我国沿海三疣梭子蟹9个野生群体线粒体CR和COⅠ片段比较分析

我国沿海三疣梭子蟹9个野生群体线粒体

CR和CO󰀂片段比较分析

冯冰冰

󰀁李家乐

*

󰀁牛东红

󰀁陈󰀁琳

!

󰀁郑岳夫

!

󰀁郑凯宏

!

( 上海水产大学省部共建水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室󰀁上海󰀁200090;

!浙江省象山县水产技术推广站󰀁浙江象山󰀁315700)

摘要:通过对我国沿海三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)9个野生群体线粒体DNA控制区(putativecontrolregion,CR)基因片段和细胞色素氧化酶亚基󰀂(CO󰀂)基因片段进行扩增和测序,分别得到长度为530bp和584bp的片段。分析结果表明:CR83条序列A+T平均含量为73󰀁2%,共检测到91个变异位点,83个个体具有66种单倍型(haplotype);CO󰀂94条序列A+T平均含量为62󰀁2%,共检测到34个变异位点,94个个体具有34种单倍型(haplotype)。用MEGA3󰀁1软件构建9个群体NJ分子树,聚类结果显示,黄海、东海、渤海6个群体之间的相对遗传距离比较近,聚为一大支,南海3个群体相对遗传距离比较近,聚为一大支。AMOVA分析表明,群体间的遗传分化指数(Fst)为-0󰀁074~0󰀁27087,其中部分群体间达到显著差异(P<0󰀁05)与极显著差异(P<0󰀁01),说明我国三疣梭子蟹不同野生群体间存在一定遗传分化。

关键词:三疣梭子蟹;线粒体DNA;控制区;CO󰀂;遗传多样性;遗传分化中图分类号:Q951󰀁文献标识码:A󰀁文章编号:0250󰀂3263(2008)02󰀂28󰀂09

ComparedAnalysisontheSequencesofMitochondrialCRGeneand

CO󰀂GeneFragmentsofNineWildStocksof

PortunustrituberculatusfromtheMarginalSeasofChina

FENGBing󰀂Bing󰀁LIJia󰀂Le

*!

󰀁NIUDong󰀂Hong󰀁CHENLin󰀁

!

!

ZHENGYue󰀂Fu󰀁ZHENGKai󰀂Hong

( TheKeyLaboratoryofAquaticGeneticResourcesandAquaculturalEcologyCertificated

bytheMinistryofAgriculture,ShanghaiFisheriesUniversity,Shanghai󰀁200090;

!XiangshanFisheriesTechnologyStation,Xiangshan󰀁315700,China)

Abstract:MitochondrialCRgeneandCO󰀂genefragmentswereamplifiedandsequencedfrom9wildstocksofPortunustrituberculatusinChina.Respectively,530bpand584bplongpartialgenefragmentsoftheCRgeneandtheCO󰀂genewereobtained.A+TmeancontentsoftheCRsequencesandtheCO󰀂sequenceswererespectively73󰀁2%and62󰀁2%.Moreover,66haplotypeswereidentifiedfrom83sampleswith91variationsitesofCRgeneand33haplotypeswereidentifiedfrom96sampleswith42variationsitesofCO󰀂gene.ThegeneticdistanceandclusteranalysisshowedthatgeneticdistanceswerenearestamongsixstocksofYellowSea,EastChinaSea,BohaiSea,while

基金项目󰀁上海市重点学科建设项目(Y1101),浙江象山县科技局项目(061301);*通讯作者,E󰀂mail:jlli@shfu.edu.cn;

第一作者介绍󰀁冯冰冰,男,硕士研究生;研究方向:水产动物种质资源与种苗工程;E󰀂mail:shuishui收稿日期:2007󰀂09󰀂26,修回日期:2008󰀂01󰀂05

∀

fbb@sohu.com。

2期冯冰冰等:我国沿海三疣梭子蟹9个野生群体线粒体CR和CO󰀂片段比较分析

󰀁󰀁󰀁&29&

thegeneticdistanceswerenearestamongthreestocksofSouthChinaSea.Thefixationindices(Fst)werefrom-0󰀁074to0󰀁27087betweenanytwostocksandsomeofthemgottosignificantandgreatsignificantlevel.SotheseindicatedthatthereweresomegeneticdifferentiationsindifferentwildstocksofP.trituberculatusinChina.Keywords:Portunustrituberculatus;mtDNA;Putativecontrolregion;CO󰀂;Geneticdiversity;Geneticdifferentiation

