棕竹炭疽病病原菌的分离鉴定

ＳｕｂｔｒｏｐｉｃａｌＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＲｅｓｅａｒｃｈ

樊改丽.棕竹炭疽病病原菌的分离鉴定[Ｊ].亚热带农业研究ꎬ２０１９ꎬ１５(２):１２７－１３１.

第１５卷第２期

２０１９年５月

ＦＡＮＧａｉｌｉ.ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐａｔｈｏｇｅｎｃａｕｓｉｎｇａｎｔｈｒａｃｎｏｓｅｏｎＲｈａｐｉｓｅｘｃｅｌｓａ[Ｊ].ＳｕｂｔｒｏｐｉｃａｌＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＲｅｓｅａｒｃｈꎬ２０１９ꎬ１５(２):１２７－１３１.

棕竹炭疽病病原菌的分离鉴定

樊改丽

(厦门市绿化中心/厦门市森林病虫害防治技术站ꎬ福建厦门３６１００４)

摘要:[目的]明确引起棕竹叶片炭疽病的病原菌种类ꎮ[方法]通过常规组织分类法、形态学方法以及多基因系统发育方法对棕竹炭疽病进行分离鉴定ꎮ[结果]从棕竹病叶上分离的病原菌可以侵染有伤的棕竹叶片并引发炭疽病ꎻ多基因系统发育树分析表明ꎬ该病原菌与暹罗刺盘孢菌株聚为一类ꎮ[结论]引起棕竹炭疽病的病原菌为胶孢炭疽菌(Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ)类群中的暹罗刺盘孢菌(Ｃ.ｓｉａｍｅｎｓｅ)ꎮ关键词:棕竹ꎻ炭疽病ꎻ病原菌ꎻ多基因系统发育树中图分类号:Ｓ４３２.１

文献标识码:Ａ

文章编号:１６７３￣０９２５(２０１９)０２￣０１２７￣０５

ＤＯＩ:１０.１３３２１/ｊ.ｃｎｋｉ.ｓｕｂｔｒｏｐ.ａｇｒｉｃ.ｒｅｓ.２０１９.０２.０１０

ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐａｔｈｏｇｅｎｃａｕｓｉｎｇａｎｔｈｒａｃｎｏｓｅｏｎＲｈａｐｉｓｅｘｃｅｌｓａ

(ＸｉａｍｅｎＧｒｅｅｎｉｎｇＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎＣｅｎｔｅｒ/ＸｉａｍｅｎＦｏｒｅｓｔＰｅｓｔＣｏｎｔｒｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＳｔａｔｉｏｎꎬＸｉａｍｅｎꎬＦｕｊｉａｎ３６１００４ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:[Ｐｕｒｐｏｓｅ]ＴｏｉｄｅｎｔｉｆｙｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｃａｕｓｉｎｇａｎｔｈｒａｃｎｏｓｅｏｎＲｈａｐｉｓｅｘｃｅｌｓａ.[Ｍｅｔｈｏｄ]Ｔｈｒｅｅｍｅｔｈｏｄｓｗｅｒｅｕｓｅｄꎬｉｎｃｌｕ￣ｄｉｎｇｔｈｅｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｔｉｓｓｕｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎꎬｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇａｎｄｍｕｌｔｉ￣ｇｅｎｅｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅａｎａｌｙｓｉｓ.[Ｒｅｓｕｌｔ]Ｔｈｅｉｓｏｌａ￣ｔｅｄｐａｔｈｏｇｅｎｃｏｕｌｄｉｎｆｅｃｔｔｈｅｄａｍａｇｅｄｌｅａｖｅｓｏｆＲ.ｅｘｃｅｌｓａａｎｄｃａｕｓｅａｎｔｈｒａｃｎｏｓｅ.ＰｏｌｙｇｅｎｉｃｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅａｎａｌｙｓｉｓｆｏｕｎｄｔｈａｔｔｈｅｗａｓＣ.ｓｉａｍｅｎｓｅ.

