第１４卷第２０期２００中国矫形外科杂志ＯｒｔｈｏｐｅｄｉｃＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎａＶ０１．１４．Ｎｏ．２００ｃｔ．２００６６年１０月实验研究兔骨髓间充质干细胞复合两种材料体外生物相容性的比较△尹航１，王晓东１，张亚１，张希峰２，刘新晖３，张锡庆１，董寅生４（１．苏州大学附属儿童医院骨科，江苏２１５００３；２．常熟市第二人民医院，江苏；３．河北医科大学附属第一医院，石家庄；４．东南大学材料科学与工程系，南京）摘要：［目的］探讨丝素蛋白和纳米晶羟基磷灰石胶原／骨体外生物相容性，为组织工程寻找理想的载体材料。［方法］体外培养兔骨髓间充质干细胞分别于丝素蛋白和纳米晶羟基磷灰石胶厉ｙ骨体外复合培养，应用扫描电镜、激光共聚焦显微镜，四唑盐比色试验（ＭＴＹ法），观察材料上复合培养的细胞的生物学特性。［结果］兔骨髓间充质干细胞可以在丝素蛋白和纳米晶羟基磷灰石胶原／骨良好的黏附、增殖和生长。两种材料相比较其相容性没有明显的差异。［结论】丝素蛋白和纳米晶羟基磷灰石胶原／骨均具有良好的生物相容性，可以作为组织工程理想的载体材料。关键词：组织工程；中图分类号：Ｒ６８７．３细胞载体；丝素蛋白；纳米晶羟基磷灰石胶原；生物相容性文献标志码：Ａ文章编号：１００５－８４７８（２００６）２０—１５７１－０３Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｓｔｕｄｙｏｎｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｏｆｒａｂｂｉｔｂｏｎｅ玎舶ＩｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｓｃｅＨｓｏｎｔｗｏｓｃａｆｆｏｌｄｍａｔｅｒｉａｌｓ／／ＹＩＮＨａｎｇ，ＷＡＮＧＸｉａｏ・ｄＤ，培，ＺＨＡＮＧＹａ，ｅｔａ１．ＯｒｔｈｏｐｅｄｉｃＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ，Ｃｈｉｌｄｒｅｎ＆ＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＳｕｚｈｏｕＵｎｗｅｒｓｉｔｙ，Ｓｕｚｈｏｕ，２１５００３，ＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔ：［ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ］Ｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｂｉｏｃｏｍｐａｂｉｌｉｔｙｏｆｓｉｌｋｔｏｆｉｂｒｏｉｎ（ＳＦ）ｏｒｎｏｎ—ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ／ｅｏｌｌａｇｅｎ（ＮＨ／Ｃ）ｗｉｔｈｏｕｔａｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ（ＢＭＭＳＣｓ）ｉｎｏｒｄｅｒＢＭＭＳＣｓｏｆｒａｂｂｉｔｗｅｒｅｆｉｎｄｂｅｔｔｅｒｓｃａｆｆｏｌｄｍａｔｅｒｉａｌ．