牛胚胎移植技术（续） 梁坤 （黑龙江省家畜繁育指导站；黑龙江省家畜胚胎移植技术开发中心） ４胚胎鉴定与分级（胚胎形态学评定） 在胚胎移植中，胚胎的形态通常是在显微镜下观察到的。利用镜检可以看出胚胎的发育阶段，也可以评 估胚胎的质量。相对来说，胚胎质量和移植后的受胎率有直接关系。在胚胎细胞没有计数的前提下，通过镜检 评估胚胎质量以确定胚胎有足够数量的活细胞，并能够继续发育是非常重要的。 胚胎质量的分级是根据透明带内细胞碎片（或突起）的多少，同时结合活细胞团的大小来划分的。这些 细胞碎片基本上是由死细胞组成的。因此，这种细胞碎片越多，胚胎的死细胞数也就越多，那么胚胎中的活 细胞相当就越少。研究表明，胚胎内活细胞数的多少和移植妊娠率成正比。 超数排卵处理中，卵子从卵巢排出的时间不同，大约相差２４～３６ｈ，即有一个正常发育速度的范围。也就 是说从一次冲卵中回收到的可移植胚胎，胚胎的发育阶段并非全部是统一的，胚胎的质量也是不相同的。但 是，如果胚胎的发育比预期的发育阶段滞后２ ｄ，那么这种胚胎很可能是死的或者正在死亡的胚胎。 胚胎形态学评定，大多胚胎工作者都是根据胚胎的发育阶段来决定用什么样的受体，也就是说，发育较晚 的胚胎移植到发隋较晚的受体中去。这种做法是很难进行科学测试的，因为涉及好多变化因素。当胚胎从子宫 中冲出来的时候，不管它的形态上是处于什么发育阶段，很可能这些胚胎均已适应了当时子宫的代谢环境，即 此时的胚胎，其内部的生化阶段和形态阶段很可能是不同步的。如果这种分析正确，那么胚胎移植时就要根据 供体的发情时间，而不应该是胚胎的形态阶段。总的来说，质量较次的胚胎应该移人同步发情较晚的受体中 （但也不能超过２４～３６ ｈ）。主要原因是，由质量较差的胚胎产生较弱的胚胎信号可以在发育较晚的黄体的子 宫内多保持几天，以使在黄体松弛前，这种信号长时间作用于子宫催产素受体，这样可以有助于提高受胎率。 对于增加这种胚胎信号，将ｌ枚质量较差的胚胎连同ｌ枚无精卵移人一个受体可有助于提高受胎率。对于胚 胎发育阶段及质量的评估实际并不困难，但是，可能不同的操作者之间的评估结果会有稍微的差异。对于具体 操作者来讲，尽可能的多看胚胎，以便积累经验，胚胎的发育阶段（见表２）与形态学鉴定（见表３）。 表２胚胎的发育阶段 时期 天数 早期桑椹胚（ＥＭ） 桑椹胚（Ｍ） 致密桑椹胚（ＣＭ） 发情后５－６ ｄ采集的胚胎 ６ ｄ胚胎 ６ ７ ｄ胚胎 早期囊胚（ＥＢＬ） 囊胚（ＢＬ） 扩张囊胚（ＥＸＢＬ） 孵化囊胚（ＨＢＬ） ７ ｄ胚胎 ７－８ ｄ胚胎 ８－９ ｄ胚胎 ９ ｄ胚胎 一５９— 黑龙江动物繁殖第１ ８卷第４期２０ ｑ ０年 表３用形态学方法进行胚胎质量鉴定 级别 １级 球内 容 优秀胚：发育正常，胚龄与发育期相吻合，卵裂球轮廓清楚，透明度适中，细胞密度大、卵裂均匀，无水泡样卵裂 ，变性的细胞少。细胞变性率不超过１５％，但内细胞团发育良好的胚胎。 ２级 良好胚：发育基本符合预定胚龄，轮廓清楚，明暗适中或稍暗或稍浅，细胞密度较小或小型卯裂球过多，有小部 分突出的细胞和水泡样细胞细胞变性率为１ ５％一２０％。 ，３级 ４级 一般胚：轮廓不清淅，色泽过暗或过淡，细胞密度小，突出细胞占一半多，细胞变性率为３０％～４０％。 不可用胚：未受精卵和变性胚。 