ＦＡＮＧａｉｌｉ

ｐａｔｈｏｇｅｎａｎｄＣｏｌｌｅｔｏｒｉｃｈｕｍｓｉａｍｅｎｓｅｗｅｒｅｇｒｏｕｐｅｄｉｎｔｏｏｎｅｂｒａｎｃｈ.[Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ]ＴｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｃａｕｓｉｎｇａｎｔｈｒａｃｎｏｓｅｏｎＲ.ｅｘｃｅｌｓａＫｅｙｗｏｒｄｓ:Ｒｈａｐｉｓｅｘｃｅｌｓａꎻａｎｔｈｒａｃｎｏｓｅꎻｐａｔｈｏｇｅｎꎻｐｏｌｙｇｅｎｉｃｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅ

炭疽菌属(ＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍＣｏｒｄａ)真菌是一类分布广泛的植物病原菌ꎬ可危害橡胶树、茶树、茉莉、辣椒、芒果等上百种植物ꎬ是多种粮食作物及经济作物的重要致病菌ꎮ胶孢炭疽菌(Ｃ.ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ)复合种分为２２个种和１个亚种[１]ꎬ暹罗刺盘孢菌(Ｃ.ｓｉａｍｅｎｓｅ)是胶孢炭疽菌复合种中的一种ꎬ２００９年由Ｐｒｉｈａｓｔｕｔｉ引起的苹果[３]、草莓[４]、油茶[５]、海南台农芒果[６]、菠萝蜜[７]炭疽病等ꎮ

ｅｔａｌ[２]从泰国健康咖啡浆果和病果上分离得到ꎮ由暹罗刺盘孢菌引起的经济作物炭疽病报道比较多ꎬ如

棕竹(Ｒｈａｐｉｓｅｘｃｅｌｓａ)也称观音竹、棕榈竹等ꎬ原产于我国东南和西南地区ꎬ为棕榈科棕竹属的常绿丛

生灌木ꎮ现约有２０种棕竹属植物ꎬ分为大叶棕竹、细叶棕竹、中叶棕竹、花叶棕竹和多裂棕竹等[８]ꎮ近年来ꎬ棕榈科植物种植越来越广泛ꎬ随之而来的棕竹病害发生也逐渐增加[９]ꎮ棕竹病害的发生不仅严重影及防治的研究鲜见报道ꎮ

本文对厦门市植物园、公园及道路绿化带常见的棕竹叶斑病进行采样ꎬ采用形态学特征与分子系统发育相结合的方法进行分离鉴定ꎬ以期为棕竹炭疽病的化学防治及生物防治提供参考ꎮ

收稿日期:２０１９－０３－２３

基金项目:福建省住房和城乡建设厅(２０１７￣Ｋ￣９０)ꎻ厦门市科技惠民项目(３５０２Ｚ２０１７４０５６)资助ꎮ

第一作者简介:樊改丽(１９８４—)ꎬ女ꎬ博士ꎮ研究方向:植物保护、林业检疫性有害生物防治和园林病虫害防治ꎮＥｍａｉｌ:ｆａｎｇａｉｌｉ２００３＠１６３.ｃｏｍꎮ

响了棕竹的健康生长和观赏价值ꎬ同时对其他棕榈科植物造成潜在危险ꎮ而当前有关棕竹病害分离鉴定

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亚　热　带　农　业　研　究第１５卷

１　材料与方法

１.１　病样的采集及病原菌的分离纯化

的病害叶片样品ꎬ标记后装入干净样品袋中ꎬ带回实验室进行病原菌的分离ꎮ将组织样品剪成约５ｍｍ的组织块ꎬ放置于装有体积分数为７５％酒精的烧杯中ꎬ缓慢振荡１ｍｉｎꎬ用灭菌蒸馏水冲洗３次ꎬ用无菌滤纸吸干组织表面水分ꎬ将样品放到马铃薯葡萄糖琼脂(ＰＤＡ)培养基(加入０.０５ｇ􀅰ｍＬ－１链霉素)中ꎬ每皿放置２块ꎮ４~５ｄ后观察纯化平板的菌落是否为纯的单菌落ꎮ若为单菌落ꎬ则纯化完成ꎻ若不是ꎬ则继续纯化ꎬ直至每个平板上的菌落皆为单菌落ꎮ对纯化好的菌落(培养６~７ｄ)进行拍照后ꎬ用体积分数为２５％甘油进行保菌ꎬ存于－８０℃冰箱备用ꎮ１.２　病原菌致病性测试

取棕竹幼嫩及成熟健康的叶片ꎬ用自来水冲洗３次ꎬ用吸水纸吸干表面水分ꎻ培养皿内铺上湿润的滤纸ꎬ将叶片用接种刀轻轻刮伤表皮形成造伤叶片ꎬ将无造伤和造伤叶片放置于滤纸上ꎻ在每片叶片上接种带孢子的菌丝块(５ｍｍ)ꎬ以未接种的叶片作为对照组ꎻ盖好盖子后置于恒温光照培养箱中培养１０ｄꎬ定期观察发病情况并记录结果ꎬ待发病后从病组织处再次分离病原菌ꎮ１.３　病原菌形态学鉴定

