野生软枣猕猴桃离体培养体系的建立及优化

北方园艺ｚｏｎ（１５）：１５７～１６０　・生物技术・　野生软枣猕猴桃离体培养体　系的　建立及优化　朴一龙，朴日子　（延边大学农学院，吉林延吉１３３０００）　摘要：以长白山野生软枣猕猴桃茎段作为外植体，采用６一ＢＡ配合ＮＡＡ以及ＺＴ配合　ＮＡＡ　２种组合研究了适于野生软枣猕猴桃离体再生的类型和植物生长调节剂组合，筛选各培养　阶段高频、稳定的适宜培养基，建立了野生软枣猕猴桃离体培养快繁体系。结果表明：外植体以　侧芽为佳。６一ＢＡ　１．０　ｍｇ／Ｌ十ＮＡＡ　０．５　ｍｇ／Ｌ组合的ＭＳ培养基对不定芽分化最为有利，分化率　可达９５．８３　。分化后得到的不定芽在６－ＢＡ　２．０　ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ　０．０５　ｍ＿ｇ／Ｌ的ＭＳ培养基上平均　每外植体分化不定芽数达５．８６个。适宜的生根培养基为１／２ＭＳ＋ＩＢＡ　０．１　ｍｇ／Ｌ，生根率高达　１００　。采用２步移栽法进行移栽时，第１次移栽以河沙为基质移栽成活率可达９６．６７　，第２次　移栽成活率９８　。　关键词：软枣猕猴桃；离体培养；茎段；培养基　中图分类号：Ｓ　６６３．４０３．６文献标识码：Ａ文章编号：１００１－－０００９（２０１１）１５—０１５７一Ｏ４　软枣猕猴桃（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ　ａｒｇｕｔａ）为猕猴桃科猕猴桃　属藤本植物，是当今世界新兴果树，在国际市场上享有　很高声誉的珍贵野生果树之一ｌＬ】］。适于我国东北地区　栽培的软枣猕猴桃，果实酸甜适口、柔软多汁、美味独　特，含有丰富的多种营养物质，适作多种食品饮料的开　发利用＿２］。由于富含多种人体必要的氨基酸、矿物质　和维生素，具有多种医疗保健功效，同时也是城市绿化　的好树种＿３］。该树种人工栽培基本无病虫害发生，所　以果实无任何污染，是理想的绿色食品和疗效食品，已　成为当前一种价值高、发展前途广的野生果树＿４］。软　组培过程中的一些技术问题，如外植体所产生的愈伤　组织再分化能力方面。但前人研究的所得结论差异较　大，如参数变幅大，植物激素和浓度不同等。该试验以　长白山野生软枣猕猴桃茎段为外植体，对影响其组织　培养快繁效率的多种激素因子和外植体所产生的不定　芽、芽苗增殖及生根诱导等一系列问题进行了研究，筛　选各培养阶段最佳培养基配方，建立了野生软枣猕猴　桃组织培养高频植株体系。旨在为短期内获得大量种　苗的大规模商业化生产提供理论依据。　枣猕猴桃种子繁殖遗传变异大，采用常规无性繁殖法　绿枝扦插【５］，繁殖速度慢，存在着繁殖系数低，占地面　积大，受母株取材季节限制，影响优良品种的开发和规　模化生产的需求。因此，利用组织培养技术是当前软　枣猕猴桃优良种苗生产的主要途径和有效方法。目　前，软枣猕猴桃品种很多，但真正各项性状都比较优秀　的品种很少　］。课题组在长白山一带资源考察过程　中，发现了果实较大、酸甜适口、果皮红绿而无毛的野　１材料与方法　１．１试验材料　野生软枣猕猴桃，２００９年秋季，由延边大学农学　院园艺系朴一龙副教授在长白山一带资源考察过程中　发现的品种优良、大果野生软枣猕猴桃树，移植于试验　果树农场基地内。试材为第２年早春该移栽树上的生　长健壮、无病虫害新梢作外植体。　１．２试验方法　生软枣猕猴桃。为使这一优良品种存续下来，并快速　应用于生产，对其进行了组织培养研究。关于软枣猕　猴桃的组培研究虽有报道ｌ＿ｌ　］，这些研究主要关注的是　将试验材料带回实验室，剪去叶片，切成３～４　ｃｍ　的小段，用自来水冲洗干净，再用洗衣粉溶液浸泡２～　第一作者简介：朴一龙（１９６２－），男，吉林图们人，博士，现主要果树　栽培研究工作。