短小芽孢杆菌β-1,4-木聚糖酶基因在大肠杆菌中的高效表达

··研究论文

短小芽孢杆菌茁-1,4-木聚糖酶基因在大肠杆菌中的高效表达*

刘伟丰毛爱军祝令香

乔宇于

巍董志扬**

（中国科学院微生物研究所北京100080）

（摘要：从短小芽孢杆菌表达载体pET21a上，转化

）BP51中克隆得到木聚糖酶基因

BL21，获得重组工程菌BLX5。经IPTG诱导，。将其构建在大肠杆菌（

）基因的表达产物以胞内可溶性蛋白和包

涵体形式存在。重组表达木聚糖酶的活力可达165.51IU/mL培养物。重组表达的木聚糖酶最适温度为55益，最适pH值为6.5，在碱性条件下具有良好的稳定性，降解产物以三糖、四糖和五糖为主。

重组高效表达关键词：木聚糖酶；短小芽孢杆菌；

Overexpressionof

in

LIUWei-FengMAOAi-Jun

茁-1,4-XylanaseGene()

ZHULing-XiangQIAOYuYUWeiDONGZhi-Yang**

(InstituteofMicrobiology,ChineseAcademyofSciences,Beijing100080,China)

Thexylanase-encodinggene

andtransformedinto

wasclonedfrom

BP51,

insertedintoexpressionvectorpET21a

BL21(DE3),finallytherecombinantstrainBLX5wasobtained.InducedbyIPTG,the

TheoptimumtemperatureandpHoftherecombinant

genewasexpressedintherecombinantstrainBLX5.Anditsexpressionproductsexistedasbothsolubleproteinsandinclusionbodies.Therecombinantexpressionxylanaseactivityreachedto165.51IU/mL.

expressionxylanasewere55益andpH6.5respectively.Andtherecombinantexpressedxylanasewasstableinalkalitropiccondition.Anditshydrolysisproductsweremainlytrisachharides,tetrasaccharidesandpentasaccharides.

xylanase;

;overexpression

木聚糖酶（1,4-β-D-xylanxylanohydrlase,EC.

3.2.1.8）通过内切方式水解木聚糖分子中的β-1,4-木糖苷键，水解产物以木寡糖和木二糖为主。随着木聚糖酶在造纸、食品、饲料等领域的成功应用，它已成为酶制剂产业的一个重要产品。目前已有上百种木聚糖酶被发现，来源包括真菌、细菌和放线菌等数十个种的微生物[1]，报道较多及产酶活力较高的微生物主要是黑曲霉和木霉等真菌[2]，所产的酶大多属酸性木聚糖酶，而短小芽孢杆菌来源的木聚糖酶具有良好的耐碱特性[3]，在纸浆生物漂白中具有广阔的应用前景。该酶基因已经被克隆[4]，国外已有不少研究者对该基因进行表达[5~8]，但表达活力都非常低。本研究从短小芽孢杆菌中克隆到木聚糖酶基因，将其构建在大肠杆菌表达载体pET21a上，转化大肠杆菌BL21（DE3），使短小芽孢杆菌木聚糖酶基因在大肠杆菌中高效表达，其木聚糖酶表达活力远远超过国外报道的在中的表达水平。同时对重组表达木聚糖酶的一些性质进行了研究。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1菌株与质粒大肠杆菌（）DH5琢、BL21(DE3)，短小芽孢杆菌()BP51为本实验室保存；质粒pGEM-TEasy购于

（No.2001AA214161.）（No.KJCX2-SW-206-1）*基金项目：国家高技术研究与发展计划（863）项目和中国科学院知识创新方向性课题。刘伟丰：男，1976年生，硕士。E-mail：.**通讯作者。Authorforcorrespondence.E-mail：.收稿日期:2003-06-25接受日期:2003-07-08

PDF 文件使用 \"pdfFactory Pro\" 试用版本创建 www.fineprint.cn

456农业生物技术学报2004年

质粒pET-21a(+)为本实验室保存。Promega公司，

1.1.2培养基采用LB培养基[9]培养大肠杆菌宿主和短小芽孢杆菌，抗性筛选时加入氨苄青霉素至终浓度100滋g/mL。

1.1.3试剂各种DNA性内切酶、T4DNA连接酶、DNA回收试剂盒、蛋白质分子量标准购自鼎国公司；小牛肠碱性磷酸酶、X-Gal购自Promega公

PCR扩增引司；DNA聚合酶购自Sangon公司；

物由Sangon公司合成；其它生化试剂购于Sigma等公司。1.2方法

1.2.1短小芽孢杆菌总DNA的提取按照Murray的方法[10]从短小芽孢杆菌BP51中提取基因组总DNA，大小在20kb左右。1.2.2基因的PCR扩增根据已报道的短小

