(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 108267576 A(43)申请公布日 2018.07.10
(21)申请号 201710006139.0(22)申请日 2017.01.03
(71)申请人 深圳市新产业生物医学工程股份有
限公司
地址 518052 广东省深圳市坪山新区金沙
社区金辉路16号(72)发明人 饶微 魏亚庆 袁锦云 刘蕾
李婷华 许然 (74)专利代理机构 深圳市盈方知识产权事务所
(普通合伙) 44303
代理人 杨贤(51)Int.Cl.
G01N 33/533(2006.01)G01N 33/543(2006.01)
(54)发明名称
经修饰的CCP抗原及其用途和抗CCP抗体检测试剂盒及其制造方法(57)摘要
本发明属于体外诊断技术领域，具体涉及一种经修饰的CCP抗原，所述CCP抗原具有下式I所
权利要求书2页 说明书19页
示的序列：其中，
式I中的谷氨酸E的羧羟基被R基团取代，所述R基团选自：C1-10烷基氧基，C1-10烷基-CO-NH-基和C1-10烷基-CO-NH-NH-基；所述C1-10烷基任选被一个或多个选自C1-4烷基，C1-4烷基氧基，羟基，氨基，硝基和苯基的取代基取代。本发明还涉及该抗原用于检测抗CCP抗体的用途，包括该抗原的抗CCP抗体检测试剂盒及其制造方法。本发明的优势包括经修饰的CCP抗原连接蛋白载体后的衍生物的抗原活性更高；抗CCP抗体检测的精密度更高；抗CCP抗体检测的准确度更高。
CN 108267576 ACN 108267576 A
权 利 要 求 书
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1.一种经修饰的CCP抗原，所述CCP抗原具有下式I所示的序列：
其特征在于，式I中的谷氨酸E的羧羟基被R基团取代，所述R基团选自以下一种或多种：C1-10烷基氧基，C1-10烷基-CO-NH-基和C1-10烷基-CO-NH-NH-基；所述C1-10烷基任选被一个或多个选自C1-4烷基，C1-4烷基氧基，羟基，氨基，硝基和苯基的取代基取代。
2.如权利要求1所述的经修饰的CCP抗原，其特征在于，所述R基团选自以下一种或多种：C1-5烷基氧基，C1-5烷基-CO-NH-基和C1-5烷基-CO-NH-NH-基。
3.如权利要求1所述的经修饰的CCP抗原，其特征在于，所述R基团选自以下一种或多种：甲基氧基，乙基氧基，叔丁基氧基，苯甲基氧基，二苯甲基氧基，乙酰胺基和乙酰肼基。
4.如权利要求1-3任一项所述的经修饰的CCP抗原用于制备抗CCP抗体检测试剂的用途。
5.一种抗CCP抗体检测试剂盒，所述试剂盒包括组分A和组分B，其特征在于，所述组分A包括磁性微球，所述磁性微球被与蛋白载体偶联的权利要求1-3任一项所述的经修饰的CCP抗原包被，
所述组分B包括被鼠抗人IgG二抗标记的发光标记物溶液。6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述发光标记物选自：鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物，辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。
7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述蛋白载体选自：牛血清白蛋白(BSA)，阳离子牛血清白蛋白(cBSA)，血蓝蛋白(KLH)，卵清蛋白(OVA)，血清白蛋白HSA，牛γ球蛋白和人γ球蛋白。
8.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒满足以下一项或多项：磁性微球的工作浓度为1-10mg/mL；
所述经修饰的CCP抗原的工作浓度为50-100ng/mL；所述蛋白载体的工作浓度为10-40ng/mL；
所述鼠抗人IgG二抗的工作浓度为100-300ng/mL；所述发光标记物的工作浓度为10-30ng/mL。9.一种抗CCP抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括：
