鱼类培养细胞抗病毒基因差减cDNA文库的构建

水生生物学报

ACTAHYDROBIOLOGICASINICA

Vol.27,No.2Mar.,200 3

鱼类培养细胞抗病毒基因差减cDNA文库的构建

张义兵 石耀华 桂建芳

(中国科学院水生生物研究所;淡水生态与生物技术国家重点实验室,武汉 430072)

摘要:紫外线灭活的草鱼出血病病毒(GCHV)能诱导鲫囊胚培养细胞(CAB)产生高滴度的干扰素,从而诱导宿主细胞基因表达的改变并处于抗病毒状态。提取灭活病毒诱导未经病毒诱导的CAB细胞mRNA,利用抑制性差减杂交技术,成功构建了鱼类培养细胞抗病毒基因差减cDNA文库。以鲫管家基因A-tubulin和B-actin作为差减指标,检测差减cDNA文库的差减效率分别高达215和27倍,表明经过病毒诱导后的细胞中,某些差异表达基因的富集效率也接近215倍。鱼类抗病毒基因差减cDNA文库的建立对快速分离、克隆鱼类抗病毒相关基因和认识鱼类细胞抗病毒免疫的分子机理有重要意义。

关键词:鱼类;草鱼出血病病毒;抗病毒相关基因;诱导;抑制性差减杂交

中图分类号:S941141 文献标识码:A 文章编号:1000-3207(2003)02-0113-006

鱼类病毒病是严重影响当今世界水产养殖产量的主要制约因素之一。长期以来对鱼类病毒病仍无有效的防治方法,较为成功的是使用疫苗。目前能够用于养殖的病毒疫苗极为有限,而且某些疫苗虽能有效控制病毒病,但仍然不能彻底根治鱼类病毒病的危害。使用疫苗除费时、费力,不适于大面积水面养殖外,还可能由于病毒抗原漂移和新毒株的出现、以及母源抗体的干扰等原因导致疫苗接种失败[1,2]。而分离鱼类自身抗病毒基因、构建转基因鱼,可能是彻底解决鱼类病毒病的最为理想途径。

然而,在鱼类目前不仅没有得到有效的抗病毒基因,而且对鱼类感染病原后的免疫机制也缺乏了解和认识。抑制性差减杂交(SuppressionSubtrac-tiveHybridzation,SSH)技术常用于快速分离和克隆差异表达基因[3)

5]

[1][1]

疫反应的基因或抗病毒基因,丰富鱼类抗病毒免疫机理的认识,而且克隆的抗病毒基因可以直接应用

于鱼类基因工程的抗病毒育种探索。本文报道运用SSH技术建立鱼类抗病毒基因差减cDNA文库的结果。

1 材料与方法

111 细胞与病毒 鲫囊胚细胞系(Blastulaeembry-oniccellsofcruciancarp,CAB)由本实验室建立[9],草鱼肾细胞系[Kidneyofgrasscarp(Ctenopharyngodonidellus),CIK]由中国水产科学院长江水产研究所建立[10]。细胞用10%新生牛血清(杭州四季青产品,使用时56e灭活30min)的TC-199(GIBCO产品)培

[9]

养基置28e培养。草鱼出血病病毒(Grasscarphemorrhagevirus,GCHV)[11]在CIK细胞上扩增并检测病毒滴度。

112 GCHV紫外线照射灭活 CAB细胞干扰素用紫外线灭活的GCHV诱导,采用本实验室的灭活装置和方法[6]。病毒灭活前先进行初步纯化:6000r/min、4e离心20min,收集上清,然后24000r/min,4e超速离心115h,病毒沉淀用适量无血清199培养基稀释,继续6000r/min离心20min取上清得纯化病毒。然后用紫外线照射灭活5min。常规方法测定病毒灭活前后的

。近年来的研究表明,紫外线灭活

[6]