胚胎评估中容易混淆的几个问题： （１）致密桑椹胚和未受精卵 对于经验较少的观察者来讲，这是一个很容易混淆的观察，特别是其颜色相接近时，这种混淆会严重影 响受胎率。区别致密桑椹胚和未受精卵最主要的一点是观察胚胎细胞的边缘。如果是致密桑椹胚，那么边缘 是不整齐的（由于卵裂球的排列），有时还可能看到个别细胞，而未受精卵的边缘是很平滑的。 （２）扩张囊胚和退化的未受精卵 这种情况一般不多见。区分的主要方法是观察滋养层，如果是扩张囊胚，其滋养层有不规则的细胞突起。 （３）活胚胎和退化胚胎 某些胚胎中，其胚胎细胞中尽管有一个小的细胞碎片，但整个胚胎细胞团看起来非常整洁、有活力，而 且这个细胞团的体积比起小的细胞碎片要大得多，这种胚胎可评估为２级胚胎。值得注意的是，有时胚胎中 可以看到极体的存在，不要误认为是死细胞碎片，以免影响胚胎质量的评估。 １级和２级胚胎均被认为是好质量的胚胎，这两种胚胎在实际鲜胚移植中，其受胎率的差异很小，尽管２ 级胚胎在冷冻中的效果不如１级胚胎。３级胚胎为质量一般的胚胎，即其中的胚胎细胞有相对较多的死亡细 胞突起（或碎片），这种胚胎一般不做冷冻处理。 死细胞的大小取决于细胞死亡的时问。细胞发生死亡的时间越早，那么死细胞块就越大。从众多的死细 胞块中区别活细胞团，并且评估其发育能力，这主要取决于操作者的经验。 １级和２级胚胎其鲜胚胎移植受胎率可达６５％～８５％，但３级胚胎的受胎率一般低于５０％。而最次的胚 胎（即胚胎细胞中只有一小块是活的，而大多数是死细胞），移植受胎率不超过１０％。有时，胚胎的透明带呈异 常形态，这种胚胎尽管有非常正常的细胞团，其评估结果也要比正常情况下降一级。但是，在有些情况下，胚 胎质量可靠，但移植结果却一般，这种情况很可能是由于其它原因造成的，如培养液、受体牛本身的营养、对 受体牛黄体的正确判定、无菌操作等，这点应该考虑到。对于供体来讲，有时冲出的胚胎质量低于一般水平。 这种情况一般是由于供体本身条件所造成的，如气候（过于炎热或寒冷），营养状况不良或缺少微量元素等。 ５ 胚胎的装管和标记 胚胎分三段装入塑料细管内，两边是保存液，中间段是胚胎和冷冻液，每段间隔以０．５ ｅｍ气泡隔开，用 细管塞或加热封口，并贴上标签。 剪一段（５ ｅｍ）直径为０．５ ｍｍ的塑料细管作为标记外套，内装色纸或用不干胶纸粘在表面，标签上应写 明：生产单位、品种、公母牛号、冷冻方法、胚胎编号、胚胎数量、胚胎发育期、等级、生产日期及操作员代号，例 如：ＡＢ．Ｈ ０１０ｘ ９４１（６）ＤＴ１ １ＥＢＩ ２００４．５．５ Ｗ。 ６胚胎的冷冻保存 从广义上来讲，胚胎保存就是设法将离开母体的胚胎在体外或异体母畜体内暂时保存的一种方法。体外 保存又分短期低温（０～１０℃）和长期冷冻保存（一１９６￣Ｃ）。低温保存时间不能太长，主要原因是低温条件下，细 一６０— 胞内成分特别是酶不稳定。但其优点是不需要经受冻一融的复杂过程。而长期的冷冻保存是指在液氮 （一１９６￣Ｃ）中的保存。自１９４９年Ｐｏｌｇｅ冷冻哺乳动物精子获得成功，发现了甘油在精子冷冻过程中能起到保 护作用。标志着近代低温生物学的开端。此后，低温生物学广泛应用于医学、生物学和畜牧业中。１９７２年英 国学者Ｗｈｉｔｔｉｎｇｈａｍ首先成功地冷冻保存了小鼠胚胎。