1).使权利要求1-3任一项所述的经修饰的CCP抗原与蛋白载体偶联；2).使步骤1)获得的偶联物包被磁性微球，得到组分A；3).使鼠抗人IgG二抗和发光标记物反应，得到组分B；4).将组分A和组分B组装成试剂盒。10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述经修饰的CCP抗原与蛋白载体的摩尔比为20∶1-80∶1；和/或所述磁性微球与偶联物的重量比为1mg∶10μg-1mg∶40μg。11.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)包括使所述CCP抗原与交联
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剂在催化剂存在下进行反应，随后加入所述蛋白载体。
12.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述交联剂选自：戊二醛、BS(PEG)5、BS(PEG)8、PEG400、PEG800和丁二酸酐；和/或所述催化剂选自：三乙胺、吡啶、氢氧化钾和碳酸钾。
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说 明 书
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经修饰的CCP抗原及其用途和抗CCP抗体检测试剂盒及其制造
方法
技术领域[0001]本发明属于体外诊断技术领域，具体涉及一种经修饰的CCP抗原，该抗原用于检测抗CCP抗体的用途，包括该抗原的抗CCP抗体检测试剂盒及其制造方法。背景技术[0002]类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一种累及周围关节为主的多系统、炎症性、自身免疫性、致畸性疾病。该病在欧美国家的发病率为1％，我国为0.32％～0.36％。该病在起病2年内即可出现不可逆的骨关节破坏，是造成人群劳动力丧失的主要原因之一。[0003]郭大文等研究发现抗环瓜氨酸肽抗体对类风湿性关节炎的发病具有预测价值(郭大文，王晔，高红华，等.抗环瓜氨酸肽抗体对类风湿性关节炎发病的预测价值[J].中国实验诊断学，2005，9(1)：13-14)。[0004]抗环瓜氨酸肽(Cyclic Citrullinated Peptide，CCP)抗体是以IgG型为主的抗体。抗CCP抗体是由RA患者的B淋巴细胞自发分泌的，而其他疾病患者和正常人群B淋巴细胞并不自发分泌抗CCP抗体。因此，抗CCP抗体对RA具有较高的特异性。抗CCP抗体的检测现多采用固相合成法来人工合成含瓜氨酸的肽段。最初使用含19个氨基酸的直链线性瓜氨酸肽段，其氨基酸序列为：SHQESTXGRSRGRSGRSGS。然而研究发现用直链线性瓜氨酸肽段为底物，用ELISA法来检测抗环瓜氨酸肽抗体常会导致失败，原因是由于此肽段不能吸附于聚苯乙烯上。后来，为了提高瓜氨酸肽链的抗原活性，克服直链线性瓜氨酸肽段的不足，荷兰学者Schellekens GA(Schellekens GA，Visser H，de Jong BA，van den Hoogen FH，Hazes JM，Breedveld FC et al.The diagnostic properties of rheumatoid arthritis antibodies recognizing a cyclic citrullinated peptide.Arthritis Rheum 2000；43：155-163)将上述由19个氨基酸残基组成的一条瓜氨酸肽链中的两个丝氨酸替换成半胱氨酸，并使半胱氨酸环化形成β-转角结构相似的二硫键，而成为环瓜氨酸肽。[0005]Anti-CCP抗体的检测对RA的诊断具有高度的特异性(特异性在90％以上)，并可用于RA的早期诊断。大约70％的RA患者在发病早期，血清中即可出现Anti-CCP抗体，而且抗体阳性的患者比抗体阴性的患者易发展成为可通过放射性方法检测到的骨关节损害。Tiercy JM(Rheumatology，2002，41(7)：809)研究Anti-CCP抗体、AKA和IgM-RF在区别RA与其他风湿性疾病中的意义时发现：IgM-RF对RA诊断的敏感性高(75％)，其次是Anti-CCP抗体(68％)；而Anti-CCP抗体对RA诊断的特异性最高(96％)，其次为AKA(94％)；而IgM-RF对RA诊断的特异性仅74％。所以，在诊断RA时，Anti-CCP抗体比IgM-RF具有更高的特异性。[0006]目前的Anti-CCP诊断技术主要包括酶联免疫试验(ELISA)、化学发光(CLIA)、免疫层析法(胶体金或乳胶颗粒法)、时间分辨免疫荧光分析法(TRFIA)、免疫斑点试验，这些方法都有各自的优势和缺点。[0007]目前，抗CCP抗体的检测主要研究及应用化学发光免疫分析法。CLIA在检测抗CCP
