五倍子体外抑制大肠杆菌实验研究

doi:10.3969/j.issn.1008-4754.2020.01.051目的：研究五倍子对大肠杆菌的体外抑菌作用。方法：采用水提法提取五倍子有效成分，并使用平板打孔法和倍比稀释法测定五倍子提取物对大肠杆菌的抑菌效果。结果：五倍子平板抑菌环直径为12.6mm，对大肠杆菌的MIC为15.625mg/mL。结论：五倍子具有较好的抑菌作用。

五倍子；大肠杆菌；抑菌作用

项目经费来源：内蒙古自治区科技重大专项（KJZD2018008）

作者简介：蔡小利（1977—），女，大学本科，兽医师，研究方向：中草药抑菌研究。

*通信作者：陈志强（1972—），男，硕士，主要从兽药产品的研发，zhq_chen@163.com。

五倍子体外抑制大肠杆菌实验研究

蔡小利，付丽云，郭蔚冰，陈志强 *

(内蒙古华天制药有限公司 内蒙古赤峰 024000)

在畜禽养殖过程中，随着抗生素的大量使用，越来越多的细菌产生了耐药性，要想预防和治疗动物疾病，抗生素的使用剂量不断加大，抗生素产生的耐药性以及药物残留等相关问题也会越来越突出。在所有的细菌中，大肠杆菌产生的耐药性是非常快的，对很多的抗生素都具有耐药性，在有些养殖场已经到了不知选择何种抗生素来应对动物大肠杆菌性疾病。随着限抗令的颁布和实施，养

即为实验菌液。109cfu/mL，

1.2.3中药提取物抑菌作用的测定实验采用平皿打孔法

[3]，吸

涂布于琼脂平板表面，用6mm打孔器在平取0.1mL实验菌悬液，

板上均匀打孔，在孔内滴加0.1mL五倍子提取物，置37℃培养24h后测定抑菌直径。重复实验3次。

1.2.4最小抑菌浓度MIC的测定采用微量细胞培养板倍比稀释法，取无菌的96孔细胞培养板，从左至右依次标记为1-12号，于每孔加入肉汤培养液0.1mL，1号孔加入上述制备的药物0.1mL，2～10号孔10级倍比稀释，11号孔不加菌液，其余各孔加上述制备的菌悬液2.0μL，使各孔的药物最终浓度为：500、250、125、62.5、31.25、15.62、7.81、3.91、1.95和0.98mg/mL共10个浓度梯度，12号孔加不含药物的基质培养液作阴性对照，充分震荡混匀后37℃培养24h，观察细菌生长情况，判断无浑浊试管的最小浓度即判定为MIC。每个浓度设三个平行孔。

殖业需要无抗低毒的抗生素替代品显得愈加迫切。中药在我国已om.cn. All Rights Reserved.经应用了几千年，积累了大量的临床资料，国内的很多学者或者企业越来越重视如何从中药中筛选出抗菌药物[1]。药理学研究发现，五倍子含有鞣质、黄酮、蒽醌、没食子酸等物质，有效成分十分复杂，具有敛肺降火、止汗止血、抗菌解毒等多种生物学功能[2]。本实验选取五倍子水提取物进行体外抑菌实验，通过对大肠杆菌抑菌效果和最低抑菌浓度的测定，筛选出应用于临床治疗的中药浓度。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1五倍子购自内蒙古通辽某中药店。