的草鱼出血病病毒能诱导多种鲤科鱼类培养细胞高效表达干扰素(Interferon,IFN),粗制鲫干扰素对草鱼出血病有较好的防治作用[7]。同哺乳类TypeIIFN一样,鲫干扰素具有广谱抗病毒活性,其抗病毒机制在于诱导宿主细胞基因表达的改变,包括一系列抗病毒基因的表达,致使细胞处于抗病毒状态[1,8]。利用SSH技术构建鱼类抗病毒基因cDNA文库,不仅能快速扫描、鉴定鱼类对病毒感染引起免

收稿日期:2001-12-01;修订日期:2002-11-11

基金项目:国家自然科学基金(30200207);武汉青年科技晨光计划(20015005055)资助

作者简介:张义兵(1969)),男,湖北省仙桃市人;遗传学硕士;主要从事鱼类遗传学和分子免疫学的研究通讯作者:桂建芳,E-mail:jfgui@ihb.ac.cn

114 水 生 生 物 学 报27卷

滴度,检测病毒灭活效率。

113 培养细胞总RNA的提取及mRNA的纯化CAB细胞传代于25cm2培养瓶,置28e培养4d成致密单层。去掉细胞培养上清液,用无血清培养基洗1次,每瓶加入015mL紫外线灭活的GCHV,28e吸附4h。对照细胞每瓶加入015mL的培养基。去掉病毒诱导液,用无血清培养基洗3次,再加入无血清培养基,28e继续培养细胞12h,收集细胞培养上清液,以孔径为10nm的微孔滤器过滤细胞碎片,采用微量细胞病变(CPE)抑制法检测干扰素滴度[6]。病毒诱导或未经诱导的CAB细胞采用CsTFA超速离心法提取总RNA(PharmaciaRNAExtractionKit),PolyARNA用生物素标记的寡聚(dT)探针和链亲合素包裹的磁珠纯化(PolyATractmRNAIsolationsystem(Promega))。总RNA和mRNA用分光光度计测定浓度。

114 抑制性差减杂交和抗病毒基因差减cDNA文库的构建 按本实验室已经报道的方法[3)

5]

+

NA文库的构建。

制备差减cDNA的同时,也制备未差减cDNA以检测差减文库的差减效率。未差减的cDNA的制备是:在制备TestercDNA连接两种接头时,将刚加好样还没有进行连接反应的Tester-1和Tester-2cDNA各取2LL混合,然后进行连接反应完成。未差减的cDNA不进行差减杂交。

115 接头连接效率和差减效率的检测 检测TestercDNA的接头连接效率时以管家基因A-tubulin为指标。以鲫A-tubulin的特异上游引物(5cGTGCACTG-GTCTTCAGGGGTT3c)和下游引物(5cGGGAAGTGGAT-GCGTGGGTAT3c)为一个组合、以及试剂盒提供的接头引物PCRprimer1(5cCTAATACGACTCACTATAGG-GC3c)和A-tubulin的下游引物为一个组合进行PCR扩增,比较不同引物组合扩增产物的大小及产量,鉴定连接效率的优劣。PCR反应条件为:94e5min,然后94e30s,50e30s,72e1min扩增30个循环。检测差减cDNA文库的差减效率以管家基因A-tubulin和B-actin为指标。B-actin基因的上游引物和下游引物序列分别为:5cCACTGTGCCCATC-TACGAG3c,5cCCATCTCCTGCTCGAAGTC3c。PCR反应条件同上,只是反应循环数因具体情况而定。116 差减文库cDNA片段大小检测 将制备的差减cDNA直接连接到pGEM-T质粒载体(Promega),即得到差减cDNA质粒文库。转化大肠杆菌JM109,在X-gal/IPTG琼脂平板上随机挑选白色菌落37e培养2h以上。取1LL菌液,以差减试剂盒提供的引物Nested1和Nested2R在25LL体系PCR检测插入片段大小。PCR扩增参数为:94e15s,65e30s,72e2min共30个循环。2 结果

211 培养细胞抗病毒状态的诱导及检测

选6瓶生长状态良好、传代4d的CAB细胞,其中3瓶细胞用灭活病毒诱导干扰素,另外3瓶细胞同期加入等体积的无血清培养基作无病毒诱导对照。细胞诱导4h后去掉诱导液或培养基,加入新鲜的无血清培养基继续培养12h,然后提取细胞总RNA。