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抗体中，检测灵敏度高，特异性及重复性较好，检测范围宽，试剂稳定无毒害无污染，操作简单，检测过程耗时短，而且易于实现自动化以及单个样本的检测，是目前主流的抗CCP抗体的检测方法。[0008]现有的化学发光免疫分析法检测抗CCP抗体的方案中，一般使用CCP抗原与蛋白载体连接形成的衍生物包被固相载体，并使用发光标记物标记抗人IgG二抗。在检测血清样本时，一方面Anti-CCP抗体通过CCP抗原与固相载体结合，另一方面Anti-CCP抗体与抗人IgG二抗结合，最后使用固相载体分离技术，达到准确检测血清样本中Anti-CCP抗体的目的。[0009]CCP抗原是小分子环状多肽，其序列为：HQCHQEST-cit-GRSRGRCGRSGS(用三字符可表示为NH2-His-Gln-Cys-His-Gln-Glu-Ser-Thr-Cit-Gly-Arg-Ser-Arg-Gly-Arg-Cys-Gly-Arg-Ser-Gly-Ser-COOH)，二硫键：C3＝C16。瓜氨酸(Citrulline，Cit)是其中重要的免疫原性位点。CCP抗原通过羧基与蛋白载体偶联。[0010]现有技术仍对CCP抗原连接蛋白载体后的衍生物的抗原活性存在更高要求，且对抗CCP抗体检测的精密度和准确度存在更高要求。
发明内容[0011]为了克服现有技术中存在的一个或多个技术问题，发明人进行了持续研究。通过不断实验，意外发现一种经修饰的CCP抗原可以实现本发明的技术目的。[0012]所述CCP抗原具有下式I所示的序列：
[0013]
其中式I中的谷氨酸E(即第六个氨基酸)的羧羟基(-OH)被R基团取代，得到-COR基团，所述R基团选自以下一种或多种：C1-10烷基氧基，C1-10烷基-CO-NH-基和C1-10烷基-CO-NH-NH-基；所述C1-10烷基表示含有1-10个碳原子的烷基，比如甲基、乙基、异丙基、叔丁基、新戊基、正壬基等；所述氧基表示-O-；所述-CO-表示酮基；[0015]所述C1-10烷基任选被一个或多个常规取代基取代。所述取代基可选自C1-4烷基(比如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基)，C1-4烷基氧基(即C1-4烷基氧基)，羟基(HO-)，氨基(NH2-)，硝基(NO2-)和苯基(C6H5-)。[0016]优选地，所述R基团选自以下一种或多种：C1-5烷基氧基，C1-5烷基-CO-NH-基和C1-5烷基-CO-NH-NH-基。[0017]优选地，所述R基团选自以下一种或多种：甲基氧基，乙基氧基，叔丁基氧基，苯甲基氧基，二苯甲基氧基((C6H5)2CHO-)，乙酰胺基(CH3CHO-NH-)和乙酰肼基(CH3CHO-NH-NH-)。[0018]在另一个实施方案中，本发明涉及上述经修饰的CCP抗原用于制备抗CCP抗体检测试剂的用途。[0019]在另一个实施方案中，本发明涉及包括上述经修饰的CCP抗原的抗CCP抗体检测试剂。[0020]在另一个实施方案中，本发明涉及包括上述经修饰的CCP抗原的药物。
[0014]
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说 明 书
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在另一个实施方案中，本发明涉及一种抗CCP抗体检测试剂盒，所述试剂盒包括组