󰀁󰀁三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus),俗称海蟹或大蟹,属于甲壳纲十足目梭子蟹科,广泛分布在我国山东、浙江、广西、广东、福建、海南

[1]

以及日本、朝鲜、马来西亚群岛等水域。三疣取9~12只个体,每只个体取0󰀁5g螯部肌肉组织剪碎后,加入500󰀁l组织匀浆缓冲液(10

mmol󰀁LTris󰀂HCl,pH=8󰀁0;50mmol󰀁LEDTA,pH=8󰀁0),混匀后加入终浓度为1%的SDS和200梭子蟹是我国大型海洋经济蟹类,是沿海重要的渔业对象。国内外对有关三疣梭子蟹的养殖习性、生理生态、胚胎发育、生化遗传等方面的研究较多

[2~9]

,而对三疣梭子蟹的遗传多样性

方面报道较少,仅出现在利用同工酶对舟山海域野生三疣梭子蟹遗传多样性分析

[10]

,对潍坊

养殖三疣梭子蟹mtDNA16SrRNA和CO󰀂基因片段序列进行比较,研究种内变异程度[11]

等方

面。

除刺细胞动物和等脚类外,多细胞动物的线粒体DNA(mitochondrialDNA,mtDNA)都是一个环形DNA分子[12,13]

,序列长度在14~17kb

之间

[14]

。由于它具有母系遗传、进化速度快、

核苷酸替代率高等特点,mtDNA已成为群体遗传学以及系统发育等研究的有效遗传标记

[15]

。

其中,CR和CO󰀂片段的进化速率在所有线粒体片段中相对较快,较适合种内群体的研究。本研究利用mtDNACR和CO󰀂片段分析了我

国三疣梭子蟹9个野生群体的遗传多样性及遗传结构,以期为我国三疣梭子蟹的种质保护和利用提供基础资料。

1󰀁材料与方法

1󰀁1󰀁实验材料󰀁分别于2006年6~9月从我国沿海:渤海的潍坊(WF)、黄骅(HH),黄海的青岛(QD)、连云港(LY),东海的象山(XS)、莆田(PT),南海的南澳(NA)、湛江(ZJ)、乌石(WS),采集当地的野生三疣梭子蟹,在采集地或带回实验室各取2只活体螯用无水乙醇固定,备用。1󰀁2󰀁实验方法󰀁

1󰀁2󰀁1󰀁基因组DNA的提取󰀁每个群体随机选

󰀁g󰀁ml的蛋白酶K,55#裂解至澄清。采用苯酚󰀂氯仿的抽提方法提取基因组DNA。紫外分光光度计测定样品DNA的OD260、OD280值,确定其浓度和纯度,4#保存备用。

1󰀁2󰀁2󰀁PCR反应及产物的纯化和测序󰀁CR序列片段扩增引物根据三疣梭子蟹mtDNA全序列中的控制区片段

[16]

,用Primer5󰀁0设计得出,

CR󰀂AR:5∃ACTACACGCAACAACTCTCA3∃,CR󰀂BR:5∃AATCTTTCTGGATTCTCCTA3∃;用于CO󰀂序列片段扩增的2个引物分别为LCO1490:5∃GGTCAAATCATAAAGATATTGG3∃和HCO2198:5∃TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA3∃[17]

,均由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反应体系25󰀁l,含模板

DNA50~100ng,Mg

2+

1󰀁5mmol󰀁L,10%Buffer

2󰀁5󰀁l,dNTP0󰀁2mmol󰀁L,Taq酶1U,上、下游引物各0󰀁2󰀁mol󰀁L。反应条件:94#预变性3min;94#变性50s,45#󰀁48#退火50s,72#延伸1min,35个循环;72#后延伸10min;4#终止反应。每次反应都设不含模板的空白对照。PCR扩增产物经1󰀁5%琼脂糖凝胶检测,电泳缓冲液为0󰀁5%TBE(pH8󰀁0),电压为5V󰀁cm,常温电泳,EB染色,于凝胶成像系统下观察并拍照记录。PCR产物的纯化和测序工作由国家人类基因组南方研究中心完成。

1󰀁2󰀁3󰀁序列分析󰀁DNA序列用Bioedit

[18]进行编辑并辅以人工核查,用ClustalX1󰀁81[19]