Ｄｍａｉｌ：ｐｉａｏｌｙ＠ｙｂｕ．ｅｄｕ．ｃｎ。　责任作者：朴日子（１９５８＿），女，吉林龙井人，高级实验师，现主要从　事植物组织培养及园艺植物育种工作。Ｅ－ｍａｉｌ：ｒｉｚｉｐｉａｏ＠ｙａｈｏｏ．　ＣＯＦＦ￣，ｅｌｉ．。　基金项目：国家自然科学基金资助项目（３１０６０２５４）。　收稿日期：ｚｏＵ—Ｏ４—２８　３　ｍｉｎ，并用软毛刷洗腋芽基部，将刷洗后的外植体用　流水冲洗２　ｈ，在无菌条件下，用７５％酒精消毒１５　Ｓ，无　菌水冲洗２次，之后往０．１　的升汞消毒３　ｍｉｎ，无菌水　冲洗５～６次，然后，将材料切成０．５　ｃｍ长的小段供接　种用。　消毒后的茎段外植体接种于以ＭＳ为基本培养　基，附加不同植物激素组成的６种芽分化培养基中，每　天观察生长状况，培养２８　ｄ后调查芽分化情况，筛选　出芽分化适宜培养基。将３种不同类型外植体分别接　种在ＭＳ＋６一ＢＡ　１．０　ｒａｇ／Ｌ＋ＮＡＡ　０．５　ｍｇ／Ｌ培养基上　培养３０　ｄ，观察芽的分化及生长情况。　ｌ５７　・生物技术・　将外植体上萌发的嫩梢单个切下后，转入不同细　胞分裂素和生长素组合的８种培养基上，培养３０　ｄ后，　调查芽分化数及生长状况，统计增殖系数。以１／２ＭＳ　为基本培养基，分别加入ＩＢＡ　０．０５、０．１、０．２、０．３ｍｇ／Ｌ　共４个处理，接种２～３　ＣＩＴＩ高的试管苗嫩茎进行生根　培养，２０　ｄ后调查生根率和根系生长状况。移栽练苗　基质采用河沙、腐殖土及珍珠岩，二者单独或者混合使　用，１５　ｄ后统计幼苗成活率。　所有培养基均含蔗糖３　，琼脂０．８　，ｐＨ　５．８～　６．０。培养温度为（２５±２）℃，光照强度为１　５００～　２　０００　ｌｘ，光照时间为１４　ｈ／ａ，每天进行观察。３次重　复，取平均值，用ＳＰＳＳ　１１．５统计软件对试验结果进行　方差分析。　２结果与分析　２．１不同培养基对外植体芽分化的影响　由表１可知，６种培养基配方均能诱导芽的分化，　但芽的分化率和生长状态上有显著性差异。４号处理　显著高于其它处理，接种４　ｄ就可以看到芽萌动，２８　ｄ　芽分化率达到了９５．８３　。次之是６号处理，芽分化率　达８７．５０　。３号培养基上芽分化率最低，仅为　４１．６７　。而从分化出的芽生长情况来看，６种培养基　上分化出的芽生长状况也明显不同。４号培养基上芽　生长状况最好，生长健壮，叶色绿。２号和６号培养基　上分化出的芽叶色黄绿，１号、５号培养基上分化出的　芽矮，叶小，长势很一般。在附加ＧＡ。的３号培养基上　分化出的芽，畸形芽多，单叶未张开，后期出现芽枯死。　总而言之，野生软枣猕猴桃芽诱导以４号培养基ＭＳ＋　６－ＢＡ　１．０　ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ　０．５　ｍｇ／Ｌ的诱导效果最好。　表１　不同培养基对外植体芽分化的影响　注：显著水平Ｐ≤Ｏ．０５，下表同。　２．２不同外植体类型对芽分化的影响　由表２可看出，３种类型外植体均能诱导芽的分　化，但诱导效果有差异显著。以侧芽的再生芽分化率　显著高于其它处理。芽分化率高达９３．３３　，顶芽次　之，芽分化率可达８３．３３　，最低的是无芽茎段外植体，　芽分化率仅有３Ｏ．（）０　。不论从芽萌发时间，还是芽生　长状况来看，侧芽和顶芽作为外植体明显优于无芽茎　段外植体。可能是不同外植体中细胞的分化程度不　同，所以，脱分化和再分化难易程度也不同ｌ６ｊ。无芽茎　段外植体通过脱分化先形成愈伤组织再形成芽，还需　要一定的萌发时间，易产生遗传变异。