分A和组分B，其中所述组分A包括磁性微球，所述磁性微球被与蛋白载体偶联的上述经修饰的CCP抗原包被，所述组分B包括被鼠抗人IgG二抗标记的发光标记物溶液。[0022]优选地，所述蛋白载体选自：牛血清白蛋白(BSA)，阳离子牛血清白蛋白(cBSA)，血蓝蛋白(KLH)，卵清蛋白(OVA)，血清白蛋白HSA，牛γ球蛋白和人γ球蛋白等动物源性或人源性蛋白。[0023]优选地，所述磁性微球，即磁球，可为市售可得的任意一种磁球，包括但不限于：表面带有环氧基、磺酰基、醛基、酰胺基、氨基、羧基、巯基、羟基修饰的磁球。[0024]优选地，所述发光标记物选自：鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物，辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)和碱性磷酸酶等。[0025]优选地，所述磁性微球的工作浓度为1-10mg/mL(比如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg/mL)，和/或所述经修饰的CCP抗原的工作浓度为50-100ng/mL(比如50、55、60、65、70、75、80、85、90、96或100ng/mL)，和/或所述蛋白载体的工作浓度为10-40ng/mL(比如10、15、20、25、30、35或40ng/mL)，和/或所述鼠抗人IgG二抗的工作浓度为100-300ng/mL(比如100、150、200、250或300ng/mL)和/或所述发光标记物的工作浓度为10-30ng/mL(比如10、15、20、25或30ng/mL)。[0026]优选地，所述试剂盒还包括低浓度校准品溶液(比如2、3、4、5或6U/mL，具体如3.91U/mL)和高浓度校准品溶液(比如50、100、150、200、250、300、350、400、450或500U/mL)。[0027]优选地，所述试剂盒中的各个组分A和B均含有BSA和防腐剂，BSA质量体积百分浓度为0.1％-0.5％，防腐剂为山梨酸钾、苯甲酸钠、叠氮钠、亚硝酸钠、Proclin系列中的任一种或它们的混合物。[0028]在另一个实施方案中，本发明涉及一种抗CCP抗体检测试剂盒的制造方法，所述方法包括：[0029]1).使上述经修饰的CCP抗原与蛋白载体偶联，优选地，所述经修饰的CCP抗原与蛋白载体的摩尔比为20∶1-80∶1，比如30∶1、40∶1、50∶1、60∶1或70∶1；[0030]2).使步骤1)获得的偶联物包被磁性微球，得到组分A，所述磁性微球与偶联物的重量比为1mg∶10μg-1mg∶40μg，比如每1mg磁性微球使用15、20、25、30或35μg偶联物；[0031]3).使鼠抗人IgG二抗和发光标记物反应，得到组分B；[0032]4).将组分A和组分B组装成试剂盒。[0033]优选地，所述制造方法还包括制造上述低浓度校准品溶液和高浓度校准品溶液，并将它们置于试剂盒之中或搭配使用。[0034]具体来说，本发明的一个实施方案涉及一种用于检测抗CCP抗体的检测试剂盒的制备方法，其核心制备步骤如下：[0035]制备1：将本发明的经修饰的CCP抗原(以下简称新型CCP抗原)与蛋白载体形成偶联物[0036]1)将新型CCP抗原与交联剂在催化剂存在下进行反应，得到新型CCP抗原反应液；[0037]其中，所述交联剂包括但不限于戊二醛、BS(PEG)5、BS(PEG)8、PEG400、PEG800、丁二酸酐等，其用量为1eq至4eq；[0038]所述催化剂包括但不限于三乙胺、吡啶、氢氧化钾、碳酸钾，其用量为1eq至4eq；
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2)向步骤1)的新型CCP抗原反应液中加入蛋白载体进行反应，经纯化，得到新型
CCP抗原与蛋白载体形成的偶联物；[0040]其中，新型CCP抗原与蛋白载体的摩尔比为20∶1-80∶1。[0041]制备2：新型CCP抗原偶联物包被的磁球悬浮液的制备[0042]采用制备1获得的偶联物包被磁性微球(深圳市新产业生物医学工程股份有限公司生产，80％粒径分布为1-5μm，磁化强度为4000)，磁球浓度为100mg/mL，羟基数为95。具体步骤如下：[0043]1)将磁球置于醋酸缓冲液溶液中超声搅拌清洗，通过磁分离除去上层清液，重复三次此步骤，得到醋酸缓冲液悬浮磁球；[0044]2)采用磁球连接CDC法(磁球-CDC-抗原/抗体)，向醋酸缓冲液悬浮磁球中加入CDC和新型CCP抗原-蛋白载体偶联物，置于恒温震荡水浴箱中反应，得到新型CCP抗原偶联物包被的磁球反应液；[0045]其中磁球与新型CCP抗原-蛋白载体偶联物的比例为1mg∶10μg至1mg∶40μg；[0046]3)将步骤2)得到的反应液通过磁分离除去上层清液，并加入磁球清洗液搅拌清洗，重复此步骤清洗四次；[0047]其中磁球清洗液为：0.1M，pH7.4的PBS缓冲液加入0.5％(w/v)的BSA(Roche生产)，混匀；[0048]4)清洗完毕后，加入磁球悬浮液进行悬浮，得到新型CCP抗原偶联物包被的磁球悬浮液；[0049]其中磁球悬浮液为0.1M，pH7.4的PBS缓冲液。