对病害叶片进行室内观察ꎬ将具有明显特征的样品(叶片正面或背面可以看见明显的小黑点等颗粒状物质)拿到体视镜(奥林巴斯ＳＺＸ１６)下拍照ꎮ之后进行切片和镜检ꎬ在显微镜(奥林巴斯ＢＸ￣５３)下观察该病原菌的形态特征ꎬ并进行拍照和测量ꎬ完成病原菌的初步鉴定ꎮ对供试菌株进行形态观察鉴定ꎬ将分离纯化的菌株进行培养、定期观察并测定生长速率ꎻ当菌丝表面出现橘黄色物质时ꎬ则该菌开始产孢ꎬ此时将菌株在体视镜下拍照ꎻ用挑针挑取产孢结构和适量孢子ꎬ在显微镜下观察菌丝形态、产孢结构、孢子形态特征ꎬ记录并进行拍照和测量ꎮ１.４　病原菌分子生物学鉴定

１.４.１　病原菌ＤＮＡ的提取及多基因ＰＣＲ扩增　将供试菌株在ＰＤＡ培养基上培养５~７ｄꎬ收集菌丝团块ꎬ冷冻干燥后ꎬ采用ＤＮＡ快速提取法提取真菌基因组ＤＮＡ[１０]ꎮ并对获得的ＤＮＡ进行多基因ＰＣＲ扩增ꎮ钙调蛋白基因(ＣＡＬ)及几丁质合成酶基因(ＣＨＳ￣１)ꎮ扩增引物如表１所示ꎮ扩增后５μＬＰＣＲ产物加到增产物回收ꎬ并送至上海铂尚生物技术有限公司进行测序ꎮ

扩增基因包括核糖体内转录间隔区基因(ＩＴＳ)、３￣磷酸甘油醛脱氢酶基因(ＧＡＰＤＨ)、肌动蛋白基因(ＡＣＴ)、１％琼脂糖凝胶中进行电泳检测ꎮ当条带明亮清晰、无杂带ꎬ且条带大小与所扩基因片段大小相同时ꎬ将扩

Ｔａｂｌｅ１　ＤｅｔａｉｌｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｎＰＣＲｐｒｉｍｅｒｓａｎｄｔｈｅｌｅｎｇｔｈｏｆａｍｐｌｉｃｏｎｓ

基因ＩＴＳＧＡＰＤＨＣＡＬＣＨＳ￣１ＡＣＴ

引物ＩＴＳ￣１ＦＩＴＳ￣４ＧＤＦＧＤＲ

引物序列(５′－３′)ＣＴＴＧＧＴＣＡＴＴＴＡＧＡＧＧＡＡＧＴＡＡＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣＧＣＣＧＴＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＴＴＣＡＴＴＧＡＧＡＡＴＴＣＡＡＧＧＡＧＧＣＣＴＴＣＴＣ

退火５６℃/４５ｓ６０℃/３０ｓ５６℃/６０ｓ５８℃/３０ｓ５６℃/３０ｓ

片段长度/ｂｐ

５６０２４０７５０２５０２５０

２０１７年７月ꎬ在厦门市植物园、公园和道路绿化带进行棕竹病害调查ꎮ采集有明显黄褐色、黑色斑点

表１　ＰＣＲ引物及扩增片段长度信息

ＣＬ１ＣＣＬ２ＣＣＨＳ￣７９Ｆ

ＧＧＧＴＧＧＡＧＴＣＧＴＡＣＴＴＧＡＧＣＡＴＧＴＣＴＴＣＴＧＣＡＴＣＡＴＧＡＧＣＴＧＧＡＣＡＴＧＴＧＣＡＡＧＧＣＣＧＧＴＴＴＣＧＣＴＡＣＧＡＧＴＣＣＴＴＣＴＧＧＣＣＣＡＴＴＧＧＧＧＣＡＡＧＧＡＴＧＣＴＴＧＧＡＡＧＡＡＧＴＧＧＡＡＧＡＡＣＣＡＴＣＴＧＴＧＡＧＡＧＴＴＧ

ＣＨＳ￣３４５ＲＡＣＴ￣５２１ＦＡＣＴ￣７８３Ｒ

１.４.２　ＤＮＡ序列分析　将获得的供试菌株测序序列用ＢｉｏＥｄｉｔ软件进行序列修正ꎬ在ＮＣＢＩ(ｈｔｔｐｓ://

第２期樊改丽:棕竹炭疽病病原菌的分离鉴定

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ｂｌａｓｔ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/Ｂｌａｓｔ.ｃｇｉ)中进行Ｂｌａｓｔ比对ꎬ得到初步的比对结果ꎮ选用Ｗｅｉｒｅｔａｌ[１]鉴定的胶孢炭系统发育进化树的构建和注释[１１]ꎮ

