一种治疗周围神经损伤的神经融合剂及其制备方法和用途[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 109260456 A(43)申请公布日 2019.01.25

(21)申请号 201811201817.X(22)申请日 2018.10.16

(66)本国优先权数据

201810747292.3 2018.07.09 CN(71)申请人 哈尔滨医科大学

地址 150081 黑龙江省哈尔滨市南岗区保

健路157号(72)发明人 任晓平　任帅　

(74)专利代理机构 北京科龙寰宇知识产权代理

有限责任公司 11139

代理人 孙皓晨　马鑫(51)Int.Cl.

A61K 38/18(2006.01)A61P 25/02(2006.01)A61K 35/28(2015.01)

()发明名称

一种治疗周围神经损伤的神经融合剂及其制备方法和用途(57)摘要

本发明公开了一种治疗周围神经损伤的神经融合剂及其制备方法和用途。本发明所述的一种神经融合剂，由聚乙二醇，骨髓间充质干细胞，诱导性多能干细胞(IPS CELL)，施万细胞，胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)，丹参多酚酸，纳米石墨烯以及PBS缓冲液组成。本发明的神经融合剂的使用方法为直接应用于损伤区域，研究表明，使用本发明的一种神经融合剂能够以最快速的手段完成破裂神经细胞膜修复，从而达到损伤周围神经融合，有效的缩短了患者的恢复周期，减轻了患者的痛苦。本发明的一种神经融合剂在临床上将具有广泛的应用前景。

A61K 35/5(2015.01)A61K 36/537(2006.01)A61K 35/30(2015.01)A61K 33/44(2006.01)A61K 31/765(2006.01)

权利要求书1页 说明书4页 附图4页

CN 109260456 ACN 109260456 A

权　利　要　求　书

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1.一种治疗周围神经损伤的神经融合剂，其特征在于：所述的神经融合剂由聚乙二醇，骨髓间充质干细胞，诱导性多能干细胞，施万细胞，胶质细胞源性神经营养因子，丹参多酚酸，纳米石墨烯以及PBS缓冲液组成。

2.根据权利要求1所述的神经融合剂，其特征在于：所述的神经融合剂按照以下方法制备得到：

1)取骨髓间充质干细胞0.5×104-1.5×104个，诱导性多能干细胞0.5×104-1.5×104个，施万细胞0.5×103-1.5×103个，放入0.01-0.1ml PBS缓冲液中，标记为溶液1；

2)取胶质细胞源性神经生长因子(GDNF)0.01-0.1g，纳米石墨烯0.01-0.1g，丹参多酚酸0.01-0.1g，混于20-200ml聚乙二醇中，并搅拌均匀，标记为溶液2

3)将溶液1与溶液2混合后，即得。

3.根据权利要求2所述的神经融合剂，其特征在于：1)取骨髓间充质干细胞104个，诱导性多能干细胞104个，施万细胞103个，放入0.05ml PBS缓冲液中，标记为溶液1；

2)取胶质细胞源性神经生长因子(GDNF)0.01g，纳米石墨烯0.01g，丹参多酚酸0.01g，混于23.76ml聚乙二醇中，并搅拌均匀，标记为溶液2；

3)将溶液1与溶液2混合后，即得。

4.根据权利要求1-3任一项所述的神经融合剂，其特征在于：所述的施万细胞，骨髓间充质干细胞来自自体。

5.根据权利要求1-3任一项所述的神经融合剂，其特征在于：所述聚乙二醇的相对分子量为400-1000。

6.根据权利要求5所述的神经融合剂，其特征在于：所述聚乙二醇的相对分子量为600。7.权利要求1-6任一项所述的神经融合剂在制备治疗周围神经损伤的药物中的用途。

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一种治疗周围神经损伤的神经融合剂及其制备方法和用途

技术领域

[0001]本发明涉及一种术中神经融合产品及其制备方法和用途，特别涉及一种含有聚乙二醇，骨髓间充质干细胞，诱导性多能干细胞(IPS CELL)，胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)，丹参多酚酸，纳米石墨烯的神经融合产品及其制备方法和用途。本发明属于医用器械技术领域。

背景技术

[0002]现研究认为，在神经损伤后，损伤平面远端神经纤维全长的轴突和髓鞘破坏，神经支配的靶器官与神经元之间的联系争端，整个神经通路崩溃，这一系列的反应称之为华勒变性(Wallerian degeneration)。在损伤后早期，神经细胞胞体中蛋白酶的激活和释放使得神经的远端部位变性。随着细胞膜的溶解，细胞骨架开始崩解。神经近端因逆行性变性而开始水肿。在细胞骨架和细胞膜变性后，髓鞘崩解脱失，游离出脂滴。巨噬细胞和施万细胞等吞噬细胞开始清除髓鞘和轴突碎片。与此同时，这些细胞也产生可以提高轴突生长的细胞因子，有助于微环境的改善。层粘连蛋白靠捆绑特殊的受体作用于神经元和施万细胞，这些受体可以引导神经发芽和髓鞘形成，并且在细胞外基质和肌动蛋白细胞骨架之间提供分子连接。上述机体对神经损伤的反应中，诸如神经生长因子(NGF)和胶质细胞源神经营养因子(GDNF)的表达将被增高，并可促进轴突再生。随着崩解产物的清除，神经近端开始再生并向远端延伸。但是周围神经的再生速度十分缓慢，只有1mm/day。