基因序列[4]，设计并合成特异性引芽孢杆菌

物，两条引物的5'端都含有单一的H玉酶切位点。

P1：cgggatccagaaccattacgaataat；

HⅠP2：cgggatccttagttgccaataaacag。

HⅠ1.2.6SDS-PAGE电泳和蛋白定量分析将菌体

重悬于0.2mol/LNaH2PO4-Na2HPO4缓冲液（pH8.0）中，超声波破碎菌体，4000r/min离心15min，所得上清液和沉淀参照Laemli[11]的方法进行SDS-PAGE分析；采用Folin-酚方法测蛋白浓度[12]，以牛血清白蛋白制作标准曲线。

1.2.7重组表达木聚糖酶活力的测定和酶解产物

上分析诱导后收集的菌体通过超声波破碎离心，

清液用30%、60%的硫酸铵进行分级分离，得到初步

然后采用DNS定糖方法进行酶活纯化的木聚糖酶，

力的测定[13]：取一定稀释的酶液0.1mL，加入0.1mL用0.2mol/L磷酸缓冲液（pH6.5）配制的1%木聚糖底物，50益反应10min，加入0.6mLDNS试剂，煮沸10min，用水定容至5mL后在550nm处测光吸收，以每分钟生成1滋mol木糖所需酶量定义

（IU）（TLC）为1个酶活力单位。薄层层析分析参见Stahl的方法[14]。

2结果和分析

以短小芽孢杆菌BP51基因组DNA为模板，用

引物P1、P2对基因进行PCR扩增。PCR反应体系为50滋L，含有50ngBP51总DNA，0.2mmol/LdNTP，25pmol每种引物，1伊PCR反应缓冲液，2.5UDNA聚合酶。反应条件：93益预变性3min后，93益变性50s，48益退火1min，72益延伸1min,进行35个循环；然后72益延伸7min。PCR扩增产物经DNA回收试剂盒回收。1.2.3基因克隆与序列分析将PCR产物连

转化接到pGEM-TEasy载体上，DH5琢。筛选得到含有基因的阳性克隆，进行酶切鉴定

和序列分析。1.2.4基因重组表达载体构建利用

HⅠ酶切得到的基因片段，连接到表达载体pET21a(+)的HⅠ酶切位点上，得到重组表达质粒，转化BL21（DE3）。筛选阳性重组子，用于表达研究。1.2.5基因在BL21中的诱导表达将重组菌接到含氨苄青霉素的LB培养基中继续培养

加入IPTG到终浓度0.75mmol/L,诱至对数生长期，

导培养一定时间，室温下4000r/min离心15min收集菌体。鉴定与表达载体构建2.1木聚糖酶基因的克隆、

通过PCR方法，从短小芽孢杆菌总DNA中扩增出606bp的基因片段，连接到pGEM-TEasy载体上，转化DH5琢。序列分析结果表明扩增出的基因序列与报道[2]的序列完全一致。将pGEM-TEasy上的基因片段用H玉切下，插入到表达载体pET21a(+)的多克隆位点中的

H玉位点上，转化受体菌BL21（DE3）。

用提取BL21（DE3）中的质粒，R玉对质粒进行

酶切，确定基因插入方向。选择基因正

分析阅读框是否正确。向插入的质粒进行序列测定，

获得正向插入且阅读框正确的重组质粒，将重组质粒命名为pEX5，将含有该质粒的重组菌株命名为BLX5。重组质粒pEX5见图1，pEX5酶切分析见图2。

2.2木聚糖酶基因的诱导表达

将重组菌株BLX5接于LB培养基中，IPTG诱导后，重组菌经超声破碎，进行SDS-PAGE分析和木聚糖酶活力的检测。SDS-PAGE分析表明(图3)，与未经诱导的对照以及含pET21a(+)空载体受体菌对照相比，经诱导的重组菌有明显的重组蛋白表达带。重组蛋白分子量约为24kD，文献报道中

所产木聚糖酶分子量为22.4kD[4]，本实验中

木聚糖酶的N端增加了14个氨基酸的融合肽，重组表达木聚糖酶的分子量大小与理论值相符。采用

PDF 文件使用 \"pdfFactory Pro\" 试用版本创建 www.fineprint.cn

第4期刘伟丰等:短小芽孢杆菌茁-1,4-木聚糖酶基因在大肠杆菌中的高效表达

457

常规37益诱导，转接后的菌体在长至600值0.6时，添加IPTG至终浓度0.75mmol/L，37益诱导8h后达到最大表达量109.30IU/mL培养物。表达后的菌体经超声破碎后，取上清和沉淀分别进行SDS-PAGE分析，表达的重组蛋白以胞内可溶性蛋白和包涵体形式存在，其中大量为不溶性的包涵体（图4）。为降低表达蛋白中包涵体的量，采用30益