疽菌复合种中的模式菌株以及从ＮＣＢＩ比对中选取相应种的序列作为参考序列ꎬ采用ＭＥＧＡ７.０软件进行

２　结果与分析

２.１　病原菌分离及致病性测定

在厦门市植物园、公园和道路绿化带采集大叶棕竹病害样品ꎬ分离纯化出９株单菌株ꎮ９株单菌落菌株在ＰＤＡ培养基上的生长速度与菌落形态特征一致ꎬ均从叶尖、叶缘及叶片中部发病ꎬ初期为褐色或黑色小斑点ꎬ随后病斑扩展形成不规则形病斑或梭形病斑ꎬ发病中期可见明显的病健交界ꎬ严重时造成叶片缺刻(图１Ａ)ꎮ致病性测定表明ꎬ用菌丝块接种１０ｄ后发现造伤接种叶片有明显病斑产生(图１Ｂ)ꎬ并能从病斑处分离到与原接种菌一致的菌株ꎬ且所产生的分生孢子与原接种菌株形态、大小一致ꎬ说明供试菌株为棕竹叶斑病的病原菌ꎻ而无伤接种的叶片(ＣＫ)未表现病征(图１Ｃ)ꎬ说明供试菌株可以从伤口处侵染棕竹叶片ꎮ

Ａ.自然发病ꎻＢ.造伤叶片发病ꎻＣ.无伤叶片(ＣＫ)ꎮＦｉｇｕｒｅ１　ＬｅａｆｓｙｍｐｔｏｍｓｏｆＲ.ｅｘｃｅｌｓａａｎｔｈｒａｃｎｏｓｅ

图１　棕竹叶片炭疽病症状

２.２　形态学鉴定

　　对分离菌株进行形态学特征鉴定ꎮ在ＰＤＡ平板上ꎬ菌落正面菌丝为白色或灰色绒毛状ꎬ菌落中间菌丝繁茂ꎬ边缘菌丝稀疏ꎻ菌落背面白色、淡褐色、淡黄色ꎮ在光周期１２ｈ、２８℃条件下培养ꎬ７ｄ后菌落直径为４.４~５.２ｃｍ(图２)ꎻ１５ｄ后可在菌落表面形成肉眼可见的橘黄色分生孢子堆(图３Ａ)ꎮ显微镜下观察ꎬ分生孢子盘为褐色或灰褐色ꎬ分生孢子梗无色(图３Ｂ)ꎻ分生孢子为单孢、无色、长椭圆状、圆柱状、两端稍顿或一端尖顿ꎻ一些孢子内含２个油球ꎻ分生

图２　棕竹炭疽菌在ＰＤＡ培养基上的菌落生长形态

Ａ.正面ꎻＢ.背面ꎮ

Ｆｉｇｕｒｅ２　ＣｏｌｏｎｙｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆＲ.ｅｘｃｅｌｓａａｎｔｈｒａｃｎｏｓｅｏｎＰＤＡｐｌａｔｅ

孢子大小为(１２.９２~１５.６３)μｍ×(４.７７~５.８４)μｍꎬ平均为１３.９３μｍ×５.５５μｍꎬ长宽比为２.５１(图３Ｃ)ꎮ此鉴定结果与野外采集样品徒手切片鉴定到的菌落菌丝、分生孢子等具有相同的形态学特征ꎮ

Ａ.分生孢子堆ꎻＢ.分生孢子盘和分生孢子梗ꎻＣ.分生孢子ꎮ

Ｆｉｇｕｒｅ３　ＭｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＲ.ｅｘｃｅｌｓａａｎｔｈｒａｃｎｏｓｅｃｏｎｉｄｉｏｐｈｏｒｅｈｅａｐｓａｎｄｃｏｎｉｄｉａｓｐｏｒｅｓ