[0050]制备3：鼠抗人IgG二抗标记的发光标记物的制备[0051]1)将鼠抗人IgG二抗碳酸缓冲液装入合适截留量的透析袋中置于透析液中进行透析，其中，所述透析液为碳酸缓冲液；[0052]2)往步骤1)透析好的溶液中加入发光标记物进行反应；其中，反应的温度为25-37℃，反应时间为8-12h；[0053]所述发光标记物可选自：鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺及其衍生物、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等；[0054]3)将步骤2)得到的反应液通过G-25凝胶柱进行纯化，收集出现峰值的溶液，得到鼠抗人IgG二抗标记的发光标记物溶液；[0055]4)将步骤3)得到的鼠抗人IgG二抗标记的发光标记物溶液加入BSA保护液，待用。[0056]本发明的一个实施方案涉及一种用于检测抗CCP抗体的化学发光免疫学方法，其包括以下步骤：[0057]1)将待测样本溶液、高浓度校准品溶液和低浓度校准品溶液分别加入到不同反应杯孔中；[0058]2)分别向步骤1-)中加入本发明制备的新型CCP抗原包被的专用磁性微球，使与待测物质结合；[0059]3)分别向步骤2)中加入鼠抗人IgG二抗标记的发光标记物进行温育，使所述鼠抗人IgG二抗与新型CCP抗原包被的磁性微球和待测物质结合；[0060]其中，温育温度为25-37℃，温育时间为10-20min；
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所述发光标记物可选自：鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺及其衍生物、辣根过氧化物
酶、碱性磷酸酶等；[0062]4)磁分离，得到鼠抗人IgG二抗与新型CCP抗原包被的磁性微球和待测物质的结合物；[0063]5)向步骤4)得到的结合物加入发光激发底物，检测光信号强度；[0064]当发光标记物为异鲁米诺时，发光激发底物可为NaOH和H2O2；当发光标记物采用其它物质时，发光激发底物可相应变化为其它常用物质；[0065]6)通过校准品修正后的工作曲线，根据样本检测光强度自动计算，得出待测样本的抗CCP抗体浓度。[0066]本发明还涉及通过上述制造方法制造的试剂盒，试剂盒的使用方法，使用本发明试剂盒的检测方法，使用本发明经修饰的CCP抗原检测抗CCP抗体的方法以及实施这一方法的设备和仪器。[0067]和现有技术相比，本发明的优点包括：[0068]本发明经修饰的CCP抗原连接蛋白载体后的衍生物的抗原活性更高；抗CCP抗体检测的精密度更高；抗CCP抗体检测的准确度更高。具体实施方式[0069]下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。本发明的范围不受限于此。[0070]实施例涉及以下术语，[0071]标记物：本发明中使用的术语“标记物”指在免疫检测中可被检测到的物质。所述标记物可选自任何纳米颗粒类标记物，也可指包含该标记物的“标记复合物”。[0072]标记抗原：本发明中使用的术语“标记抗原”为免疫检测中与待测目的抗体结合的抗原，也可叫标记蛋白。[0073]配体：本发明中使用的术语“配体”为可以与标签特异性识别的分子，例如抗体，亲和素等。[0074]标签：本发明中使用的术语“标签”包括但不限于多肽或蛋白、生物素或者为它们与肽或蛋白的组合物，这里所说的多肽或蛋白为除该试剂盒包被抗原里任意一段之外的多肽或蛋白。[0075]烷氧基化：在有机化合物分子中引入烷氧基的反应。[0076]以下实施例采用深圳市新产业生物医学工程股份有限公司生产的Maglumi 2000plus化学发光免疫分析仪进行检测。[0077]涉及的原材料来源如下：[0078]新型CCP抗原来源：深圳市新产业生物医学工程股份有限公司提供；该新型CCP抗原在传统CCP抗原(HQCHQEST-cit-GRSRGRCGRSGS)的基础上将谷氨酸E的羧羟基取代为R基团；[0079]ABEI(N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺)来源：深圳市新产业生物医学工程股份有限公司提供；[0080]鼠抗人IgG二抗来源：Sigma公司；[0081]磁性微球：深圳市新产业生物医学工程股份有限公司生产，80％粒径分布为1-5μ