基因进行低温培养方式对重组菌BLX5中的

诱导表达，木聚糖酶活力可达165.51IU/mL培养物。通过SDS-PAGE分析，发现形成的包涵体量大幅减少（图4）。

力，发现该酶在pH6.5时表现出最大酶活力，表明

该酶最适pH为6.5（图6）。重组表达木聚糖酶的最适温度和最适pH与文献报道的短小芽孢杆菌木聚糖酶一致[3]。

图3.重组表达木聚糖酶的SDS-PAGE分析

Fig.3.AnalysisofrecombinantexpressedxylanasebyDS-PAGE

M,standardproteinmolecularweight;1,

harboringpET21

inducedbyIPTG;2~5,recombinantstrainBLX5inducedbyIPTG(0,2,

5and8h);6,recombinantstrainBLX5uninduced.

图1.重组质粒pEX5图谱Fig.1.MapofrecombinantplasmidpEX5

图4.

图2.重组质粒pEX5的酶切鉴定

Fig.2.TherestrictionanalysisofrecombinantplasmidpEX5

1,pEX5digestedbydigestedby

RⅠ;2,PCRproductof

;3,pEX5

HⅠ;4,pET21adigestedby

ladders.

HⅠ;M,1kbDNA

基因重组表达产物的分布

geneexpressionproducts

Fig.4.Distributionof

1,solubleproteinsinBLX5at37益;2,solubleproteinsinBLX5at30益;3,insolubleproteinsinBLX5at37益;4,insolubleproteinsin

BLX5at30益.

2.3重组表达木聚糖酶的性质

2.3.1重组表达木聚糖酶的最适温度和最适pH在不同温度条件下分析重组表达木聚糖酶活力变化，发现该重组酶的最适温度为55益（图5），同时发现重组表达木聚糖酶在常温下具有较好的稳定性。在不同pH反应条件下分析重组表达木聚糖酶的酶活

2.3.2重组表达木聚糖酶的pH稳定性将重组表达木聚糖酶在不同pH值的缓冲液中37益保温30min，检测剩余的酶活力，发现该酶在pH11.0的条件下保温30min仍具有50%的酶活力（图7），表明该重组酶具有较好的耐碱性。

2.3.3重组表达木聚糖酶酶解产物的TLC分析利用重组表达木聚糖酶水解木聚糖，用薄层层析对酶解产物进行分析，结果表明重组表达木聚糖酶水

PDF 文件使用 \"pdfFactory Pro\" 试用版本创建 www.fineprint.cn

458农业生物技术学报2004年

表明该酶解木聚糖的产物以三糖、四糖和五糖为主，

是以内切的方式作用于木聚糖链（图8）。

图8.重组表达木聚糖酶水解产物的TLC分析Fig.8.Analysisofhydrolysisproductsofrecombinantexpressed

xylanase

图5.温度对重组表达木聚糖酶活力的影响Fig.5.Effectoftemperatureonactivityofrecombinant

expressedxylanase

1,xyloseandtetrasaccharides;

2,3,hydrolysisproductsofrecombinantexpressedxylanases.

3讨论

木聚糖酶作为一种重要的工业酶制剂，可广泛

应用于造纸、食品、饲料等行业。特别是在造纸工业中，利用木聚糖酶作为纸浆生物漂白剂，具有广阔的应用前景[15]。纸浆生物漂白需要耐碱性较好的木聚糖酶，来源于短小芽孢杆菌的木聚糖酶，在碱性条件

通下具有较好的稳定性，非常适合应用于造纸工业。

过基因工程手段生产木聚糖酶是其工业化应用的有

并效途径。短小芽孢杆菌木聚糖酶基因已经被克隆，

被尝试在多种表达系统中进行重组表达，但在各种尝试中表达活力均很低，具有产业化前景的高效表达未见报道。对于短小芽孢杆菌来源的木聚糖酶基因，在较低pH值的培养条件下表达产物稳定性会受到影响，因此该酶基因不大适于偏酸性的酵母表