图３　棕竹炭疽菌菌落孢子堆及孢子形态特征

􀅰１３０􀅰

２.３　分子生物学鉴定及系统发育分析

亚　热　带　农　业　研　究第１５卷

将供试菌株进行ＩＴＳ基因序列扩增ꎬ并对片段测序ꎬ通过ＮＣＢＩＢｌａｓｔ同源性比对ꎬ发现病原菌株序列与胶孢炭疽菌复合种中的暹罗刺盘孢菌小种序列相似度为１００％ꎮ为进一步确定鉴定结果ꎬ本研究选取真菌鉴定常用的ＡＣＴ、ＣＡＬ、ＣＨＳ￣１和ＧＡＰＤＨ共４个单基因序列引物对病原菌进行扩增ꎮ测序结果在ＮＣ￣１００％、９９.７％、９９.２％和１００％ꎮ在ＩＴＳ、ＡＣＴ、ＣＡＬ、ＣＨＳ￣１和ＧＡＰＤＨ５个基因序列的基础上ꎬ通过构建多基因系统发育树ꎬ发现病原菌菌株与暹罗刺盘孢菌株聚为一类(图４)ꎮ结合病原菌菌落特征、显微镜下形态学特征以及分子生物学鉴定结果ꎬ本研究将棕竹炭疽病病原菌鉴定为暹罗刺盘孢菌ꎮ

ＢＩ中进行比对表明ꎬＡＣＴ、ＣＡＬ、ＣＨＳ￣１和ＧＡＰＤＨ４个单基因序列与数据库中暹罗刺盘孢菌相似性分别为

图４　基于ＩＴＳ、ＡＣＴ、ＣＡＬ、ＣＨＳ￣１和ＧＡＰＤＨ基因序列构建的多基因系统发育树

３　讨论与结论

Ｆｉｇｕｒｅ４　ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＩＴＳꎬＡＣＴꎬＣＡＬꎬＣＨＳ￣１ａｎｄＧＡＰＤＨｇｅｎｅｓ

本研究对引起厦门市植物园、公园及道路绿化带的大叶棕竹炭疽病的病原菌进行了分离与鉴定ꎮ病原菌形态学特征观察及单基因与多基因联合的系统发育分析表明ꎬ引起厦门市棕竹炭疽病的病原菌为胶孢炭疽菌复合种小种暹罗刺盘孢菌(Ｃ.ｓｉａｍｅｎｓｅ)ꎮ该病菌可以侵染棕榈科植物棕竹ꎬ造成棕竹炭疽病ꎬ属于国内棕榈科植物中鉴定到暹罗刺盘孢菌的首次报道ꎮ

林业和园林植物由暹罗刺盘孢菌引起的炭疽病研究相对较少ꎮ２０１７年李沛利等[１２]鉴定了暹罗刺盘孢菌可以引起成都市园林观赏植物鹅掌柴的炭疽病ꎻ徐明珠等[１３]首次分离鉴定了暹罗刺盘孢菌可引起荆州市香樟树炭疽病ꎮ吴奉奇[１４]研究表明ꎬ广东省肇庆市北岭山降香黄檀、樟树、闽楠、火力楠、贝壳杉和格木炭疽病均由暹罗刺盘孢菌引起ꎮ李河等[１５]研究发现ꎬ从油茶林及其附近的植被分离到的炭疽菌均可以侵染油茶ꎬ说明不同寄主植物上分离的炭疽菌均可能成为油茶炭疽病的潜在侵染源ꎮ综上表明ꎬ暹罗刺盘孢炭疽菌是一种分布广泛的真菌病害ꎬ在高温高湿的热带和亚热带地区分布更广ꎬ其寄主种类繁多ꎬ可以侵染多种植物从而引起植物炭疽病ꎮ

李沛利等[１２]研究发现ꎬ暹罗刺盘孢菌侵染鹅掌柴叶片时ꎬ用砂纸擦拭鹅掌柴叶片更容易致病ꎻ刘威[１６]在研究茶树炭疽病时也发现ꎬ暹罗刺盘孢菌通过伤口侵染茶树叶片ꎮ本研究致病性试验发现ꎬ在造伤接种的情况下ꎬ暹罗刺盘孢菌可以成功侵染棕竹ꎮ茶树、鹅掌柴和棕榈科植物叶片蜡质都较厚ꎬ这可能是其不容易侵染的原因ꎮ由此可见ꎬ在棕竹等园林植物栽培过程中ꎬ应尽量减少机械损伤和人为伤害ꎬ修剪枝叶的工具要经常消毒ꎬ以减少病菌侵染的几率和降低病害的流行ꎮ

致谢:福建农林大学植物保护学院胡红莉老师对本研究病原菌测序及鉴定进行指导ꎬ谨此致谢ꎮ

参考文献

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第２期

７３:１１５－１８０.

樊改丽:棕竹炭疽病病原菌的分离鉴定

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(责任编辑:陈幼玉)