干扰素滴度参照本实验室方法进行[6,8]。将培养细胞上清液按3@比例稀释加入96孔微孔板,28e保护细胞10h,然后每孔加入10000TCID50/mL病毒011mL,两天后观察结果。病毒诱导的培养基中干扰素滴度高达2500U/mL,对照细胞培养液抗病,采用

+

PCR-SelectcDNASubtractionKit(Clontech)进行差减杂交。以紫外线灭活GCHV诱导过的细胞PolyARNA制备TestercDNA,未经病毒诱导的细胞PolyA+RNA平行制备DrivercDNA。DrivercDNA的制备是:2LgPolyA+RNA首先逆转录合成双链cDNA,然后RsaI充分酶切3h后完成。TestercDNA的制备是:2LgPolyA+RNA经逆转录、充分酶切,酶切后的双链cD-NA被分成两份,分别连接两种不同的接头adptor1和adaptor2R后完成Tester-1和Tester-2cDNA。

将成功制备的DrivercDNA和TestercDNA进行两轮杂交。第一轮,过量的DrivercDNA加到每份TestercDNA,98e变性后,68e杂交10h,差异表达基因cDNA片段不与DrivercDNA杂交而形成单链。紧接着进行第二轮杂交,不经变性迅速将两份第一次杂交的样品混合,同时加入变性后的DrivercDNA,混匀后68e继续杂交10h,差异表达的单链cDNA重新退火形成有不同接头末端的双链cDNA。杂交产物再经过两轮PCR反应。第一轮PCR采用Adaptor1和Adaptor2R的共有序列引物PCRPrimerl,扩增参数为:75e5min,然后94e10s,66e30s,72e115min共27个循环,只有杂交形成两端具有不同接头的cDNA片段才能够扩增。第二轮PCR采用的是套式PCR引物(Nestedprimerl和Nestedprimer2R),扩增参数为:94e10s,68e30s,72e115min共10个循环,进一步降低文库背景、指数扩增差异表达cDNA。两轮PCR后即完成抗病毒基因差减cD-

2期张义兵等:鱼类培养细胞抗病毒基因差减cDNA文库的构建 115

毒滴度为0。表明CAB细胞经紫外线灭活的GCHV诱导后已经产生大量的干扰素,而干扰素又重新激活细胞的抗病毒基因表达,处于抗病毒状态[8]。因此,这两种细胞的基因表达已经表现出显著差异,可以提取细胞mRNA进行下一步实验。

212 细胞总RNA的提取

用CsTFA超速离心的方法提取灭活病毒诱导的CAB细胞和未经病毒诱导的对照细胞总RNA,分光光度计测定RNA的OD260/OD280的比值在117以上。琼脂糖凝胶电泳检测,28S、18S条带清晰,且28S浓度大于18S的两倍,RNA弥散带位于015kb以上。表明已经获得纯度和质量都较好的总RNA(图1)。

做PCR,2、4道用Adaptor1和Adaptor2R的共有序列的引物)))PCRPrimer1以及A-tubulin的下游引物

扩增。如果连接成功,则2、4道的PCR产物将大于1、3道。图中所有泳道上样量相同,可见2、4道产物明显大于1、3道,引物组合的PCR扩增产量相近。以上结果显示接头连接效率较高。

图2 PCR检测接头连接效率

M:1kbDNA分子量标准。1、3:用A-tubulin的上游和下游引物做PCR;2、4:用PCRPrimer1以及A-tubulin的下游引物做PCRFig.2 ResultsoftheadaptorligationefficiencyanalysisbyPCRM:1kbDNAmarker.Lanes1and3:PCRproductsaregeneratedbyup-streamanddownstreamprimersofA-tubulin;Lanes2and4:PCRproducts aregeneratedbyPCRprimer1anddownstreamprimerofA-tubulin