[0003]目前针对周围神经的治疗局限于显微外科缝合后神经营养药物辅助支持，这种方法恢复的速度较慢，而且由于恢复周期较长给患者带来了较大的经济负担和精神压力。发明内容

[0004]本发明的发明目的是提供一种用于治疗周围神经损伤的神经融合剂，该神经融合剂能够以最快速的手段完成破裂神经细胞膜修复，从而达到损伤周围神经融合，有效的缩短了患者的恢复周期，减轻了患者的痛苦。[0005]为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：[0006]本发明的一种治疗周围神经损伤的神经融合剂，其由聚乙二醇，骨髓间充质干细胞，诱导性多能干细胞，施万细胞，胶质细胞源性神经营养因子，丹参多酚酸以，纳米石墨烯以及PBS缓冲液组成。[0007]其中，优选的，所述的神经融合剂按照以下方法制备得到：[0008]1)取骨髓间充质干细胞0.5×104-1.5×104个，诱导性多能干细胞0.5×104-1.5×104个，施万细胞0.5×103-1.5×103个，放入0.01-0.1ml PBS缓冲液中，标记为溶液1；[0009]2)取胶质细胞源性神经生长因子(GDNF)0.01-0.1g，纳米石墨烯0.01-0.1g，丹参多酚酸0.01-0.1g，混于20-200ml聚乙二醇中，并搅拌均匀，标记为溶液2[0010]3)将溶液1与溶液2混合后，即得。[0011]更优选的，所述的神经融合剂按照以下方法制备得到：

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1)取骨髓间充质干细胞104个，诱导性多能干细胞104个，施万细胞103个，放入

0.05ml PBS缓冲液中，标记为溶液1；

[0013]2)取胶质细胞源性神经生长因子(GDNF)0.01g，纳米石墨烯0.01g，丹参多酚酸0.01g，混于23.76ml聚乙二醇中，并搅拌均匀，标记为溶液2；[0014]3)将溶液1与溶液2混合后，即得。[0015]其中，优选的，所述的施万细胞，骨髓间充质干细胞来自自体。[0016]其中，优选的，所述聚乙二醇的相对分子量为400-1000。更优选的，所述聚乙二醇的相对分子量为600。[0017]进一步的，本发明还提出了所述的神经融合剂在制备治疗周围神经损伤的药物中的用途。

[0018]本发明的一种神经融合剂的主要成分为聚乙二醇(PEG)，聚乙二醇是一类非离子亲水性聚合物，具有广泛的生物化学和药理学应用。本发明发明人近年的研究表明PEG能够在在体环境下形成对于周围水分结构的结构化作用，形成相对的疏水结构域，这种特殊的结构域能减少细胞膜的线性弹性，促使破裂细胞膜发生融合，同时促进临近磷脂层的再塑，为细胞结构和功能的再塑提供条件。PEG作为一种融合剂和表面活性物质，可以在神经细胞膜破裂处促进水相和疏水结构域的联系，促进细胞膜破裂处的磷脂层的自发修复和融合，进而以最快速的手段完成破裂神经细胞膜修复，从而达到损伤神经融合。[0019]本发明融合剂的其他成分包括骨髓间充质干细胞，诱导性多能干细胞，施万细胞，胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)以及纳米石墨烯。其中骨髓间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。诱导性多功能干细胞(Induced pluripotent stem cells)，为利用导入特定基因或是特定基因产物(蛋白质)等方式送入体细胞(如：皮肤细胞或是肝脏细胞)中，使该体细胞变成为具备如同胚胎干细胞(ES细胞)般，具有分化成各式细胞的多功能分化能力，在一定条件下，它可以分化成多种多能细胞，并且可以持续增生。周围神经系统中的神经胶质细胞称施万细胞，它沿神经元的突起分布。施万细胞包裹在神经纤维上，这种神经纤维叫有髓神经纤维。有髓神经纤维和无髓神经纤维的施万细胞的形态和功能有所差异，施万细胞的外表面有基膜，能分泌神经营养因子，促进受损的神经元的存活及其轴突的再生，参与周围神经系统中神经纤维的构成。纳米石墨烯具有导电性，且达到纳米级水平，对于术后康复功能治疗中的电刺激有协同作用，石墨烯本身也是良好的支架材料，有助于损伤后的修复。GDNF属于TGF-β超家族，是一种生物活性很强的细胞因子，在体内分布广泛，它能促进神经细胞存活、神经细胞轴突再生以及突触形成，并对神经元有着重要的保护作用。[0020]进一步的，本发明还提出了所述的神经融合剂在制备治疗周围神经损伤的药物中的用途。