［Ｍｅｔｈｏｄ］ｒ１１ｌｅｔｈｉｒｄｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄｏｎＳＦｏｒＮＨ／Ｃａｎｄｔｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｔｈｅｃｅｌｌｓｅｘａｍｉｎｅｄｕｓｉｎｇｓｃａｎｎｉｎｇｄｅｃ・ｏｎｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｅｏｐｅ，ｌａｓｅｒＳＦｓｃａｎｅｏｎｆｏｃａｌｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅａｎｄＭＴｒｔｅｓｔ．［Ｒｅｓｕｌｔ］－１１ｌｅＢＭＭＳＣｓｏｆｒａｂｂｉｔｇｒｅｗａｎｄｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅｄｗｅｌｌｎｏｂｏｔｈｏｎａｎｄＮＨ／Ｃａｔ４—８ｄ．ｙｓｃｕｌｔｕｒｅｓ．ＴｈｅｒｅｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｈａｖｅｄｅｆｆｅｒｅｎｅｅｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｂｉｏｃｏｍｐａｂｉｌｉｔｙｏｆＢＭＭＳＣｓｏｎＳＦａｎｄＮＨ／Ｃ（Ｐ＞０．０５）．［Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ］ＢｏｔｈＳＦａｎｄＮＨ／ＣｇｏｏｄｂｉｏｃｏｍｐａｂｉｌｉｔｙｗｉｔｈＢＭＭＳＣｓａｎｄｃｏｕｌｄｂｅｕｓｅｄａｓ肋ｉｄｅａｌｓｃａｆｆｏｌｄｍａｔｅｒｉａｌｉｎｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ；ｓｃａｆｆｏｌｄ；ｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎ；ｎｏｎ－ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ／ｃｏｌｌａｇｅｎ；ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ组织工程学是当今医学领域研究的热点之一，骨髓间充质干细胞因为其具有多向诱导分化的特征，被视作理想的种子细胞，对它的研究更是热点中的热点。种子细胞需要复合良好的载体材料，合成细胞／支架结构，进而形成组织结构。因此为骨髓间充质于细胞寻找一种具有良好的生物相容性的载体材料显得尤为重要。这也正是本实验将骨髓间充质干细胞分别与丝素蛋白和纳米晶羟基磷灰石胶厉ｙ骨体外培养，并进行生物相容性对比研究的目的。１材料与方法１．１实验动物江苏省卫生厅１３５工程课题资助（３８ＲＣ２００２０３８）展基金（ＥＥｌ３１０３１）作者简介：尹航（１９７６一），男，哈尔滨人，苏州大学附属儿童医院骨科，在读博士研究生，研究方向为组织工程，（电话）０５１２—６５１５２４５４，（电子信箱）ｆｅｉｄａ０９５＠１２６．ｃｏｍ通信作者：王晓东苏州大学医学发４周龄雄性新西兰大耳白兔４只，１．８—２．０ｋｓ／只（苏州大学动物中心提供），经戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，抽取骨髓５ｍｌ／只，与３Ｊ１】ｌ肝素（６２５Ｕ／ｍ１）混匀。１．２主要材料丝素蛋白（ｓＦ）由苏州大学材料工程学院提供。纳米晶羟基磷灰石胶原／骨（ＮｒｔＡＣ）由清华大学材料系提供。将材料制备成两种规格备用，其中１０描电镜和激光共聚焦，５ｍｍ×５ｍｉｌｌｘ５ｎｌｍ用于扫ｍｍ×５ｍｉｌｌ×Ｉｍｉｌｌ用于ＭＴｒ检测。印Ｃｏｔｔ射消毒备用。试剂与仪器：淋巴细胞分离液（ｐｅｒｃｏＵ，密度为１．