实验三 蛋白质及氨基酸的呈色反应

一、实验目的

1、了解蛋白质和某些氨基酸的特殊颜色反应及其原理 2、掌握几种常用鉴定蛋白质和氨基酸的方法

二、实验内容

对蛋白质及氨基酸的双缩脲反应、茚三酮反应、黄色反应、乙醛酸反应、偶氮反应、醋酸铅反应等颜色及沉淀反应进行定性确定。

三、实验操作

（一） 双缩脲反应

1、实验原理

当尿素加热到180℃左右时，两个分子的尿素缩合可放出一个分子氨后形成双缩脲，双 缩脲在碱性溶液中与铜离子结合生成复杂的红色配合物，此呈色反应称为双缩脲反应。由于蛋白质分子中含有多个肽键，其结构与双缩脲相似，故能呈此反应，而形成紫红色或蓝紫色的配合物。此反应常用作蛋白质的定性或定量的测定。

2、试剂

(1)尿素

(2)10%NaOH溶液

(3)1%CuSO4溶液

(4)蛋白质溶液：将鸡蛋清用蒸馏水稀释10~20倍，3层纱布过滤，滤液冷藏备用。

3、操作

（1）取少许结晶尿素放在干燥试管，微火加热，则尿素开始熔化，并形成双缩脲，释放的氨可用湿润的红色石蕊试纸鉴定。待熔融的尿素开始硬化，试管内有白色固体出现，停止加热，让试管缓慢冷却。然后加10% NaOH溶液 1 ml和1% CuSO4 2~3滴，混匀后观察颜色的变化。

（2）另取一试管，加蛋白质溶液 1ml、10% NaOH溶液2ml及1% CuSO4 2~3滴，振荡后将出现的紫红色与双缩脲反应所产生的颜色相对比。

（二） 茚三酮反应

1、实验原理

除脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮作用生成黄色物质外，所有α-氨基酸与茚三酮发生反应 生成紫红色物质，最终形成蓝紫色化合物。1︰1500000浓度的氨基酸水溶液即能发生反应而显色。反应的适宜pH为5~7。此反应目前广泛地应用于氨基酸定量测定。

2、试剂

蛋白质溶液 （同前）；0.5% 甘氨酸；0.5%茚三酮水溶液

3、操作

取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液各1 ml，再各加0.5 ml 0.1%茚三酮水溶 液，混匀，在沸水浴加热2~3分钟，观察颜色变化。

（三） 蛋白黄色反应

1、实验原理

蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等，这类蛋白质可 被浓硝酸硝化生成黄色的硝基苯的衍生物。该物质在酸性环境中呈黄色，在碱性环境中转变

为橙黄色的硝醌酸钠。绝大多数蛋白质都含有芳香族氨基酸，因此都有黄色反应。皮肤、毛发、指甲等遇浓HNO3变黄即发生此类黄色反应结果。

2、试剂

(1)蛋白质溶液（同前）；(2)头发；(3)指甲屑；(4)0.5%苯酚溶液；(5)0.3%酪氨酸溶液；(6)10%NaOH溶液；(7)浓硝酸（ρ=1.42克/毫升）

3、操作

取5支试管编号后分别按下表-1所示加入试剂，观察各管出现的现象，若有反应慢者 可放置微火（或水浴中）加热，待各管均先后出现黄色后，于室温逐滴加入10%NaOH溶液直至碱性，观察颜色变化。

表1 试验编号

管 号 材料加入 浓硝酸 1 蛋白质溶液（4滴） 2滴 2 指甲屑 （少许） 2 ml 3 头发 （少许） 2 ml 4 苯酚 （4滴） 4滴 5 酪氨酸 （4滴） 2滴 现 象 注意：向蛋白质溶液中加浓硝酸时，所出现的白色沉淀是强酸使蛋白质发生变性所致。

（四） 乙醛酸反应

1、实验原理

含有吲哚基的色氨酸在浓硫酸存在下与乙醛酸（CHOCOOH）缩合，形成与靛蓝相似的 物质。此反应机理尚不清楚，可能是由一分子乙醛酸与两分子色氨酸脱水缩合而成的。含有色氨酸的蛋白质也有此反应。

2、试剂

(1)蛋白质溶液（同前）。

(2)0.03%色氨酸溶液。

(3)冰醋酸（一般含有乙醛酸杂质，故可用冰醋酸代替乙醛酸）。 (4)浓硫酸（分析纯）。

3、操作：

取2支试管，分别加入蛋白质溶液及色氨酸各2滴，再加浓冰醋酸约1~2毫升，混匀，倾斜试管慢慢地沿管各加浓硫酸1毫升，使之两相重叠，静置5分钟后则两相界面处出现紫红色环，若效果不明显可在水浴加热。

（五） 偶氮反应

1、实验原理

偶氮化合物与酚核或咪唑环结合产生有色物质，酪氨酸和组氨酸与之反应则应产物分别为橙红色和樱红色。含有酪氨酸和组氨酸的蛋白质也有此反应。应当指出，组胺、酪胺、肾上腺素和胆色素分子也能发生此反应而显色。