1.1.2受试菌种由内蒙古通辽市某腹泻犊牛粪便分离鉴定，由内蒙古民族大学动科院微生物实验室保存。

1.1.3培养基营养琼脂培养基、蛋白胨、酵母提取物购自青岛海博。

2结果

2.1中药提取物体外抑菌圈直径的测定结果

测定结果显示五倍子抑菌圈直径为12.6mm，五倍子水提取

［4］：大于10mm为强抑制，8～10物有显著地抑菌效果。（判断标准

mm为抑制，小于8mm以下弱抑制）

2.2中药提取物最低抑菌浓度的测定结果

采用倍比稀释法对中药水提取物进行MIC的测定。结果表明五倍子水提取物的MIC为15.625mg/mL，结果见表1。

1.2实验方法

1.2.1中药水提取物的制备分别称取一定量的中药原药材，用中药粉碎机粉碎后过40目筛，称取20g，加蒸馏水200mL，用中药煎药器煎煮1h，倒出上清，再重新加水200mL继续煎煮1h，取上清液和第一次合并，离心过滤补足蒸馏水最终为200mL，成原液浓度1g/mL，用无菌滤器过滤药液，4℃冰箱保存备用。

1.2.2菌液的准备将大肠杆菌接种于5mLLB液体培养基，37℃培养24h，取0.1mL于普通琼脂平板上培养12h，用灭菌生理盐水洗下菌落并稀释，血细胞计数板估测活菌数后稀释至1.0×

表 1 五倍子水提取物对大肠杆菌的MIC测定致病菌大肠杆菌-五倍子提取液浓度（mg/mL）500-250-125-62.5-31.25-15.625+7.813.91.950.98+++++++++注：“－”表示无菌生长；“+”表示有菌生长；随“+”数增加菌落长势增强.3讨论

中药在我国种类非常多，各种药物合理配伍，（下转第67页）（上接第60页）不良反应很少，对人和动物的副作用比较小，价格

60中国动物保健2020.01

染。这两种病有相应的疫苗和药物进行预防，所以发病并不常见，通常只发病于散养户。本例鸡场采用散养模式，不进行任何的疫苗免疫和驱虫，所以发生本病实属正常。

鸡痘属于与痘病毒科痘病毒属。其是一种危害养鸡业的重要传染病，通常发病可以分为两种类型，即皮肤型和黏膜性[2]。痘病毒感染成年鸡一般不死亡，雏鸡病死率通常在5%～60%之间[3]。当其与其他传染病以及寄生虫病并发感染，可以引起大批死亡[4]。而且近年来，鸡痘发病呈现上升趋势[5]。还出现了以结膜炎、眼鼻流炎性分泌物等为特征的眼鼻型[6]。本例鸡痘在皮肤和黏膜上都有痘疹，

还表现出眼睛有分泌物，可见本例发生鸡痘为混合型。而且还与蛔图4切开眼睑，里边呈豆腐渣样虫共同感染，就造成鸡场的死亡率增加。所以，在养殖中要注意及

细菌感染。

时进行疫苗刺种，防控本病发生。

刮取小肠黏膜，采集肠道内容物，直接涂片，在低倍镜下进行鸡蛔虫一般通过驱虫药进行预防。通过调查可见蛋鸡蛔虫的镜检，视野中可见有大量灰白色的椭圆形虫卵。取病鸡粪便，采用感染率为2.14%，但在未使用驱虫药的鸡场蛔虫感染率则高达饱和盐水漂浮法[1]进行检查，同样发现有大量虫卵。结合剖检情况10.8%[7]。雏鸡的感染率非常高，1～4月龄的鸡感染率可以高达确定感染蛔虫。

50%～80%[8]。本例鸡场病鸡发病日龄为63d，正处于易感性最高的采集病鸡血液分离血清，应用鸡痘标准抗原和分离到的血清阶段，而且没有投放过驱虫药物，所以感染发病率较高。

进行琼脂扩散试验，可见在两孔之间出现明显的沉淀线，可以确定鸡蛔虫病感染病鸡出现下痢，并且在粪便中带有血液，常易和病鸡感染鸡痘病毒。

球虫病混淆，所以在诊断时应加以辨别，用药不当会延误病情，造由此可以确诊本例病鸡为混合型鸡痘病毒和蛔虫混合感染。

成较大的损失。█

4治疗

参考文献:

鸡群应用左旋咪唑拌料进行治疗，按照25mg/kg体重的用

[1]孙秀红,刘丹丹,苏丁泽阳,等.扬州市流浪犬肠道寄生虫种类的调查[J]．量使用。鸡群应用阿莫西林预防继发感染，使用10%的阿莫西林粉畜牧与兽医,2018，50(02):131-133.