０７３ｇ／ｍｌ，上海华美公司），ＤＭＥＭ培养基（Ｇｉｂｃｏ公司，美国），肝素、抗坏血酸、地塞米松、甘油磷酸钠、胰蛋白酶（Ｓｉｇｍａ公司，美国），胎牛血清（杭州四季青公司），多标记免疫分析系统（１４２０，ＷＡＬＬＡＣＢＬＣＴＯＲ２），ＣＯ：培养箱（美国，ＳＨＥＬＬＡＢ），温控离心机（德国，Ｈｅｒａｕｓ），倒置显微镜（重庆重光），免疫荧光显微镜（莱１５７１万方数据 第１４卷第２０期２００中国矫形外科杂志ＯｒｔｈｏｐｅｄｉｃＶ０１．１４．Ｎｏ．２０Ｏｃｔ．２０Ｄ６６年１０月ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎａ卡，德国）。１．３方法１．３．１兔骨髓间充质干细胞（ＲＭＳＣｓ）的培养抗凝骨髓５ｎｄ加入等量Ｈａｎｋｓ液混匀，以１份淋巴细胞分离液上面加２份稀释骨髓的比例２０００ｒ／ｍｉｎ，２０℃，离心３０ｍｉｎ，取有核细胞层，Ｈａｎｋｓ液洗２次，以３×１０６／ｍｌ细胞密度接种于５０ＩＩｌｌ培养瓶，３７℃，５％ＣＯ：，饱和湿度培养，４８ｈ首次换液，以后２—３ｄ换液１次，均为全量换液。当原代细胞培养１５—２０ｄ，细胞占瓶的９０％以上，用（０．２５胰蛋白酶一０．０２ＥＤＴＡ）％液消化３７℃、６ｍｉｎ，，用含１５％新生牛血清的ＤＭＥＭ终止消化，ｌ２００ｒ／ｒａｉｎ离心５ｍｉｎ，弃上清，ｌ：１传代分为２瓶。体外培养至第３代备用。１．３．２材料的准备将２种材料（１０ｍｍｘ５ｌｌｌｍ×５ｍｍ）置入２４孔板，接种前ＰＢＳ湿润１ｈ，再用含１５％新生牛血清的ＤＭＥＭ浸泡１ｈ，吸干水份备用。Ｉ．３．２接种复合将传至第３代的ＲＭＳＣｓ消化离心，制成３×１０６／ｍｌ的细胞悬液接种到两种材料上。ＣＯ：培养箱中复合４ｈ，加入ＤＭＥＭ培养８ｄ。１．３．４扫描电镜两种材料于１、４、８ｄ各取一块标本，２％戊二醛固定，锇酸染色，梯度脱水，喷金，扫描电镜（苏州大学医学院，ＰｈｉｌｉｐｓＸＬ一２０型）上观察摄像。１．３．５激光共聚焦显微镜丝素蛋白复合第３代的ＲＭＳＣｓ，标本接种前ＲＭＳＣｓ行２ｐｅ，／ｎａ丫啶橙染色，ＰＢＳ洗３次，再制成细胞悬液接种在材料上。纳米晶羟基磷灰石胶原／骨，先浸入ｌ％Ｒｂｏｄａｍｉｎｅ溶液中５ｍｉｎ，蒸馏水浸洗３０ｒａｉｎ，烘干，∞ｃｏ放射消毒，复合第３代的ＲＭＳＣｓ，标本接种前ＲＭＳＣｓ行每单位６０ｐ．ｍＤＡＰＩ染色３０ｒａｉｎ，ＰＢＳ洗３次，再制成细胞悬液接种在已Ｒｈｏｄａ・ｍｉｎｅ染色的材料上。１．３．６四唑盐比色试验（ＭＴＩ＂法）测定细胞活性并描绘细胞增殖曲线将两种材料各２４块（５ｍｍ×５ｍｍ×１ｍｍ），置入９６孔板，同上方法接种复合传至第３代的ＲＭＳＣｓ，培养８ｄ。每天２种材料各取３孔，采用ＭＴｒ法测定细胞活性，取其均值描绘细胞增殖曲线。２结果２．１扫描电镜观察丝素蛋白：４ｄ细胞伸展融合呈膜状，细胞表面及周围见颗粒状、丝状基质物质（图１）。８ｄ融合成片，有大量网状胶原分泌，材料间隙被基质填满（图２）。纳米晶羟基磷灰石胶原／骨：４ｄ细胞黏附并伸展生长，细胞的表面大量的微绒毛（图３ａ、３ｂ）。８ｄ细胞大量增殖，细胞数量增多相互连接融合（图４）ｉ２．２激光共聚焦显微镜观察丝素蛋白：细胞经丫啶橙染色，标记细胞内ＤＮＡ／ＲＮＡ，１５７２万 方数据胞核ＤＮＡ呈黄绿色或亮绿色，胞质及胞核ＲＮＡ呈橙红色，８ｄ细胞融合成大片状（图５）。纳米晶羟基磷灰石胶彤骨：细胞经ＤＡＰＩ染色呈蓝色，８ｄ细胞大量融合生长（图６）。２．３ＭＴＹ法检测细胞在材料上的增殖情况从细胞活性ＯＤ值所绘制的生长曲线来看（图７），细胞接种复合材料后，随时间的延长细胞活性逐渐增加，仍可保持良好的增殖速度，２种材料相比未见显著性差异（Ｐ＝０．８４８，Ｐ＞０．０５）。