研究得比较达系统。我们采用的大肠杆菌表达系统，

透彻，培养条件简单，分离纯化工艺成熟，培养周期短，目前仍然是很多外源基因表达最普遍采用的一种表达系统。

pET21a表达载体具有T7强启动子序列。本研究将短小芽孢杆菌的木聚糖酶基因构建到

在pET21a载体上的T7强启动子下游，中实现了高效表达。重组表达木聚糖酶以胞内可溶性蛋

白和包涵体的形式存在，通过低温诱导可显著抑制包涵体的形成。通过对诱导条件的优化，重组表达木聚糖酶在30益诱导8h后活力可达165.51IU/mL

图6.pH值对重组表达木聚糖酶活力的影响Fig.6.EffectofpHonactivityofrecombinantexpressed

xylanase

图7.重组表达木聚糖酶的pH稳定性Fig.7.pHstabilityofrecombinantexpressedxylanase

PDF 文件使用 \"pdfFactory Pro\" 试用版本创建 www.fineprint.cn

第4期刘伟丰等:短小芽孢杆菌茁-1,4-木聚糖酶基因在大肠杆菌中的高效表达

.AgricBiolChem,1983,47:957~963

459

培养物，其表达活力在国内外达到较高水平。2003年江正兵等[7]报道利用毕赤酵母表达系统对短小芽孢杆菌木聚糖酶进行表达，表达活力仅为11.63

利用表达IU/mL，而在国外相关研究报道中，

系统表达短小芽孢杆菌木聚糖酶基因，重组表达活力很低[5]。

短小芽孢杆菌木聚糖酶基因全长687bp，其中

扩增出有81bp为信号肽编码序列[4]。在本研究中，

的基因长606bp，去除了信号肽编码序列，并

使采用了融合表达方式，基因在中获

得了很高的表达量。重组表达木聚糖酶的最适温度为55益,最适pH为6.5，与文献报道的短小芽孢杆菌木聚糖酶性质完全一致，说明酶分子N端的融合肽没有影响其最适温度和最适pH。重组表达木聚糖酶在常温条件下表现出很好的稳定性，在pH11.0时仍保持50%以上的酶活力，具有良好的耐碱特性。重组表达木聚糖酶的降解产物以三糖、四糖和五糖为主。

本研究成功地实现了短小芽孢杆菌木聚糖酶基因的高效表达，为该基因的进一步研究和应用奠定了基础。通过对短小芽孢杆菌木聚糖酶基因的重组

比表达，在短时间内可获得高水平的木聚糖酶产量，

原始菌的产酶时程大大缩短，具有潜在的工业化应用前景。本研究期望通过进一步完善发酵和分离纯化工艺，以及采用高密度发酵培养等策略，实现木聚糖酶的最大产率。

4FukusakiE,PanbangredW,ShinmyoA,etal.Thecompletenucleotidesequenceofthexylanasegene(

.FEBSlett,1984,171:197~201

5PanbangredW,KondoT,NegoroS,etal.Molecularcloningofthegenesforxylandegradationoftheirexpressionin192：335~341

6NuyensF,ZylWH,IserentantD,etal.Heterologousexpres-sionoftheintheyeast

Biotechnol,2001,56:431~434

7JiangZ-B(江正兵),SongH-T(宋慧婷),MaL-X(马立新).Secretedexpressionof

xylanasesgenein

ChinJ

andstudyonenzymaticproperties.

Englishabstract)

8LiuX-M(刘相梅),QiM(祁蒙),WuZ-H(吴志红),etal.Studyonalkali-tolerantxylanasegenefrom

A-30.ChinJApplEnvironBiol(应用与环境生物学报),2001,7:61~65(inChinesewithEnglishabstract)

9SambrookJ,FritschEF,ManiatisT.MolecularCloning.aLaboratoryManual.2nded.NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,19.

10MurrayAW,ThompsonWF.Rapidisolationofhigh-molec-ular-weightplantDNA.NuclAcidsRes,1980,8:4321~432511Laemmli.CleavageofstructuralproteinsduringtheassemblyoftheheadofbacteriophageT4.Nature,1970,227:680~685

endo-beta-xylanase(

.)gene

ApplMicrobiol

and

.MolGenGenet,1983,

)of

Biotech(生物工程学报),2003,19:50~55(inChinesewith

参考文献

12LowryOH,RosebroughNJ,FarrAL,etal.Proteinmea-surementwiththeFolinphenolreagent.JBiolChem,1951,193:265~275

13MillerGL.Useofdinitrosalicylicacidreagentfordetermi-nationofreducingsugar.AnalChem,1959,31:426~42814StahlE,KaltenbachUL.SugarsandDerivativesThinLayerChromatography(aLaboratoryHandbook).Springer-Verlag,1965.

15LinL(林鹿),ZhanH-Y(詹怀宇).BiotechnologyinthePulpandBleaching.Beijing:ChinaLightIndustryPress,2002.(inChinese)

NewYork:

1BegQK,KapoorM,MahajanL,etal.Microbiolxylanasesandtheirindustrialapplications:Areviews.ApplMicrobiolBiotechnol,2001,56:326~338

2ChenH-G(陈红歌),YanZ-Z(严自正),ZhangS-Z(张树政),etal.Screeningofacidicxylanasesproducingstrainandstud-iesonitsenzymeproductionconditions.ActaMicrobialSin(微生物学报),1999，39:350~3(inChinesewithEnglishabstract)

3PanbangredW,ShinmyoA,KinoshitaS,etal.Purificationandpropertiesofendoxylanaseproducedby

PDF 文件使用 \"pdfFactory Pro\" 试用版本创建 www.fineprint.cn