图1 经过灭活病毒诱导和未经诱导的CAB细胞总RNAM:K/EcoRÑ+HindÓ双酶切分子量标准。1,2分别为

未经病毒诱导和诱导过的CAB细胞总RNA

Fig.1 TotalRNAsisolatedfromCABcellsinfectedbyUV-inactivated

GCHVandmock-infectedcells

M:K/EcoRÑ+HindÓDNAmolecularweightmarker.Lane1:totalRNAsisolatedfrommock-infectedcells;Lane2:totalRNAsisolatedfrom

CABcellsinducedbyUV-inactivatedGCHV

214 抗病毒基因差减cDNA文库的建立

成功制备的DrivercDNA和TestercDNA按照试剂盒手册的详细步骤分别做两轮杂交和两轮PCR即完成抗病毒基因差减cDNA文库的构建。图3为差减cDNA和未经过差减杂交的cDNA的第一轮和

213 DrivercDNA和TestercDNA的制备

用生物素标记的寡聚探针和链亲合素包裹的磁珠纯化mRNA,分光光度计定量,然后各取2Lg病毒诱导和未经诱导的CAB细胞polyA+RNAs,按照差减试剂盒提供的试剂和步骤逆转录合成双链cDNA,再经RsaI充分酶切双链cDNA后,源于未经诱导的细胞polyARNA的酶切双链cDNA即为DrivercD-NA。而病毒诱导的双链cDNA分为两份后,还需分别加上两种接头adaptor1和adaptor2R才完成Tester-1cDNA和Tester-2cDNA的制备。

加接头的目的是在差减杂交之后可以用特异的引物PCR扩增差异表达基因(即差减杂交中的最后两轮PCR扩增),使差异表达基因、特别是稀有表达基因得到富集,因此是非常关键的一步。图2显示了检测Tester-1cDNA和Tester-2cDNA的接头连接效率的结果。1、3道用A-tubulin的上游和下游引物+

图3 以差减和未经差减的cDNA为模板的两次PCR反应结果M:1kbDNA分子量标准;1和3:第一次PCR扩增产物;2和4:第二次PCR扩增产物。1和2以未差减cDNA为模板;3和4

以经过差减的cDNA为模板

Fig.3 The1stand2ndPCRproductsofbothsubtractedandunsubtrac-tedcDNAastemplates

M:1kbDNAmarker.Lane1and3:1stPCRproductsgeneratedbyun-subtractedandsubtractedcDNAastemplates,respectively;Lane2and4:2ndPCRproductsgeneratedbyunsubtractedandsubtractedcDNAas

templates,respectively

116 水 生 生 物 学 报27卷

第二轮PCR产物电泳图谱。从图中可以看出,经过差减杂交的cDNA的PCR产物主要集中在015)2kb之间,与未经差减的cDNA为模板的两次PCR产物呈现不同的电泳谱带。结果初步显示已经成功建立了抗病毒基因的差减cDNA文库。

215 抗病毒基因差减cDNA文库的差减效率检测

为了检测抗病毒基因差减cDNA文库的差减效率,以鲫管家基因A-tubulin和B-actin做检测指标,通过比较它们在经过差减和未经差减杂交的cDNA中

丰度的相差倍数,以估计差减杂交效率。以没有经过差减的cDNA为模板,A-tubulin基因在18个循环

即可扩增较强的带,而在经过差减杂交的cDNA中直到33个循环后才扩增出非常弱的带(图4A),因此对于A-tubulin基因,差减杂交将其减弱了至少2=2U32000倍,反过来表明差减杂交可能将某些特有的差异表达cDNA富集了同样的倍数。但是,很显然不同的基因富集的倍数不相同,图中显示B-actin基因被差减了近2倍(图4B)。

7

(33-18)

15

图4 以A-tubulin(A)和B-actin(B)为指标PCR检测cDNA文库的差减杂交效率。以未做差减的cDNA(泳道1)4)和差减的cDNA(泳道5)8)为模板,A-tubulin(A)和B-actin(B)的上下游引物作PCR扩增。1和5:18个循