３讨论骨组织工程是指利用组织工程学进行骨组织缺损的修复或重建，一般来说，骨组织工程包含３个关键因素：种子细胞、支架材料、信号分子（骨生长因子、骨诱导因子）。骨髓基质干细胞（ｂｏｎｅｍ跚ｌＴｏｗｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌｓ，ＢＭＳＣｓ）作为具有多向分化潜能的干细胞，在体外不同的诱导条件下可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌腱细胞、肌肉细胞、神经细胞等多种细胞…。与其它来源的骨组织工程种子细胞相比，ＢＭＳＣｓ有着其难以比拟的优势：（１）取材方便，骨髓穿刺就能得到，无伦理道德问题；（２）培养增殖速度快，短期内可大量扩增；（３）可通过血脑屏障旧’；（４）同种异体移植或异种移植都未出现免疫排斥反应。骨髓间充质干细胞的重要作用的发挥离不开支架材料，支架材料一方面作为信号因子的载体，将其运送到缺损位置，另一方面可提供新骨生长的框架∞Ｊ。在各种支架材料中，天然衍生材料是最早应用，也是研究最深入的一种材料，生物相容性和细胞吸附性优秀，具有传导成骨甚至诱导成骨作用。其中，丝素蛋白经实验研究Ｈ、５１发现：多种细胞包括骨髓间充质干细胞、成骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞、内皮细胞、表皮细胞等在丝素蛋白上均能攀附生长，且形态活性良好，尤其发现内皮细胞也可良好生长，这就为组织工程的先决条件一材料的血管化提供了新的解决方法。复合材料是人们在解决其它各种材料缺点的过程中发展起来的，被认为是骨组织工程材料要素的最终解决办法，目前人们将目光集中各种天然材料和其他材料复合的研究上。纳米晶羟基磷灰石和胶屠扩骨以纳米相为基础，模仿天然骨的成分和微结构特征，经实验研究１６１亦发现材料具有良好的生物相容性和力学性能，有诱导成骨能力等优点。通过实验作者发现兔骨髓间充质干细胞复合在丝素蛋白，复合在纳米相羟基磷灰石胶厉ｙ骨，均可以良好地黏附生长，并保持较好的生物学特性。在２种材料上的细胞生长种支架材料。当然作者还应该将此研究引向深入，加快骨组（本文附圈见加页３）［１］ＰｉｔｔｅｎｇｅｒＭＦ，ＭａｃｋａｙＡＭ，ＢｅｃｋＳＣ，ｅｔａ１．Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆａｄｕｌｔｈｕｍａｎｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，２８４：１４３—１４７．增殖情况接近，没有统计学意义上的差异。然而如上所述，两种材料有着各自的优点，应根据不同的需要，考虑选用哪织工程的发展。参考文献：第１４卷第２０期２００６年１０月中国矫形外科杂志ＯｒｔｈｏｐｅｄｉｃＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎａＶ０１．１４．Ｎｏ．２０Ｏｃｔ．２００６［２］ＭｅｚｅｙＥ，ＣｈａｎｄｒｏｓｓＫＪ，ＨａｒｔａＧ，甜越．Ｔｕｍｉｎｇｂｌｏｏｄｉｎｔｏｂｒａｉｎｃｅｌｌｓ［５］ＲｏｎａｌｄＥＵ，Ｍｉｃｈａｅｌｗ，ＫｉｉｓｔｅｎＰ，ｅｔⅡ２．Ｇｒｏｗｔｈｏｆｈｕｍａｎｃｅｌｌｓｏｎｎｏｎ－ｗｏｖｅｎａｂｅａｒｉｎｇｎｅｕｒｏｎａｌａｎｔｉｇｅｎｓｇｅｎｅｒａｔｅｄｉｎｖｉｔｒｏｆｒｏｍｂｏｎｅＳｃｉｅｎｃｅ，２０００，２９０：１７７９—１７８２．ｍａⅢ［Ｊ］．ｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎｎｅｔ：ａｐｏｔｅｎｔｉａｌｆｏｒｌｉｆｅｉｎｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎ∞ｆｉｎｇ［Ｊ］．Ｂｉｏｍａｔｅｆｉｌａｌｓ．２００４，２５：１０６９—１０７５．［６］关凯，孙天胜，时述山，等．纳米晶羟基磷灰石／胶原复合材料在兔腰椎横突问融合中的观察［Ｊ］．颈腰痛杂志，２００３，２４：２１８—ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ［３］韩旭彤，安树林，等．骨组织工程用支架材料研究进展［Ｊ］．化工新型材料，２晰，２３（１）：１０一１３．［４］Ｈｙｏｕｎｇ－Ｊｏｏｎ．ｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌＪｔＪｉｎｇｓｏｎｇＣ，ＶａｓｓｉｌｉｓＫ。ｅｔａ／．Ｈｕｍａｎｏｎ２２２．ｒｃｅｐｏｎｓｅ８ｅｌｅｃｔｎ”ｐｕｎｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎｍａｔｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉ－（收稿：２００６－０６－２９）ａｌｓ。２００４，２５：１０３９—１０４７．征订启事欢迎订阅２００７年《中国脊柱脊髓杂志》《中国脊柱脊髓杂志》是由卫生部主管，中国康复医学会与中日友好医院主办，目前国内唯一以脊柱脊髓为内容的国家级医学核心期刊。及时反映国内外脊柱脊髓领域的科研动态、发展方向、技术水平。读者对象：从事脊柱外科、骨科、神经科、康复科、肿瘤科、泌尿科、放射科、基础研究及生物医学工程等学科的相关专业人员。本刊为中国科技信息中心“中国科技论文统计源期刊”及中科院中国科学计量评价研究中心（ＣＳＤ）“中国科学引文数据库来源期刊”，并已分别人编Ｃｈｉｎａｉｎｆｏ（中国信息）网络资源系统及以中国学术期刊光盘版为基础的中国期刊网，影响因子名列前茅。月刊，大１６开，正文８０页，每月１０日出版。全册铜版纸印刷，并附彩色插页。每册定价１５元，全年１８０元。全国各地邮局均可订阅，邮发代号８２—４５７。国外读者订阅请与中国国际图书贸易总公司中文报刊科联系（１０００４４，北京车公庄西路３５号），代号：ＢＭ６６８８。本刊经理部可随时为国内外读者代办邮购（免邮寄费）。地址：北京市朝阳区樱花园东街中日友好医院内，邮编：１０００２９。电话及传真：（０１０）６４２８４９２３，６４２０６６４９；（电子信箱）ｃｓｐｉｎｅ＠２６３．ｎｅＬ广告经营许可证：京朝工商广字０１７１号。可为相关厂家、商家提供广告园地。ｃｎ１５７３万方数据 Ｖ０１．１４．Ｎ０．２００ｃｔ．２００６中国矫形外科杂志ＯｒｔｈｏｐｅｄｉｃＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎａ第１４卷第２０期２００６年１０月兔骨髓间充质干细胞复合两种材料体外生物相容性的比较（正文见１５７１页）图１体外复合培养４ｄ，细胞复合丝素蛋白的生长情况（×９０１）体外复合培养８ｄ，细胞复合丝素蛋白的生长情况（Ｘ２００）０００）图２体外培养８ｄ，细胞复合丝素蛋白的生长情况（×２０１）图３ａ、３ｂ图４体外复合培养４ｄ，细胞复合纳米相羟基磷灰石和胶原的复合材料的生长情况（Ｘ１图５体外复合培养８ｄ，细胞复合纳米相羟基磷灰石和胶原的复合材料的生长情况（×３００）图６体外复合培养８ｄ。细胞复合纳米相羟基磷灰石和胶原的复合材料的生长情况（Ｙ１００）图７生长曲线万方数据 加页３