进行

同源排序比对,并确定序列长度。用DnaSp

4󰀁0

[20]

计算群体单倍型多态性(haplotypediversity)和核苷酸多样性指数(nucleotidediversity)、平均核苷酸差异数(averagenumberof

󰀁󰀁󰀁&30&

动物学杂志ChineseJournalofZoology43卷

nucleotidedifferences)、基因流(Nm)等。用MEGA3󰀁1

[21]

计算不同序列间的碱基组成、变异

2󰀁结󰀁果

2󰀁1󰀁三疣梭子蟹群体CR和CO󰀂基因部分序

列碱基组成󰀁经PCR扩增,均得到了特异性很好的CR基因片段和CO󰀂基因片段(图1)。电泳检测表明,CR和CO󰀂序列长度大约分别为600bp和700bp,测序结果通过BLAST分析比较确认所得片段为CR和CO󰀂基因片段。经ClustalW同源排序,除去引物和部分端序列得到了长度为530bp和584bp的序列。

位点、简约信息位点和不同地理种群的Kimura2󰀂paramter遗传距离,采用邻接法(NJ)构建分子系统树。用ARLEQUINVersion3󰀁1

[22]

中的分子

变异分析(analysisofmolecularvariance,AMOVA)方法分析群体间及不同组群间的遗传分化指数(Fst),并用排列测验法(Permutationtest)检验Fst的显著性(重复次数为1000)。

图1󰀁三疣梭子蟹mtDNACR及CO󰀂基因部分片段

Fig.1󰀁mtDNACRgeneandCO󰀂genefragmentsofP.trituberculatus

M.D2000DNA分子量标准;1~9󰀁控制区片段,分别为潍坊、黄骅、青岛、连云港、象山、莆田、南澳、湛江、乌石群体;

10~18󰀁CO󰀂片段,分别为潍坊、黄骅、青岛、连云港、象山、莆田、南澳、湛江、乌石群体。M.D2000DNAladdermarker;1-9󰀁CRgeneofWeifang,Huanghua,Qingdao,Lianyungang,Xiangshan,Putian,Nan∃ao,ZhanjiangandWushistock;10-18󰀁CO󰀂geneofWeifang,Huanghua,

Qingdao,Lianyungang,Xiangshan,Putian,Nan∃ao,ZhanjiangandWushistock.

󰀁󰀁利用MEGA3󰀁1软件计算三疣梭子蟹群体控制区序列碱基组成(表1),CR基因序列T、C、A、G和A+T的平均含量分别为36󰀁6%、16󰀁1%、36󰀁6%、10󰀁7%、73󰀁2%,A+T含量显著高于G+C含量。同样,计算三疣梭子蟹群体CO󰀂序列碱基组成(表2),CO󰀂基因序列T、C、A、G和A+T的平均含量分别为35󰀁9%、21󰀁3%、26󰀁3%、16󰀁5%、62󰀁2%,A+T含量显著高于G+C含量。

2󰀁2󰀁三疣梭子蟹群体遗传多样性分析󰀁利用DnaSp4󰀁0软件计算群体遗传多样性参数,结果分别见表3和表4。

󰀁󰀁

表1󰀁三疣梭子蟹9个群体CR基因片段的

碱基组成(%)

Table1󰀁BasecompositionsofCRgenefragmentsof

ninestocksofP.trituberculatus

群体Stocks潍坊Weifang黄骅Huanghua青岛Qingdao连云港Lianyungang象山Xiangshan莆田Putian南澳Nan∃ao湛江Zhanjiang乌石Wushi平均值Average

T36󰀁636󰀁636󰀁736󰀁836󰀁836󰀁636󰀁536󰀁636󰀁436󰀁6

C16󰀁116󰀁216󰀁016󰀁015󰀁916󰀁116󰀁316󰀁116󰀁416󰀁1

A36󰀁836󰀁536󰀁736󰀁436󰀁436󰀁636󰀁636󰀁736󰀁636󰀁6

G10󰀁510󰀁710󰀁610󰀁910󰀁910󰀁710󰀁610󰀁610󰀁610󰀁7

A+T73󰀁473󰀁173󰀁473󰀁273󰀁273󰀁273󰀁173󰀁373󰀁073󰀁2

2期冯冰冰等:我国沿海三疣梭子蟹9个野生群体线粒体CR和CO󰀂片段比较分析

󰀁󰀁󰀁&31&

表2󰀁三疣梭子蟹9个群体CO󰀂基因片段的

碱基组成(%)

