGTATTACACTCTACCAAACGTG-3′，[0047]反向引物为：5′-ATTCTCATGTATTGCTAATACCACC-3′。[0048]5.簇生分子标记在辣椒簇生花序育种中的应用[0049]利用获得的簇生花序的分子标记，对F2群体中随机挑选的100个单株进行鉴定，其步骤如下：[0050](1)以辣椒F2单株DNA为模板；[0051](2)采用分子标记In-9258进行PCR扩增，引物序列为：[0052]其正向引物为：5′-TCAGTATTACACTCTACCAAACGTG-3′[0053]反向引物为：5′-ATTCTCATGTATTGCTAATACCACC-3′；[0054](3)PCR反应体系：总体积为20μL，具体成分如下：PCR在20μL反应系统中进行，该反应系统由1μL基因组DNA(30ng/μL)，18μL PCR-T3-Mix(TSINGKE)和正向和反向引物(10μmol)各0.5μL组成；[0055](4)PCR反应在美国Bio-Rad公司生产的S1000型PCR仪上进行。扩增程序为：98℃下预变性3分钟后；在98℃的变性10秒，退火温度为55-60℃，持续10秒，延伸温度为72℃，持续30秒，30个循环；然后在72℃下进行最终延伸3分钟；反应终止。将PCR产物用2.5％琼脂糖凝胶电泳检测，用溴化乙锭染色并在凝胶成像系统中观察，记录结果；[0056](5)当仅出现221bp特异条带时，预测为簇生花序类型单株；仅出现198bp的特异条带或者同时具备221bp与198bp的特异条带，预测为单生花序类型单株。F2群体中随机抽样的单株表型与基因型符合率100％(表1)。[0057]上述鉴定结果表明，在分离材料中通过分子标记鉴定筛选，保留仅具备221bp特异

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带型的材料，淘汰出现198bp带型的材料，可以有效的选择出辣椒簇生花序的材料，提高选择效率，减少田间材料种植的工作量以及筛选鉴定的工作量，加速育种进程。[0058]表1 F2群体单株鉴定结果

[0059]

[0060]

注：1：表示仅出现198bp大小的条带；2:表示仅出现221bp大小的条带；3：表示同时出现198bp与221bp大小的条带。

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序　列　表

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序列表<110> 湖南农业大学湖南省蔬菜研究所<120> 一种与辣椒簇生花序基因紧密连锁的Indel分子标记，引物及应用<160> 3<170> SIPOSequenceListing 1.0<210> 1<211> 23<212> DNA<213> 辣椒(Capsicum annuum L.)<400> 1ttggtaggat tttgaaccat tgc 23<210> 2<211> 25<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 2tcagtattac actctaccaa acgtg 25<210> 3<211> 25<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 3attctcatgt attgctaata ccacc 25

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图1

图2

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