环;2和6:23个循环;3和7:28个循环;4和8:33个循环。M:1kbDNA分子量标记

Fig.4 ReductionofA-tubulin(A)andB-actin(B)abundanceinantiviralcDNAlibrary.PCRanalysiswasperformedonunsubtracted(Lanes1)4)orsubtracted(Lanes5)8)secondaryPCRproductswiththeprimesofbothA-tubulin(A)andB-actin(B),respectively.Lane1andLane5:18cycles;Lane2andLane6:23cycles,Lane3and7:28cycles,Lane

4andLane8:33cycles.M:1kbDNAMarker

216 抗病毒基因差减cDNA文库中cDNA片段大

小的检测

将差减cDNA连接到质粒pGEM-T载体,转化细

菌后,PCR检测质粒插入cDNA片段,大小均在012kb)2kb之间。图5显示随机挑选16个克隆的PCR检测结果。

图5 PCR鉴定抗病毒差减文库中cDNA片段的大小。1)16:从差减文库中随机挑选的克隆。M:1kbDNA

分子量标准

Fig.5 PCRidentificationofthecDNAfragmentsfromtheantiviralsubtractivelibrary.Lanes1)16:The16randomly

pickedcoloniesfromthesubtractivelibrary.M:1kbDNAMarker

3 讨论

要建立成功的抗病毒基因差减cDNA文库,首先要确定用于制备TestercDNA的细胞确实有抗病

毒基因的表达,与制备DrivercDNA的细胞有显著的基因表达差异。以前的实验结果表明,紫外线灭活的GCHV是一种高效的干扰素诱导剂,培养细胞经病毒诱导后,在最初的14h内,细胞培养上清液干扰素滴度急剧上升[6]。病毒诱导的细胞在去掉培养基

后再加入2@10TCID50的GCHV,逐日观察,细胞日趋老化,3d后仍没有发现病毒感染的症状(结果未发表)。这表明经病毒诱导后的细胞,除早期分泌干扰素外,同时也在稍后一段时间内表达抗病毒基因,使细胞处于抗病毒状态[8,12]。事实上,除了病毒直接诱导细胞相关基因的表达外,细胞分泌到培养基中的干扰素可反作用于没有受到病毒感染的细胞表达干扰素诱导的基因,包括抗病毒相关基因,从而使细胞处于抗病毒状态。早期的研究结果表明干扰素

5

2期张义兵等:鱼类培养细胞抗病毒基因差减cDNA文库的构建 117

作用细胞1h就能观察到对细胞的保护[8]。在本实验中,细胞首先经病毒诱导4h后再继续培养了12h,因此抗病毒相关基因应该充分得到表达。

要成功运用SSH技术首先必须有质量和纯度较好的RNA或polyA+RNA,保证反转录合成高质量的双链cDNA。双链cDNA经酶切后,很关键的一步就是TestercDNA的制备,即与人工接头的连接。连接效率高低直接关系到差减杂交的成败,PCR方法可以方便地检测连接效率。作者用不同的引物组合以连接接头后的TestercDNA为模板扩增鲫管家基因A-tubulin,不仅得到了预期大小的产物,而且扩增产量接近(图2),表明连接成功。

PCR方法同样可以方便检测差减文库的差减效率。虽然以差减和未差减过的cDNA为模板,连续作两次PCR,从其扩增产物图谱不一致就能在一定程度上看出差减文库已取得成功,但是检测在病毒诱导和没有诱导的细胞都表达的管家基因的差减倍数,可以定量反映差异表达基因的富集程度。实验中,发现两种管家基因A-tubulin和B-actin在建立的文库中的差减效率有很大不同,A-tubulin被差减了

157近2倍,B-actin差减了近2倍。这表明在差减文库中,由于不同基因的表达量有差异,因此被富集(或差减)的程度是不相同的。这种差异的产生有可能是一种随机性的结果(如在差减杂交后最后两轮PCR时,随机取出了丰度极低、但两端有不同接头的某种管家基因cDNA分子为模板,这样即使经过了抑制性PCR,但如果以这种管家基因作为差减效率的检测指标,可能不会真实反映文库的差减效率),并且在不同的细胞或不同种,由于不同管家基因的表达量的差异,它们的差减程度也会不同。然而不管怎样,本实验中A-tubulin和B-actin较高的差减效率无疑反映了差异表达基因的富集程度,其中就包括抗病毒基因。因此也初步表明所建立的抗病毒基因差减cDNA文库是成功的。