[0021]本发明的神经融合剂的使用方法为直接应用于损伤区域，动物模型的构建采用SD大鼠坐骨神经横断，并在横断区应用神经融合剂，术后行为学评分等检测手段检测神经融合剂的治疗效果。结果表明，神经融合剂的使用能够以最快速的手段完成破裂神经细胞膜修复，从而达到损伤周围神经融合，有效的缩短了患者的恢复周期，减轻了患者的痛苦。

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附图说明

[0022]图1为本发明实验例的流程图；

[0023]图2为术后一周普通缝合+生理盐水组；[0024]图3为术后一周普通缝合+神经融合剂组；[0025]图4为术后四周普通缝合+生理盐水组；[0026]图5为术后四周普通缝合+神经融合剂组；[0027]图6为坐骨神经功能评分。

具体实施方式

[0028]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。[0029]实施例1用于治疗周围神经损伤的神经融合剂的制备[0030]1、材料及其来源

[0031]本实施例所用聚乙二醇600为无菌液体原液，从sigma公司购买；骨髓间充质干细胞提取自自体骨髓；诱导性多能干细胞购自上海中乔新舟生物科技有限公司；施万细胞提取自自体腓肠神经；GDNF为本发明申请人自行合成；丹参多酚酸为注射剂，购自天津天士力之骄；纳米石墨烯微管购置于日本三井公司，为粉末。[0032]2、方法

[0033]1)取骨髓间充质干细胞104个，诱导性多能干细胞104个，施万细胞103个，放入0.05ml 0.1M PBS缓冲液中，标记为溶液1；

[0034]2)取胶质细胞源性神经生长因子(GDNF)0.01g，纳米石墨烯0.01g，丹参多酚酸0.01g，混于23.76ml聚乙二醇600中，并搅拌均匀，标记为溶液2；[0035]3)将溶液1与溶液2混合后，即得。

[0036]实施例2用于治疗周围神经损伤的神经融合剂的制备[0037]1、材料及其来源[0038]同实施例1。[0039]2、方法

[0040]1)取骨髓间充质干细胞0.5×104个，诱导性多能干细胞1.5×104个，施万细胞1.5×103个，放入0.1ml 0.1M PBS缓冲液中，标记为溶液1；[0041]2)取胶质细胞源性神经生长因子(GDNF)0.05g，纳米石墨烯0.01g，丹参多酚酸0.1g，混于100ml聚乙二醇600中，并搅拌均匀，标记为溶液2；[0042]3)将溶液1与溶液2混合后，即得。

[0043]实施例3用于治疗周围神经损伤的神经融合剂的制备[0044]1、材料及其来源[0045]同实施例1。[0046]2、方法

[0047]1)取骨髓间充质干细胞0.5×104个，诱导性多能干细胞0×104个，施万细胞0.5×

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103个，放入0.05ml 0.1M PBS缓冲液中，标记为溶液1；

[0048]2)取胶质细胞源性神经生长因子(GDNF)0.01g，纳米石墨烯0.05g，丹参多酚酸0.05g，混于100ml聚乙二醇600中，并搅拌均匀，标记为溶液2；[0049]3)将溶液1与溶液2混合后，即得。[0050]实验例：神经融合剂治疗大鼠模型周围神经损伤的实验研究[0051]方法：

[0052]1.构建周围神经损伤的动物模型，动物选择为SD大鼠20只，造模方式为坐骨神经完全离断，随机分为对照组以及神经融合剂治疗组，每组10只；[0053]2.神经融合剂治疗组：离断前对坐骨采用神经融合剂(实施例1制备)浸泡，离断过程在神经融合剂中进行，离断后，进行普通缝合并再次滴加神经融合剂；[00]对照组：离断前对坐骨采用0.9％NaCl溶液浸泡，离断过程在0.9％NaCl溶液中进行，离断后，进行普通缝合并再次滴加0.9％NaCl溶液；

[0055]3.术后第一周和第四周进行坐骨神经功能评分及电生理检测。[0056]技术路线如图1所示。[0057]实验结果：[0058]1.电生理检测：

[0059]对照组以及神经融合剂治疗组的电生理检测结果如图2-5所示。从该结果可以看出，治疗组的神经融合情况好于对照组。[0060]2.坐骨神经功能评分：

[0061]对照组以及神经融合剂治疗组的坐骨神经功能评分结果如图6所示。从该结果可以看出，治疗组的坐骨神经功能好于对照组。[0062]以上研究结果表明，使用本发明的神经融合剂能够以最快速的手段完成破裂神经细胞膜修复，从而达到损伤周围神经融合，重建神经完整性和功能性的目的。

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图2

图3

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