Table2󰀁BasecompositionsofCO󰀂genefragments

ofninestocksofP.trituberculatus

群体Stocks潍坊Weifang黄骅Huanghua青岛Qingdao连云港Lianyungang象山Xiangshan莆田Putian南澳Nan∃ao湛江Zhanjiang乌石Wushi平均值Average󰀁󰀁

T36󰀁036󰀁035󰀁936󰀁036󰀁036󰀁035󰀁935󰀁935󰀁835󰀁9

C21󰀁321󰀁221󰀁321󰀁221󰀁221󰀁221󰀁321󰀁321󰀁421󰀁3

A26󰀁326󰀁426󰀁326󰀁426󰀁226󰀁426󰀁326󰀁426󰀁426󰀁3

G16󰀁516󰀁516󰀁516󰀁416󰀁616󰀁516󰀁416󰀁416󰀁416󰀁5

A+T62󰀁362󰀁462󰀁262󰀁462󰀁262󰀁462󰀁262󰀁362󰀁262󰀁2

(parsimonyinformativesites),其中缺失󰀁插入位点2个,转换位点76个,颠换位点3个,转换、颠换同时存在位点10个,转换与颠换的比值为6󰀁6∋

1,平均核苷酸差异数为12󰀁117,核苷酸多样性指数为0󰀁02295(0󰀁00072。结果显示,潍坊和黄骅群体遗传多样性参数较高,青岛和象山群体遗传多样性参数较低,且群体内部没有显著差异。而根据CO󰀂基因序列计算遗传多样性参数,在94个三疣梭子蟹个体中,共检测到了34个单倍型,且所有群体只有一个共享单倍型,34个核苷酸多态位点,包括18个单一变异位点,16个简约信息位点,转换位点23个,颠换位点9个,转换、颠换同时存在位点2个,转换与颠换的比值为2󰀁3∋1,平均核苷酸差异数为2󰀁12583,核苷酸多样性指数为0󰀁003(0󰀁00036。连云港群体遗传多样性参数较高,湛江群体遗传多样性参数较低,且群体内部没有显著差异。

󰀁󰀁根据CR基因序列计算遗传多样性参数,在83个三疣梭子蟹个体中,共检测到了66个单倍型,且每个群体都具有各自的单倍型,91个核苷酸多态位点,包括27个单一变异位点(singletonvariablesites),个简约信息位点

表3󰀁三疣梭子蟹9个群体CR基因片段遗传多样性参数

Table3󰀁GeneticdiversityparametersofCRgenefragmentsamongninestocksofP.trituberculatus

群体Stocks潍坊Weifang黄骅Huanghua青岛Qingdao连云港Lianyungang象山Xiangshan莆田Putian南澳Nan∃ao湛江Zhanjiang乌石Wushi总数Total󰀁󰀁

个体数

Number999101010983

单倍型数Numberofhaplotypes

999979710966

单倍型多态性Haplotypediversity1󰀁000(0󰀁0521󰀁000(0󰀁0521󰀁000(0󰀁0520󰀁978(0󰀁00󰀁9(0󰀁0771󰀁000(0󰀁0520󰀁911(0󰀁0771󰀁000(0󰀁0451󰀁000(0󰀁0520󰀁992(0󰀁004

平均核苷酸差异数Averagenumberofnucleotidedifferences

13󰀁6666713󰀁444448󰀁6944410󰀁6666710󰀁2857112󰀁3055611󰀁2444411󰀁6000010󰀁7500012󰀁117

核苷酸多样性指数

Nucleotidediversity0󰀁02588(0󰀁002680󰀁021(0󰀁002300󰀁014(0󰀁002210󰀁02016(0󰀁002880󰀁01944(0󰀁0020󰀁02326(0󰀁002250󰀁02126(0󰀁002220󰀁02193(0󰀁002370󰀁02036(0󰀁003440󰀁02295(0󰀁00072

2󰀁3󰀁三疣梭子蟹群体遗传距离和聚类分析󰀁

从表5和表6可以看出,乌石群体与其他群体间的遗传距离较远,CR基因和CO󰀂基因显示结果基本一致。群体间的基因流值一部分大于5,说明群体间存在着一定的基因交流。利用