这说明主要是　由于在这些组织部位中分生组织的分布不同，其中生　长迅速的顶芽、侧芽中均含有较多的分生组织，因此有　１５８　北方园艺２０１１（１５）：１５７～１６ｏ　利于再生芽诱导。而与顶芽外植体相比，侧芽外植体　更有利于芽分化效果，不仅芽分化率高，而且芽生长最　为健壮，经３０　ｄ培养，平均株高４．７８　ｃｍ，且芽苗叶片　深绿而厚大，适宜进行不定芽的诱导。即野生软枣猕　猴桃组织培养时选择侧芽作为外植体的分化效果优于　顶芽。　表２不同外植体类型对芽分化及生长的影响　外植体　调查数开始萌发时间芽分化率　芽生长状况　类型　／个　／ｄ　／　顶芽　３Ｏ　４　８３．３３ｂ　生长较好，芽苗高平均２．８６　ｃｍ　侧芽　３０　５　９３．３３ａ　生长健壮，芽苗高平均４．７８　ｃ　无芽茎段　３Ｏ　１０　３０．００ｃ　生长一般，芽苗高平均１．０４　ｃｍ　２．３不同细胞分裂素对不定芽增殖的影响　试管苗的增殖率受培养基中细胞分裂素的控制。　细胞分裂素可打破植物顶端优势促进侧芽的连续萌发　从而提高增殖率　Ｊ。该试验在增殖培养基上选取６一ＢＡ　和ＺＴ　２种细胞分裂素作为参试因子，它们对继代培养　的增殖倍数、平均株高的影响结果见图１、２。结果表　明，各处理之间明显不同。　—＿增值倍数　瞧　皂　＼　袒　逛　霹　磐　６－ＢＡ浓度／ｍｇ・Ｌ。　图１　６一ＢＡ处理对不定芽增殖的影响　■●一增值倍数　４　５　敬３　４　暑　蓬ｚ　３谴　龋　ｚ萋　ｌ　ｌ争　０　０．５　１　２　３　Ｏ　ｚＴ浓度／ｍｇ・Ｌ　图２　ＺＴ处理对不定芽增殖的影响　６－ＢＡ和ＺＴ增殖倍数、平均株高都随浓度的升高　先升高再降低。增殖倍数来看，６－ＢＡ处理优于ＺＴ处　理，当６一ＢＡ浓度为２．０　ｍｇ／Ｌ时的增殖倍数为５．８６都　高于其它处理。平均株高来看，ＺＴ处理普遍优于　６－ＢＡ处理，当ＺＴ浓度为１．０　ｍｇ／Ｌ时，平均株高达到　４．２８　ｃｍ，也明显高于其它处理。但ＺＴ处理的增殖倍　数较低。根据试验过程观察，６－ＢＡ处理生长多为丛生　苗，叶片正常，茎节较短，植株较正常（图３）。在ＺＴ处　理中，叶子偏大，茎节长、植株高，多为单苗，有少数丛　生苗。比较２种细胞分裂素的处理结果，使用６－ＢＡ的　处理优于ＺＴ处理。综合上述研究结果，６－ＢＡ是野生　软枣猕猴桃增殖生长阶段适宜的细胞分裂素类型，且　北方园艺２０１１（１５）：１５７～１６０　以２．０　ｍｇ／Ｌ浓度为宜。　・生物技术・　２．４不同ＩＢＡ浓度对试管苗生根的影响　从表３可看出，试管苗在附加不同质量浓度ＩＢＡ　的培养基上均能生根，并且生根率达９Ｏ　以上。当　ＩＢＡ浓度在０．Ｏ５～Ｏ．２　ｍｇ／Ｌ范围内，随着ＩＢＡ质量浓　度的提高，生根率也增加，浓度０．１、０．２　ｍｇ／Ｌ时生根　率高达１００　。但当浓度达到０．３　ｍｇ／Ｌ时生根率为　９１．６７　，有较多的愈伤块。这说明ＩＢＡ浓度抑制芽苗　的生根。４种处理的根系生长质量上，有显著性差异。　质量浓度０．１　ｍｇ／Ｌ和０．２　ｍｇ／Ｌ相比，０．１　ｍｇ／Ｌ处理　显著高于０．２　ｍｇ／Ｌ处理，新梢生根时间最短６　ｄ，生成　的根最多，平均有７．６９条主根，根系也最长，平均有　２．６９　ｃｍ。随着ＩＢＡ质量浓度的增加，根系生长质量指　标有下降趋势，新梢基部形成较多的愈伤组织，阻碍了　根系的形成和生长，影响了移栽练苗的成活率。该研　究中野生软枣猕猴桃试管苗生根培养最佳培养基为　１／２ＭＳ＋ＩＢＡ　０．１　ｍｇ／Ｌ。　表３不同ＩＢＡ浓度对生根率及根系生长的影响　２．５生根苗移栽及管理　先将生根试管苗的封口打开，在室内放置１　ｄ，取　出幼苗后，洗净根上的培养基，移栽到３种不同练苗基　质中，１５　ｄ后统计１次成活率（表４）。从表４可看出，　河沙基质的移栽苗成活率最高达９６．６７　９／６，显著高于其　它处理。次之是田土：珍珠岩的处理，即有８６．