目前,不仅缺乏对病毒感染鱼类机制的了解,而且对感染病毒的鱼类免疫反应机制也认识有限。鱼类对病毒的天然免疫包括组成型和反应型。前者主要包括一些非特异性的、能吞噬感染病毒的毒性细胞,而后者主要是干扰素的作用[13]。在哺乳类,干扰素能诱导宿主细胞许多抑制病毒的蛋白表达,如2c,5c-A合成酶、蛋白激酶P1以及Mx蛋白等。虽然在某些鱼类和鱼类细胞系已经证明有干扰素活性的表达基因[13]

[15,16]

[14]

因[17)

20]

,也没有发现其表达产物有抗病毒作用[18]。

因此克隆鱼类抗病毒免疫相关基因就显得尤为重要,而差减cDNA文库的成功建立将有助于加速分离、鉴定、克隆病毒诱导的鱼类细胞自身抗病毒免疫相关基因。参考文献:

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CONSTRUCTIONOFANTIVIRALSUBTRACTIVEcDNA

LIBRARYOFCULTUREDFISHCELLS

ZHANGY-iBing,SHIYao-HuaandGUIJian-Fang

(InstituteofHydrobiology,TheChineseAcademyofSciences;StateKeyLaboratoryofFreshwaterEcologyandBiotechnology,Wuhan430072)

Abstract:Thevertebrateinterferon(IFN)systemprovidesaninitiallineofdefenseagainstviralinfectionbyinducingthesynthesisofproteinsthatinhibitvirusreplication,butthenormalcellsdonot,asarule,containorsynthesizeIFN.UV-inactivatedGCHVisveryeffectiveforinducingblastulaeembryoniccellsofcruciancarp(CarassiusauratusL.)(CAB)

tosecreteinterferon,whichinturnactinbothautocrineandparacrinefashiontoinducetheexpressionsofinterferonre-sponsivegenesincludingantiviralgenes,andfinallycontributetoformantiviralstatesinhostcells.However,todatelit-tlewasknownabouttheseproteinsandgenes.InordertoanalyzethechangeofgeneexpressionsandisolatetheserelatedgenesinducedoractivatedbyvirusinfectioninCABcells,anantiviralsubtractivecDNAlibraryofCABwasconstructedbyusingSuppressionSubtractiveHybridization(SSH)techniques.Typically,GCHVwaspurifiedandinactivatedunderUVirradiationfor5min,andthenCABcellsweretreatedwithUV-inactivatedGCHV.ThemRNAswereextractedfromvirallyinfectedCABcellsandmock-infectedcells,respectively,andusedforconstructingsubtractivecDNAlibrary.Inthepresentpaper,thequalityofcellularRNAsandadaptorligationefficiencywereanalyzed,andtwohousekeepinggenes,A-tubulinandB-actin,wereusedtoestimatetheefficiencyofsubtractivecDNA.IntheantiviralsubtractivecDNAlibrary,thetwohousekeepinggenesweresubtractedveryefficientlyatappropriate215and27folds,respectively,indicat-ingthatsomedifferentiallyexpressedgenesincludingantiviralgenesinducedbyviralinfectionwerealsoenrichedatthesamefolds.ThesubtractivecDNAswereligatedintothepGEM-TEASYvector(Promega)andfollowingtransfectionintocompetentE.colicells.16colonieswererandomlyselectedfromtheplasmidlibrary,andPCRanlysisshowedthattheinsertedcDNAfragmentswerebetween012)2kbinlength.TheresultssuggectedthattheantiviralsubtractivecDNAl-ibraryisverysuccessful,whichwillbeessentialforrapidisolationoffishantiviralgenesandhelpfulforelucidationofmolecularmechanismoffishinnatedefenseagainstvirulinfectionsinthefuture.Keywords:Fish;Grasscarphemorrhagevirus;Antiviralrelatedgene;Induction;SSH