MEGA3󰀁1软件构建三疣梭子蟹9群体NJ分子进化树(图2,3)。聚类结果均显示黄海、东海、渤海6个群体聚为一大支,南海3个群体聚为一大支。

󰀁󰀁󰀁&32&

动物学杂志ChineseJournalofZoology

表4󰀁三疣梭子蟹9个群体CO󰀂基因片段遗传多样性参数

43卷

Table4󰀁GeneticdiversityparametersofCO󰀂genefragmentsamongninestocksofP.trituberculatus

群体

Stocks潍坊Weifang黄骅Huanghua青岛Qingdao连云港Lianyungang象山Xiangshan莆田Putian南澳Nan∃ao湛江Zhanjiang乌石Wushi总数Total󰀁󰀁

个体数

Number12111012101010114

单倍型数Numberofhaplotypes

778873634

单倍型多态性Haplotypediversity0󰀁833(0󰀁1000󰀁909(0󰀁0660󰀁956(0󰀁0590󰀁848(0󰀁1040󰀁911(0󰀁0770󰀁778(0󰀁1370󰀁4(0󰀁1520󰀁5(0󰀁1340󰀁929(0󰀁0840󰀁837(0󰀁035

平均核苷酸差异数Averagenumberofnucleotidedifferences

2󰀁272732󰀁036361󰀁555562󰀁969702󰀁822221󰀁666671󰀁311111󰀁0552󰀁4292󰀁12583

核苷酸多样性指数

Nucleotidediversity0󰀁003(0󰀁000870󰀁00349(0󰀁000780󰀁00266(0󰀁000370󰀁00509(0󰀁001230󰀁00483(0󰀁001030󰀁00285(0󰀁000940󰀁00225(0󰀁000690󰀁00181(0󰀁000480󰀁00420(0󰀁001050󰀁003(0󰀁00036

表5󰀁基于CR基因的三疣梭子蟹群体间基因流(上三角)和Kimura2󰀂paramter遗传距离(下三角)Table5󰀁Geneflow(upperright)andtheKimura2󰀂paramtergeneticdistance(lowerleft)between

theP.trituberculatusstocksbasedonCRgene

群体

Stocks黄骅Huanghua连云港Lianyungang

南澳Nan∃ao莆田Putian青岛Qingdao潍坊Weifang乌石Wushi象山Xiangshan湛江Zhanjiang󰀁󰀁

0󰀁02380󰀁02380󰀁02400󰀁02100󰀁02680󰀁02650󰀁02210󰀁0249

0󰀁02320󰀁02280󰀁01910󰀁020󰀁02610󰀁01960󰀁0229

0󰀁02250󰀁02100󰀁02660󰀁02200󰀁02260󰀁0238

0󰀁02010󰀁02560󰀁02590󰀁02190󰀁0241

0󰀁02280󰀁02600󰀁01800󰀁0214

0󰀁02880󰀁02420󰀁0271

0󰀁020󰀁0248

0󰀁0229

黄骅连云港

HuanghuaLianyungang

3󰀁52

南澳Nan∃ao4󰀁432󰀁30

莆田

Putian6󰀁023󰀁384󰀁87

青岛Qingdao4󰀁863󰀁632󰀁324󰀁45

潍坊

Weifang3󰀁442󰀁432󰀁193󰀁522󰀁76

乌石

Wushi1󰀁871󰀁243󰀁251󰀁660󰀁901󰀁38

象山Xiangshan5󰀁805󰀁482󰀁283󰀁7󰀁442󰀁841󰀁08

湛江Zhanjiang3󰀁462󰀁782󰀁563󰀁032󰀁322󰀁121󰀁792󰀁34

表6󰀁基于CO󰀂基因三疣梭子蟹群体间基因流(上三角)和Kimura2󰀂paramter遗传距离(下三角)Table6󰀁Geneflow(upperright)andtheKimura2󰀂paramtergeneticdistance(lowerleft)between