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m，磁化强度为4000高斯时沉淀时间为10-15秒，BSA为30mg时蛋白吸附浓度为0.8mg-1.2mg。[0082]制备1：新型CCP抗原与蛋白载体形成衍生物的制备[0083]将23.4mg新型CCP多肽抗原溶于二甲亚砜配制成100mg/mL反应液，加入21.3mg交联剂BS(PEG)5(4eq，thermo)，5.6μL催化剂三乙胺(4eq)，25℃，250rpm，反应2.5h。[0084]按新型CCP抗原与牛IgG摩尔比20∶1的比例，取40μL反应液加入到1mL牛IgG溶液(10mg/mL，0.1M NaHCO3)中，室温，250rpm，反应2.5h。G25凝胶纯化，缓冲液为0.01M pH 7.4的PBS。[0085]制备2：新型CCP抗原衍生物包被的磁球悬浮液的制备[0086]采用制备1获得的新型CCP抗原衍生物包被磁性微球(深圳市新产业生物医学工程股份有限公司生产，80％粒径分布为1-5μm，磁化强度为4000)，浓度为100mg/mL，羟基数为95的纳米磁性微球。具体步骤如下：[0087]磁球的处理过程：[0088]1)0.05mol/L pH 3.6醋酸缓冲液的配置：[0089]称取2.55g三水合乙酸钠用4500mL纯化水溶解后再加入14mL乙酸混匀后，定容至5000mL，获得0.05mol/L pH 3.6的醋酸缓冲液。[0090]2)磁球连接CDC法(磁球-CDC-抗原/抗体)[0091]向小白瓶中加入5倍于包被体积的0.05mol/L且pH为3.6的醋酸缓冲液溶液，放入超声波仪器中一边超声一边搅拌清洗2-3分钟，然后置于磁铁上，待上清液清亮后，倒出上清液。该步骤重复三次。[0092]3)抗原/抗体加样与反应[0093]加入包被体积等量的pH3.6醋酸缓冲液悬浮磁球浓度20mg/mL，再加入浓度为10mg/mL的CDC，按1mg∶12μg的比例加入纯化的新型CCP抗原-牛IgG衍生物，放入恒温震荡水浴箱中37℃反应24小时[0094]4)磁球的清洗：[0095]①磁球清洗液的配置[0096]0.1M，pH7.4的PBS缓冲液中加入0.5％(w/v)的BSA(Roche生产)，混匀，待用。[0097]②将温浴好的磁球倒入烧杯中，然后置于磁铁上沉淀后，倒掉上清液，加入5倍体积的磁球清洗液搅拌清洗，然后放置在磁铁上，待上清液清亮后倒掉上清液，重复该清洗步骤四次。[0098]5)磁球的悬浮：[0099]清洗完毕后，加入包被体积的磁球悬浮液，悬浮浓度为20mg/mL。[0100]制备3：鼠抗人IgG二抗标记的ABEI的制备[0101]1)透析液(F溶液)的配置：[0102]在5000mL烧杯中加入Na2CO3 14.31g，NaHCO3 26.46g，加水定容至4500mL。配制好的F溶液置于磁力搅拌器上备用。[0103]2)选用合适截留量(常用14000)的透析袋，量取合适的尺寸，润湿后扎紧一端，纯化水试漏3次(需无漏液)。[0104]3)取1mg鼠抗人IgG二抗用0.1mol/L pH9.5的碳酸缓冲液(F溶液)调整到1mL。扎紧另一端放入透析液中，透析2小时(搅拌速度400)。
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4)透析好的溶液装入小白瓶中(每瓶1mL)，加入300μg ABEI活化酯，37℃反应2小5)安装好G-25凝胶柱，用纯化水洗脱干净后，再用pH值7.4的PBS缓冲液进行平衡
时。
[0106]
洗脱。
6)凝胶柱平衡洗脱完毕后，将标记好的ABEI过柱纯化，然后收集出现峰值的溶液。