1kg拌料500kg。对于个别的痘疹，将其剥离，而后用紫药水涂[2]SaifYM.禽病学[M].10版.北京:中国农业出版社,2012:335-355.[3]谢长清,王凯,黄绍宋,等．一起蛋雏鸡皮肤型鸡痘病毒与大肠埃希菌混合抹。口腔内的鸡痘用用镊子剥离后应用1%高猛酸钾清洗，而后涂感染的病理学观察[J]．动物医学进展,2015,36(06):174-177.

抹碘甘油。眼部的鸡痘切开，将其中干酪样物排出后用1%高锰酸[4]田明星,赵芳芳,石敏,等.鸡痘病毒和葡萄球菌混合感染的病原分离与鉴钾清洗干净。对未发病的鸡群紧急刺种鸡痘疫苗。鸡痘严重的病鸡定[J]．四川农业大学学报,2010,28(04):497-500+506．

予以淘汰。在治疗的同时，注意将剥离的痘痂以及干酪样物质焚[5]常维山,孙淑红,王雪鹏,等.实验鸡群暴发鸡痘并发细菌感染的诊断报告烧，并对周围环境进行消毒，及时清扫粪便并无害化处理。用药3d[J].中国禽业导刊,2003(24):27．

后病情得到控制，死亡减少，5d后已无死亡病鸡。

[6]齐俊良.新型鸡痘临床病例诊断报告[J].中国动物检疫，2003，20（10）：5讨论

33-34.

本例鸡场发病，通过对临床症状和病理变化的观察怀疑为鸡[7]张玲,郑国清,郑娟.鸡蛔虫的流行病学调查及防治[J].今日畜牧兽医,2009痘病毒和蛔虫感染。通过对细菌培养，发现没有病原菌参与感染，(6):38.

[8]袁彬彬.一起鸡蛔虫病感染诊断与防治措施[J].中国动物检疫,2011,28通过饱和盐水漂浮法和琼脂扩散试验证实确为这两种病原混合感

(01):77-78.

表较便宜，不会产生耐药性的问题，不会产生药物残留，对环境不效果，这样才能使中药发挥真正的功效。█

会形成污染，在目前减抗令颁布实施后成为临床用药的首选，得到参考文献:

国内外学者的高度重视。中药的抗菌作用主要是通过调理患者的[1]李昕,赵月,苏昕．32味中药水提取物对4种真菌抑菌实验研究[J].辽宁功能状态，而西药则侧重于药物与微生物之间的相互作用得以实中医药大学学报,2015,17(3):36-39．

现。本实验选用水煎煮方法对五倍子进行提取分析，选用临床致病[2]郑兰娟,罗艳萍,汪玉娇,等.五倍子抗菌抗炎作用研究进展[J].中国病原生分离的大肠杆菌作为研究对象，结果表明，五倍子水提物有显著的物学杂志,2011,6(11):868-869

抑菌效果，其最低抑菌浓度为15.625mg/mL。中药水提法临床使[3]雷连成,韩文瑜,乔红伟.大肠杆菌耐药性中药抑制剂的初步研究[J].吉林用方便，不需要特殊的仪器设备，更便于基层推广使用。

农业大学学报,2003,25(4):429-433．

[4]陈希文,王雄清,代敏,等．24种中药对猪沙门氏菌的体外抑菌活性[J].江本实验选择了临床分离的致病菌，将致病菌与药物直接接触，苏农业科学,2008,5(1):180-182．

没有动物实验，因此不能证实药物在体内的功效，所以选择中药时既要考虑药物的体外抑菌实验结果，还要综合考虑中药在体内的

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