theP.trituberculatusstocksbasedonCO󰀂gene

群体Stocks黄骅Huanghua连云港Lianyungang

南澳Nan∃ao莆田Putian青岛Qingdao潍坊Weifang乌石Wushi象山Xiangshan湛江Zhanjiang󰀁󰀁

0󰀁00430󰀁00300󰀁00320󰀁00330󰀁00380󰀁00470󰀁00420󰀁0028

0󰀁00380󰀁00390󰀁00410󰀁00460󰀁00550󰀁00510󰀁0036

0󰀁00260󰀁00250󰀁00300󰀁00360󰀁00380󰀁0019

0󰀁00280󰀁00340󰀁00470󰀁00380󰀁0025

0󰀁00320󰀁00460󰀁00410󰀁0024

0󰀁00440󰀁00460󰀁0028

0󰀁00570󰀁0032

0󰀁0037

黄骅连云港

HuanghuaLianyungang

5󰀁62

南澳Nan∃ao3󰀁484󰀁39

莆田

Putian4󰀁096󰀁053󰀁72

青岛Qingdao2󰀁723󰀁503󰀁393󰀁82

潍坊

Weifang4󰀁044󰀁819󰀁924󰀁786󰀁31

乌石

Wushi1󰀁401󰀁691󰀁1󰀁031󰀁012󰀁37

象山Xiangshan4󰀁713󰀁782󰀁745󰀁052󰀁403󰀁111󰀁23

湛江Zhanjiang3󰀁043󰀁7617󰀁392󰀁712󰀁459󰀁102󰀁452󰀁22

2期冯冰冰等:我国沿海三疣梭子蟹9个野生群体线粒体CR和CO󰀂片段比较分析

󰀁󰀁󰀁&33&

图2󰀁基于CR基因三疣梭子蟹9个群体的

NJ分子进化树

Fig.2󰀁NJphylogenetictreebasedonCRofnine

stocksofPortunustrituberculatus

HH:黄骅群体;WF:潍坊群体;QD:青岛群体;LY:连云港群体;XS:象山群体;PT:莆田群体;NA:南澳群体;ZJ:湛江群体;WS:乌石群体;后图同。标尺0󰀁002为枝长标准,表示遗传距离。

HH:Huanghuastock;WF:Weifangstock;QD:Qingdaostock;LY:Lianyungangstock;XS:Xiangshanstock;PT:Putianstock;NA:Nan∃aostock;ZJ:Zhanjiangstock;WS:Wushistock.Assameasfollowingfig.3.Barof0󰀁002meanbranchscalebar.

图3󰀁基于CO󰀂基因三疣梭子蟹9个群体的

NJ分子进化树

Fig.3󰀁NJphylogenetictreebasedonCO󰀂ofnine

stocksofPortunustrituberculatus

标尺0󰀁0005为枝长标准,表示遗传距离。Barof0󰀁0005meanbranchscalebar.

2󰀁4󰀁三疣梭子蟹群体遗传结构󰀁AMOVA分析的结果显示,基于CR和CO󰀂,三疣梭子蟹9个群体间的遗传分化指数(Fst)分别为0󰀁034(P<0󰀁01)和0󰀁5319(P<0󰀁01),差异均极显著。同时按地域将9个群体分为渤海、黄海、东海和南海4个组群进行AMOVA分析,结果均显示,组群间的遗传分化均不显著(P>0󰀁05)。

按NJ树将9个群体中南海3个群体分为一组群,其他6个群体分为一组群体的组合进行AMOVA分析,结果均显示,组群间的遗传分化

极显著。除此之外,去除南海3个群体,对其他6个群体进行AMOVA分析,6个群体间的遗传分化不显著。

基于CR,三疣梭子蟹9个群体,进行群体间两两组对,共获得36个组对,其中27个组对

的Fst值统计检验为差异不显著(P>0󰀁05),4个组对的Fst值统计检验为差异显著(P<0󰀁05),5个组对的Fst值统计检验为差异极显著(P<0󰀁01)。基于CO󰀂,三疣梭子蟹9个群体

的36个组对中,29个组对的Fst值统计检验为差异不显著(P>0󰀁05),2个组对的Fst值统计检验为差异显著(P<0󰀁05),5个组对的Fst值统计检验为差异极显著(P<0󰀁01)(表7)。

3󰀁讨󰀁论

3󰀁1󰀁三疣梭子蟹CR和CO󰀂基因的碱基组成特点󰀁本研究表明,三疣梭子蟹mtDNACR基因碱基序列中AT平均含量为73󰀁2%,mtDNACO󰀂基因碱基序列中AT平均含量为62󰀁2%,明显高于GC含量,这与三疣梭子蟹[16]