６７　，比　例为１：２的河沙。腐殖土基质移栽成活率最低，仅为　７３．３３　。这说明河沙基质透气性强，幼苗根系不易腐　烂，从而表现出了良好的练苗效果。因此，试管生根苗　最适宜的第１次练苗基质是河沙基质好。将成活的幼　苗移到河沙：腐殖土（１：２）的花盆中，精心管理，幼苗生　长迅速，木质化程度不断增加，移栽２０　ｄ的二次成活　率可达９８　（图４）。　表４不同基质对试管生根苗一次成活率的影响　３结论与讨论　植物组织培养中外植体芽的诱导不仅与生长调节　剂的种类有关，而且与其组合浓度有关。大量研究表　明，组织培养过程中细胞分裂素对不定芽诱导起作用，　不同种类的细胞分裂素对不同材料的作用差异较大，　但大多数种类以６－ＢＡ最为有效。在试验中，６－ＢＡ比　ＺＴ更有利于不定芽的诱导。这与前人研究结果　相似　。　图３野生软枣猕猴桃在瓶内增殖生长情况　图４野生软枣猕猴桃移栽花盆成苗情况　外植体再生能力不同早有报道，可能是不同外植　体中细胞的分化程度不同，所以脱分化和再分化难易　程度不同［４］。该研究中发现，侧芽和顶芽比无芽茎段　容易脱分化和再分化，侧芽和顶芽相比，侧芽不仅材料　消毒容易，萌发率也高，芽生长健壮而快，而且遗传性　也稳定Ｌ８］。顶芽易形成愈伤组织，然后再分化不定芽，　易产生遗传变异＿＿９］。　周玲艳等　以芽段为材料，在与该试验培养的培　养基上诱导不定芽，分化率为１００　，与该试验的结果　不一致，原因可能是所用材料不同所致，周玲艳所用的　材料是试管培养材料。２种外植体所产生的分化能力　方面有显著差别。可能与不同外植体来源不同，期内　原激素水平不同有关。　激素是植物组织培养器官分化的关键因素，形成　器官的类型由培养基中不同激素的相对浓度控制，而　不是这些物质的绝对浓度决定ｌ１　。侧芽是野生软枣　猕猴桃离体培养的理想外植体，用ＭＳ＋６－ＢＡ　１．０　ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ　０．５　ｍｇ／Ｌ做培养基诱导产生不定　芽，芽分化率达９５．８３％。用ＭＳ＋６－ＢＡ　２．０　ｍｇ／Ｌ＋　ＮＡＡ　０．０５　ｍｇ／Ｌ做不定芽的增殖培养基，增殖倍数达　５．８６，用１／２ＭＳ＋ＩＢＡ　０．１　ｍｇ／Ｌ做培养基诱导生根，　生根率达１００　。　参考文献　［１３刘瑞林，张春来，孟黎明．软枣猕猴桃的组织培养［Ｊ］．中国林副特　产，２ＯＯｌ（３）：５８．　［２１李昌禹，赵淑兰．软枣猕猴桃组织培养研究［Ｊ］．特产研究，１９９８　（１）：１９—２１．　［３３朴一龙，赵兰花．软枣猕猴桃研究进展［Ｊ］．北方园艺，２００８（３）：　７６—７８．　［４３赵淑兰，李继海，屈慧鸽，等．软枣猕猴桃绿枝扦插繁殖及快速成　苗试验［Ｊ］．特产研究，１９９９（４）：４６—５９．　［５］王晓春．软枣猕猴桃播种与嫁接育苗方法［Ｊ３．特种经济动植物，　１５９　・生物技术・　北方园艺２ｏ１１（１５）：１６ｏ～１６２　丝瓜ＳＲＡＰ反应体　系的　建立与优化　李莲芳，郭　爽，林鉴荣　（广州市农业科学研究院，广东广州５１０３０８）　摘要：以丝瓜基因组ＤＮＡ为模板，采用正交实验设计Ｌ】　（４　），在４个水平上对影响丝瓜　ＳＲＡＰ反应的Ｔａｑ酶、Ｍ　、模板、ｄＮＴＰ及引物等５个因素进行了优化，建立了丝瓜ＳＲ　ＰＣＲ　的最佳反应体系。利用１８份丝瓜自交系材料来验证此反应体系，均可扩增出清晰、可辨的条带，　可见该反应体系较稳定，适用于丝瓜Ｓ№　标记的扩增。　关键词：丝瓜；ＳＲＡＰ；体系优化　中图分类号：Ｓ　６４２．４０３．