１９７３年Ｗｉｌｍｕｔ和Ｒｏｕｓｏ以甘油为防冻剂保存牛胚胎 获得成功。随后相继在羊、家兔、马、大鼠、人、狒、猴等冷冻胚胎保存成功。 （１）胚胎保存意义 胚胎冷冻保存是使胚胎移植技术真正走向商业化生产的关键因素。它可以使胚胎移植能在任何时间、任 何地点进行。还可以利用这项技术建立良种家畜和濒危动物的胚胎库；并可防止由于疾病或其它原因造成 的各种动物品系和稀有突变体的丢失；而且可以进行快速、廉价的国内外品种（胚胎）运输，简化了引种过程； 使家畜的遗传资源在世界范围内的转移成为可能。 （２）胚胎冷冻保存的机理 胚胎的形态结构：它的体积大，细胞质多，是个多细胞体系，为透明带包裹的单一体，极易发生冷冻损伤。 胚胎作为单一体不仅要求解冻后有活力，移植后能着床并一直发育到分娩。所以，要使胚胎克服冷冻损伤，提 高解冻后的存活率，将是胚胎冷冻保存面临的最主要问题。 细胞的生命活动不能缺少水，它生活在周围的液态中，同时细胞内的自由水很容易通过细胞膜，这样水 就会通过细胞膜的渗透，自由进出，以保持细胞内外渗透压的平衡。所以，细胞在冰点以下的降温和解冻过程 中总会发生结冰、融冰和细胞内外液的浓缩脱水和稀释，造成对细胞的损伤。 （３）胚胎的冷冻保存：当胚胎移人冷冻保存液或培养液中，移液管应在操作液中冲洗。每步之间应换吸 管或用最小量的溶液吸移胚胎（２～５ ｔｘ Ｌ）。每个平皿最低限度应含２ ｍＬ溶液，以减少反复应用时，因稀释或 蒸发等引起的浓度变化。吸移后胚胎应完全与新溶液混合平衡。平衡期间要将所有细管冷冻设备准备好。 细管浸入液氮中保存时，低温在细管内形成负压。封口（热封端或棉塞端）不严的细管会吸入液氮。所以 细管两端都应采用热封口。最好的方法是在细管两端反复热封直到它粘到热封器电极的表面。热封效果可以 通过将细管浸入一杯水中，给反端加正压后观察气泡的方法来检验。密封的细管可用１根空的０．５ ｍＬ细管 套在棉塞端用作标记柄。用这种标签便于细管的识别和操作，而胚胎仍然安全地浸在液氮中。目前的证据表 明，在室温空气中（２０￣Ｃ）解冻细管可以保护透明带不受损害，提高胚胎的存活力。 （４）冷冻对胚胎的作用：当外界温度降到０￣Ｃ时，培养液中的细胞就会受到两方面的损害，即物理损伤 （细胞内结冰）和化学损伤（溶液效应或渗透压性损伤）。 慢速冷冻的损伤机制：在慢速冷冻过程中，对胚胎造成的损伤，主要是由于透明带与细胞膜是一个半透 膜，水可以自由通过。当温度降至冰点，胚胎外的液体首先结冰，细胞内的水处于最初的过冷状态。随着胚胎 外冰晶的不断扩展，未结冰的液体中溶质浓度越来越高，造成细胞内外渗透压不平衡，使得细胞内的水不断 向外渗出，直至冷却到足够低的温度，细胞内才冻结。在这过程的同时，水结冰时所产生的高浓度电解质作用 于细胞膜，引起脂蛋白复合物的变性和部分类脂质的丢失，增加了细胞膜对阳离子的通透性，在细胞上形成 一些ｓｌ，￣Ｌ，解冻时水大量进入细胞造成渗透休克。这一变化称为溶质效应，也叫化学损伤或渗透性损伤。其次 是由于细胞内形成大冰晶，对细胞造成机械性损伤，一般称为物理损伤，尤其是解冻过程中冰晶在细胞内的 重结冰，更是一种致命损伤。 此外，Ｍｅｒｙｍａｎ（１９６８）认为，红细胞冷冻损伤不是来自浓缩的电解质本身，而是当红细胞自身体积皱缩 到５５％以下时，丧失了继续皱缩和排出水分的能力，导致细胞膜破裂。