、可口美

青蟹(Callinectessapidus)

[23]

、巨大拟滨蟹

(Pseudocarcinusgigas)[24]

、日本绒螯蟹中华亚种

(Eriocheirjaponicasinensis)[25]

等研究的AT平均

含量明显高于GC含量结果一致,符合节肢动物mtDNAAT含量高的规律[26]

。

3󰀁2󰀁遗传多样性分析󰀁在线粒体序列变异中,变异位点的转换较易在近亲种间频繁地发生,而颠换在较远缘种间逐渐明显;在同一物种中,转换往往在数量上远超过颠换[27]

。本研究中mtDNACR和CO󰀂序列转换与颠换比分别为6󰀁6∋1和2󰀁3∋1,这与核苷酸的替换主要以转换为主、转换多于颠换、表现较高的转换偏向[28]

的规律相符。由此可知,我国沿海四个海区的9个群体三疣梭子蟹线粒体变异仍为种内变异,并未发现亚种分化。

󰀁󰀁󰀁&34&

动物学杂志ChineseJournalofZoology表7󰀁三疣梭子蟹各群体间的遗传分化指数(Fst)

Table7󰀁Fixationindex(Fst)betweenanystocksofP.trituberculatus

43卷

群体

Stocks黄骅Huanghua

黄骅Huanghua连云港Lianyungang0󰀁02132

南澳

Nan∃ao莆田Putian青岛Qingdao-0󰀁020050󰀁017600󰀁08074-0󰀁01118

潍坊

Weifang0󰀁01959

乌石

Wushi0󰀁11174*

象山Xiangshan-0󰀁04355-0󰀁031310󰀁07850-0󰀁00058-0󰀁018650󰀁037720󰀁22203**

湛江

Zhanjiang0󰀁023480󰀁058090󰀁070610󰀁040510󰀁081040󰀁096630󰀁12569**0󰀁07370

-0󰀁00439-0󰀁038380󰀁08704*

0󰀁026-0󰀁01337

0󰀁020470󰀁03153-0󰀁0470󰀁11140

0󰀁017620󰀁004150󰀁24600**

连云港

-0󰀁00570

Lianyungang南澳Nan∃ao莆田Putian青岛Qingdao潍坊Weifang乌石Wushi象山Xiangshan湛江Zhanjiang

0󰀁03377

0󰀁01262

0󰀁07408**0󰀁20178**0󰀁090820󰀁016780󰀁04915

0󰀁033100󰀁13151*0󰀁27087**0󰀁16650*

0󰀁085350󰀁05287

0󰀁20253**0󰀁07348

0󰀁01510-0󰀁016170󰀁066580󰀁025550󰀁17969**0󰀁000720󰀁05556

0󰀁037800󰀁011900󰀁14761**0󰀁028800󰀁03344

-0󰀁019390󰀁25032**0󰀁08030*

0󰀁06061-0󰀁01101-0󰀁07456

0󰀁06721

0󰀁08209-0󰀁03828

0󰀁09838*

󰀁󰀁对角线上为基于CR基因,对角线下为基于CO󰀂基因。*表示差异显著(P<0󰀁05),**表示差异极显著(P<0󰀁01)。

LowerleftaboutCO󰀂gene,upperrightaboutCRgene.*Meansignificance(P<0󰀁05),**Meangreatsignificance(P<0󰀁01).

󰀁󰀁三疣梭子蟹9个群体mtDNACR和CO󰀂基因片段的核苷酸多样性指数分别为0󰀁02295(0󰀁00072和0󰀁00372(0󰀁00047,其中mtDNACR基因片段核苷酸多样性指数低于深圳海域斑节对虾(P.monodo)CR基因片段核苷酸多样性指数0󰀁052780󰀁0251(0󰀁0007

[29]

比较丰富,而且这也与同工酶研究舟山群体遗传多样性较高

[10]