６文献标识码：Ａ文章编号：１００１－－０００９（２０１１）１５—０１６０—０３　丝瓜（Ｌｕｆｆａ　ａｃｕｔａｎｇｕｌａ）为葫芦科　（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）丝瓜属（Ｌｕｆｆａ）１　ａ生攀缘性草本植　物，以嫩果供食用，是深受人们喜爱的夏季蔬菜。在生　产上分为普通丝瓜和有棱丝瓜２个栽培种，在我国南　北方均有栽培，近年来栽培面积呈扩大趋势，育种研究　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，序列相关扩增多态性）是由Ｌｉ和Ｑｕｒｉｏｓ　开发的一种新的分子标记技术＿１］，该标记具有多态性　工作也得到深入开展，新育成品种不断出现。但是，丝　瓜的分子生物学研究进展还比较缓慢。　ＳＲＡＰ分子标记（ＳｅｑｕｅｎｃＰｒｅｌａｔｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　第一作者简介：李莲芳（１９６８－），女，广东广州人，高级农艺师，现主　要从事蔬菜育种研究工作。　责任作者：林鉴荣（１９６４一），男，研究员，现主要从事蔬菜育种研究　工作。　高、信息量丰富、操作简便、重复性好、成本低等特点。　目前已在大葱［２］、番茄　］、黄瓜　］、油菜［５　等蔬菜作物　中广泛应用。主要用于生物遗传多样性分析、基因定　位、基因克隆、基因图谱构建以及比较基因组学等方面　的研究。ＳＲＡＰ标记是基于ＰＣＲ的标记系统，因此，　ＰＣＲ反应体系中涉及的Ｍ　、模板ＤＮＡ、Ｔａｑ酶、引　物、ｄＮＴＰ等的浓度均会影响扩增结果，并最终影响　ＳＲＡＰ标记结果。　该研究利用正交实验设计分析法［６］，对ＰＣＲ反应　基金项目：广州市科技局资助项目（２０１０Ｚ１一Ｅ３８１）。　收稿日期：２Ｏｌ１一Ｏ４—２８　体系中几个主要影响因子进行了优化筛选，建立了丝　瓜ＳＲＡＰ－ＰＣＲ的最佳反应体系，以期为丝瓜ＳＲＡＰ分　子标记、遗传多样性分析、基因定位、图谱构建等分子　生物学方面的研究奠定基础。　［８３王蒂．植物组织培养ＥＭ３．北京：中国农业出版社，２００４（６）：２８—３０．　［９］崔澄．植物激素与细胞分化及形态发生的关系ＥＪ３．细胞生物学杂　志，１９８３，５（２）：卜５．　２０１０（３）：４卜４２．　［６３周玲玲，秦华明，赖幸韵，等．猕猴桃实生苗组织培养的研究［Ｊ］．北　方园艺，２００７（５）：１９８—２００．　［７３黄文江，周守标，阚显照，等．越橘属植物克隆的体外繁殖ＥＪ３．中国　野生植物资料，２００５（２）：６２—６４．　ＥｌＯ］刘剑锋，阎秀峰，李霞，等．高山红景天叶片愈上组织诱导与植物　再生ＥＪ］．东北林业大学学报，２００７（２）：３３—３４．　Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ　Ｗｉｌｄ　Ａｃｔｉｎｉｄｉａ　ａｒｇｕｌａ　ＰＩＡＯ　Ｙｉ－ｌｏｎｇ，ＰＩＡＯ　Ｒｉ—ｚｉ　（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａ１，Ｙａｎｂｉａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｊｉ，Ｊｉｌｉｎ　１３３０００）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｓｔｅｍ　ｓｅｇｍｅｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ｅｘｐｌａｎｔｓ，ｔｈｅ　ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｈａｎｇｂａｉ　ｍｏｕｎｔａｉｎ　ｗｉｌｄ　Ａｃｔｉｎｉｄｉａ　