[0108]7)将收集好的蛋白溶液，加入等体积的含50mg/mL的BSA保护液。[0109]实施例1：[0110]本实施例采用的新型CCP抗原的多肽序列为：HQCHQE(R)ST-cit-GRSRGRCGRSGS，二硫键：C3＝C16，其中R基为甲氧基CH3O-。[0111]试剂盒包括以下组分：[0112]1)组分A：包被磁球的新型CCP抗原衍生物溶液，新型CCP抗原衍生物由新型CCP抗原与牛IgG蛋白载体偶联而成，其中：磁球的工作浓度：1mg/mL，新型CCP抗原的工作浓度为50ng/mL，牛IgG蛋白载体的浓度为10ng/mL；[0113]2)组分B：鼠抗人IgG二抗标记的ABEI溶液，其中，ABEI的工作浓度为30ng/mL，鼠抗人IgG二抗的工作浓度为300ng/mL。[0114]3)校准品溶液：浓度3.91U/mL的低浓度校准品溶液和浓度250.0U/mL的高浓度校准品溶液。[0115]上述各组分均含有BSA和防腐剂，BSA质量体积百分浓度为0.1％，防腐剂主要成分为叠氮钠(NaN3)，质量体积百分浓度为0.2％。[0116]本实施例的试剂盒各组分的制备方法为：[0117]按照上述制备1制备新型CCP抗原与牛IgG蛋白载体形成的新型CCP抗原-牛IgG衍生物；[0118]按照上述制备2制备得到包被有新型CCP抗原-牛IgG偶联物的磁球悬浮液；[0119]按照上述制备3制备得到鼠抗人IgG二抗标记的ABEI溶液。[0120]采用抗CCP抗体标准品，以牛血清为溶剂，配制10份不同浓度的标准品溶液，使用本实施例制备的试剂盒组分对该10份溶液进行检测，检测步骤如下：[0121]a)将10μL待测样本溶液、高浓度校准品溶液和低浓度校准品溶液分别加入到不同反应杯孔中；[0122]b)分别加入20μL的新型CCP抗原包被的专用磁性微球；[0123]c)分别加入100μL的鼠抗人IgG二抗标记的ABEI；[0124]d)37℃温浴15min，置于磁环境下清洗3次；[0125]e)加入200μL系统洗液；[0126]f)分别加入发光底物1(NaOH)和发光底物2(H2O2)，检测光信号强度；[0127]g)通过校准品修正后的工作曲线，根据样本检测光强度自动计算，由工作曲线得出待测样本的抗CCP抗体浓度。[0128]实施例2：[0129]本实施例采用的新型CCP抗原的R基为戊氧基CH3(CH2)4O-，其余和实施例1相同。[0130]实施例3：[0131]本实施例采用的新型CCP抗原的R基为乙酰胺基(CH3CHO-NH-)，其余和实施例1相
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[0107]
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同。
[0132][0133]
实施例4：
本实施例采用的新型CCP抗原的R基为乙酰肼基(CH3CHO-NH-NH-)，其余和实施例1
相同。
对比例：
[0135]本对比例采用传统CCP抗原(HQCHQEST-cit-GRSRGRCGRSGS)，即R基为羟基，其余和实施例1相同。[0136]性能评估[0137]对实施例1，2和对比例的试剂盒的性能进行如下评估：[0138]1空白限[0139]使用实施例与对比例中制备的抗CCP抗体测定试剂盒重复测定零浓度校准品20次，记录20次测试的相对发光强度(RLU)。[0140]1.1数据处理[0141]计算20次测定RLU的平均值(M)和标准差(SD)，得出M+2SD，将M+2SD的值代入试剂盒工作曲线(可直接使用仪器配套用户软件计算RLU值为M+2SD时对应的浓度)，对应的浓度值即空白限。[0142]2精密度[0143]2.1批内精密度[0144]使用零值血清制备的低、中、高3个浓度样本(尽可能选择接近医学决定水平浓度)和试剂盒质控品作为测定样本，使用实施例与对比例中制备的抗CCP抗体测定试剂盒重复测定每个样本20次，记录每个样本20次测定结果。[0145]2.2批间精密度[0146]使用零值血清制备的低、中、高3个浓度样本(尽可能选择接近医学决定水平浓度)和试剂盒质控品作为测定样本，使用三批试剂分别连续重复测定每个样本各20次，记录每个样本60次测定结果。[0147]2.3数据处理[0148]分别计算批内和批间测定结果的平均值(M)和标准差(SD)，根据公式(1)计算CV值。[0149]CV＝SD/M×100％.....................................(1)[0150]3准确度[0151]3.1试验接收准则[0152]相对偏差应在±10％范围内。[0153]3.2试验方法[0154]配制浓度约为100U/mL(允许偏差为±10％)的环瓜氨酸肽企业标准品，将其作为样本，重复测定3次后，记录其结果均值，根据公式(2)计算其测定偏差。[0155]3.3数据处理[0156]根据公式(2)计算偏差：[0157]测量偏差＝(测定平均值-理论值)/理论值×100％..................(2)[0158]试剂盒的空白限的评估，检测结果如表1所示；