的结果比较一致。

3󰀁3󰀁亲缘关系和遗传分化分析󰀁群体之间的遗传距离能反映群体间的亲缘关系。本研究中三疣梭子蟹9个群体基于CR和CO󰀂的遗传距离分别为0󰀁0180~0󰀁0288和0󰀁0019~0󰀁0057之间,虽然两个基因片段得到的群体间遗传距离有差异,但都反映了乌石群体与其他群体间的遗传距离较远,特别与黄海、东海、渤海三大沿海的群体距离较远。通过对三疣梭子蟹9个群体构建NJ分子进化树(图2,3),聚类结果显示,黄海、东海、渤海6个群体之间的相对遗传距离比较近,聚为一大支,而南海3个群体聚为一大支,这与我国东海以北的三大海域的地理位置相对比较近有一定的关系,而我国南海3个群体相对遗传距离比较近,表明黄海、东海、渤海三海域的三疣梭子蟹亲缘关系比较近。由此看来,我国四大沿海的三疣梭子蟹的亲缘关系在一定程度上反映了它们一定的地理分布情况,地位位置越近的群体其亲缘关系也越近,地

,接近日本对虾(P.

japonicus)CR基因片段核苷酸多样性指数

[30]

;mtDNACO󰀂序列核苷酸

[31]

多样性指数高于中国对虾(P.chinensis)CO󰀂基因片段核苷酸多样性指数(0󰀁0004)

,以及

小褐美对虾(P.subtilis)、保罗美对虾(P.paulensis)、巴西美对虾(Farfantepenaeusbrasiliensis)三种虾的CO󰀂基因片段核苷酸多样性指数(0󰀁0025,0󰀁0000,0󰀁0004)多样性指数(0󰀁0047)

[32]

[32]

,低于南方

滨对虾(P.schmitti)的CO󰀂基因片段的核苷酸

,说明我国沿海野生三

疣梭子蟹平均核苷酸多样性指数在亲缘关系较近的海洋物种中尚处于相对较高水平,同时其平均单倍型多态性比较高。综合这些数据表明,我国沿海野生三疣梭子蟹遗传多样性相对

2期冯冰冰等:我国沿海三疣梭子蟹9个野生群体线粒体CR和CO󰀂片段比较分析

󰀁󰀁󰀁&35&

理关系远的群体其亲缘关系也较远。

在AMOVA分析中,按NJ树将9个群体中南海3个群体分为一组群,其他6个群体分为

一组群体的组合,CR和CO󰀂结果均显示,组群间的遗传分化极显著。同样,AMOVA分析两两群体间的Fst值显示,南海的乌石群体与南海以外的其他群体间的Fst值统计检验都是差异显著(P<0󰀁05)和差异极显著(P<0󰀁01)。由此过程中,应该采取增大繁殖群体、定期筛选等措施来防止因近交衰退和遗传漂变等导致的遗传多样性水平降低,以保护我国具有较高经济价值的三疣梭子蟹优良种质资源。参󰀁考󰀁文󰀁献

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出版社,1986,194~196󰀁

可以推测,我国沿海三疣梭子蟹至少存在两大类群,一个位于南海,另一个位于东海和东海以北。在过去的80万年里,气候约以10万年的周期波动;冰期引起的海平面变化非常强烈,冰

盛期的海平面大约下降120~140m[33]

。由于冰期的海平面下降,海峡成为陆桥,致使亚洲与岛通过陆桥相连[34,35]

。更新世冰期的气候变迁导致海平面下降使西北太平洋边缘海之间产生隔离,有可能成为我国沿海三疣梭子蟹两大类群之间产生分化的原因。此类遗传分化也存在于我国泥蚶(Tegillarcagranosa)

[36]

和青蛤(Cyclinasinensis)

[37]

等海洋生

物群体间。

一般来说,当群体间基因流大于5时,能维持一个均一的基因库

[38]

。从表5和表6可以看

出,两两群体间基因流大于5的情况基本出现于同一类群中。至于为何基于CO󰀂片段分析的潍坊群体分别与南澳、湛江群体间的基因流大于5,尚待进一步研究。

本研究从线粒体CR基因和CO󰀂基因部分序列获得的我国沿海野生三疣梭子蟹的遗传多样性参数,在一定程度上说明了目前我国沿海野生三疣梭子蟹的遗传多样性相对来说比较丰富;从AMOVA分析得到我国沿海野生三疣梭子蟹存在一定程度的遗传分化,可以明显分为南北两大类群,因此要对南北两大类群展开合理有效保护,防止种质退化。特别是近些年来,我国东海及其以北的沿海开展了大规模的三疣梭子蟹人工养殖、半人工采苗、人工育苗等养殖活动,增加了个体间的基因交流,可能会对三疣梭子蟹的遗传多样性造成一定影响,所以要提前进行种质资源保护,在人工养殖和育种

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