ａｒｇｕｌａ　ｗｅｒｅ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｔｏ　ａｃｈｉｅｖｅ　ａｎ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｓｙｓｔｅｍ，ｔｈｅ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　６一ＢＡ　ａｎｄ　ＮＡＡ　ｗａｓ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＺＴ　ａｎｄ　ＮＡＡ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｓｔｅｍ　ｅｘｐｌａｎｔｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｔｕｂｅ　ｒａｐｉｄ　ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ｅｘｐｌａｎｔｓ　ｗａｓ　ｌａｔｅｒａｌ　ｂｕｄｓ：ｔｈｅ　ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ　ｍｅｄｉａ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ＭＳ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　６一ＢＡ　１．０　ｍｇ／Ｌ　ａｎｄ　ＮＡＡ　０．５　ｍｇ／Ｌ，ｔｈｅ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｒａｔｅｓ　ｗｅｒｅ　９５．８３　；Ｔｈｅ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ　ｂｕｄ　ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｕｐ　ｔｏ　５．８６　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｏｎ　ＭＳ　ｗｉｔｈ　６一ＢＡ　２．０　ｍｇ／Ｌ　ａｎｄ　ＮＡＡ　０．０５　ｍｇ／Ｌ．Ｆｏｒ　ｒｏｏｔｉｎｇ，ｔｈｅ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｍｅｄｉａ　ｗａｓ　１／２　ＭＳ＋ＩＢＡ　Ｏ．１　ｍｇ／Ｌ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｏｏｔｉｎｇ　ｒａｔｅ　ｗａｓ　１００　．Ｔｈｅ　ｒｏｏｔｅｄ　ｐｌａｎｔｌｅｔｓ　ｗｅｒｅ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ　ｔｏ　ｓｕｂｓｔｒａｔａ　ｉｎ　ｔｗｏ　ｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅ　ｓｔｅｐｓ．ｔｈｅ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｒａｔｅｓ　ｏｆ　ｗｈｉｃｈ　ｗｅｒｅ　９６．６７　ａｎｄ　９８　９／６　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ａｃｔｉｎｉｄｉａ　ａｒｇｕｌａ；ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ；ｍｅｄｉａ；ｓｔｅｍ　ｓｅｇｍｅｎｔｓ　１６Ｏ