2、试剂：

(1)蛋白质溶液（同前）；(2)0.3%组氨酸溶液；(3)0.3%酪氨酸溶液；(4)20%NaOH溶液； (5)重氮试剂

溶液A：5克亚硝酸钠溶于1000毫升水中。

溶液B：溶解5克ɑ-氨基苯磺酸于1000毫升水中，溶解后再加入5毫升浓硫酸。A、B液分别存在密闭瓶中，用时以等体积混合。

3、操作：

取3支试管分别加入0.3%组氨酸、酪氨酸、蛋白质溶液，各4~5滴，再分别加重氮试剂A、B各10滴，振摇，混匀，取后向3支试管分别加入20%NaOH溶液2~3滴，观察各

试管中有色物质的生成，若水浴加热效果更明显。

（六）、醋酸铅反应

1、实验原理

多数蛋白质分子中常有含硫的氨基酸，如半胱氨酸和胱氨酸，含硫蛋白质在强碱作用下

可分解产生硫化钠。硫化钠与醋酸铅反应生成黑色的硫化铅沉淀，若加入浓盐酸则有硫化氢气体产生。

2、试剂

(1)未稀释的鸡蛋清。 (2)10%的NaOH溶液

(3)1.5%Pb(Ac)2溶液（醋酸铅溶液） (4)浓盐酸

(5)醋酸铅试纸(将滤纸条浸入醋酸铅溶液中，湿透后取出，100℃烘干即可)

3、操作：

向试管中先加入1.5% Pb(Ac)2溶液约1毫升，再慢慢滴加10%的NaOH溶液，边加边振摇，直到产生的沉淀溶解为止。此时再向试管内加蛋白质溶液5~6滴，混匀。置酒精灯上加热1分钟，溶液变黑，小心加入浓盐酸约2毫升，黑色褪去，嗅其味，将湿润醋酸铅试纸置于管口，观察其颜色的变化。

实验四 蛋白质的沉淀反应

一、目的

1．熟悉蛋白质的沉淀反应。

2．进一步掌握蛋白质的有关性质。

二、原理

多数蛋白质是亲水胶体，当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶解的盐后，即产生沉淀。

三、实验器材

1．试管1.5cm×15cm（×7）。 2．吸管5.0ml(×2)、2.0ml(×2)、1.0ml(×1)。 3．吸滤瓶500ml(×1)。 4．布氏漏斗。

四、实验试剂

1．蛋白质试液：见实验二十三卵清蛋白液。 2．硫酸铵晶体：如果晶体太大，最好研碎。

3．饱和硫酸铵溶液：蒸馏水100ml加硫酸铵至饱和。 4．95%乙醇。

5．结晶氯化钠。

6．1%醋酸铅：1g醋酸铅溶于蒸馏水并稀释至100ml。 7．5%鞣酸溶液：5g鞣酸溶于水并稀释至100ml。 8．1%硫酸铜溶液：见实验二十三。 9．饱和苦味酸溶液。

10．1%醋酸溶液：冰醋酸1ml用蒸馏水稀释至100ml。

五、操作

A、蛋白质盐析作用

向蛋白质溶液中加入中性盐至一定浓度，蛋白质即沉淀析出，这种作用称为盐析。

操作方法：

1．取蛋白质溶液5ml，加入等量饱和硫酸铵溶液（此时硫酸铵的浓度为50%饱和），微微摇动试管，使溶液混合静置数分钟，球蛋白即析出（如无沉淀可再加少许饱和硫酸铵）。 2．将上述混合液过滤，滤液中加硫酸铵粉末，至不再溶解，析出的即为清蛋白。再加水稀释，观察沉淀是否溶解。

注意

（1）应该先加蛋白质溶液，然后加饱和硫酸铵溶液。

（2）固体硫酸铵若加到过饱和则有结晶析出，勿与蛋白质沉淀混淆。

B、乙醇沉淀蛋白质

乙醇为脱水剂，能破坏蛋白质胶体的水化层而使其沉淀析出。

操作方法

取蛋白质溶液1ml，加晶体NaCl少许（加速沉淀并使沉淀完全），待溶解后再加入95%乙醇2ml混匀。观察有无沉淀析出。

C、重金属盐析沉淀蛋白质

蛋白质与重金属离子（如Cu、Ag、Hg等）结合成不溶性盐类而沉淀。

2+

+

2+

操作方法

取试管2支各加蛋白质溶液2ml，一管内滴加1%醋酸铅溶液，另一管内加1%CuSO4

溶液，至有沉淀生成。

D、生物碱试剂沉淀蛋白质

植物体内具有显著生理作用的含氮碱性化合物称为生物碱（或植物碱）。能沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂，如鞣酸、苦味酸、磷钨酸等。生物碱试剂能和蛋白质结合生成沉淀，可能因蛋白质和生物碱含有相似的含氮基团之故。

操作方法

取试管2支各加2ml蛋白质溶液及1%醋酸溶液4~5滴，向一管中加5%鞣酸溶液数滴，另一管内加苦味酸溶液数滴，观察结果。