Ｌｅｖｉｔｔ（１９６２）提出了冷冻生物反应力的 假设，认为缓慢冷冻时，由于细胞脱水，造成蛋白质分子异常靠近，形成双硫键，这种键致使蛋白质在解冻后， 不能恢复到天然结构，出现蛋白质的不可逆聚集和变性。此外，通过对线粒体和叶绿素的研究还发现，损伤主 要表现为膜调节的氧化磷酸化过程的丧失。尽管损伤是同时发生的，而后者是主要的。 一６１— 黑龙江动物繁殖第１ ８卷第４期２０１０年 快速冷冻的损伤机制：在冷冻过程中，如果温度下降速度过快，超过了细胞膜的渗透能力，细胞内的水 分来不及外渗就产生结冰，这就对细胞有更大的破坏作用，冰晶的机械损伤将破坏细胞的超微结构，造成细 胞死亡。但当冷冻速度非常快时，细胞内形成的冰晶十分细小，当快速解冻时，对细胞无损害。而慢速解冻，冰 晶增大，对细胞造成致命损伤防冻剂的分类及其作用机制防冻剂的作用在于与水结合后，可避免或减少结冰 的程度和速度，或只结成较小的冰晶，其最主要的作用是能降低冷冻过程中由于盐浓度升高而造成的溶质损 伤，从而使细胞安全降至一１９６￣Ｃ。１９４９年Ｐｏｌｇｅ等发现了甘油的低温保护作用；１９５９年Ｌｏｖｅｌｏｃｋ等论述了二 甲亚砜（ＤＭＳＯ）的低温保护作用。目前认为确有防冻成效的有４０余种。 防冻剂的分类按渗透性可分为两类：一类是渗透性防冻剂，即分子量小，可通过细胞膜进入细胞内，如甘 油、乙二醇、二甲亚砜和１，２一丙二醇等；另一类是非渗透性防冻剂，即分子量大，在冷冻过程中不进人细胞 内，如蔗糖、聚蔗糖、海藻糖和棉子糖等。 渗透性防冻剂的主要作用机制是与水结合，使水的冰点下降，使之不易形成冰晶，从而起到冷冻保护作 用。而非渗透性防冻剂的作用则是通过提高细胞外液渗透压，使细胞内的水分充分外流，使胚胎在冷冻过程 中减少冰晶的形成，从而达到冷冻保护的目的。 适宜的冷冻保护剂必须具备以下特性：能降低液体冰点；溶水性强；高浓度对胚胎相对无毒性；能或不 能渗入胚胎。 （５）冷冻胚胎方法：乙二醇（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏ１）冷冻胚胎直接移植法 目前最流行的冷冻程序直接移植细管法，该法取消了解冻时所需的显微镜。程序如下： 胚胎——质量鉴定——乙二醇冷冻液——装人０．２５ｍＬ细管——一５．５—一６．５ ｃ冷冻仪ｌ０～ｌ５ ｍｉｎ——植 冰——再平衡５ ｍｉｎ—＿＿０－３ ０．６￣Ｃ／ｍｉｎ降温到一３５℃——平衡５ １０ ｍｉｎ——投人液氮保存。优点是冷冻效 果稳定，对技术人员的操作技能要求相对较低。国际上胚胎进、出口常用的方法；缺点是冷冻时间长，需要冷 冻仪。见图６（牛冷冻胚胎程序曲线图）。 Ｏ ２Ｏ ３Ｏ ４０ ５０ ６０ ７０ 图６牛胚胎冷冻程序曲线图 胚胎冷冻中应注意的事项：挑选胚胎发育阶段处于紧缩桑葚胚、囊胚及扩张囊胚的胚胎进行冷冻；用于 冷冻的胚胎质量应为１级、２级；用于流通的冷冻胚胎应有详细记录。 书面记录：检疫证明、系谱、冲胚记录；包装记录：细管（父母注册号、胚胎数量及质量、生产日期）；细管筒 （筒号、父母注册号、生产日期）；保持室温２２～２５￣Ｃ，防止阳光照射，与胚胎接触的物品及溶液保持无菌状 态。 （待续） 一６２—