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[0134]
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试剂盒的批内精密度的评估，结果如表2、3、4、5所示；试剂盒的批间精密度的评估，结果如表6所示；试剂盒的测量准确度的评估，结果如表7所示。表1：空白限
[0164]
结论：通过实施例1，实施例2，实施例3、实施例4与对比例的空白限检测结果来看，
实施例1，实施例2，实施例3和实施例4中使用了新型CCP抗原后，相对于对比例的空白限RLU
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[0165]
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值降低了40％，显著提升抗体CCP抗体检测试剂盒的空白限性能。[0166]表2：批内差(实施例1vs.对比例)
[0167]
[0168]
[0169]
表3：批内差(实施例2vs.对比例)
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[0172]
表4：批内差(实施例3vs.对比例)
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[0174]
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表5：批内差(实施例4vs.对比例)
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结论：通过实施例1、实施例2、实施例3、实施例4与对比例的批内差检测结果来看，
实施例中使用了新型CCP抗原后，低值样本，中值样本，高值样本的CV值均小于对比例，所以新型CCP抗原可以显著提升抗CCP抗体检测试剂盒的批内精密度。[0178]表6-1：批间差(实施例1)
[0177]
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[0180]
[0181]
表6-2：批间差(实施例2)
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[0183]
表6-3：批间差(实施例3)
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[0185][0186]
表6-4：批间差(实施例4)
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表6-5：批间差(对比例)
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结论：通过实施例1、实施例2、实施例3、实施例4与对比例的批间差检测结果来看，
实施例中使用了新型CCP抗原后，三个批号(Lot1、Lot2、Lot3)检测低值样本，中值样本，高值样本的CV值均小于对比例，所以新型CCP抗原可以显著提升抗CCP抗体检测试剂盒的批间精密度。[0192]表7：准确度
[0193]
[0191]
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结论：通过实施例1、实施例2、实施例3、实施例4与对比例的准确度检测结果来看，
实施例中使用了新型CCP抗原后，其检测偏差的值分别为0.12％，0.73％，0.38％和4.44％，均小于对比例的8.41％，这说明实施例的准确度要优于对比例的准确度，因此本发明的新型CCP抗原可以提升抗CCP抗体检测试剂盒的准确度。[0196]发明人通过上述实施例发现，本发明的新型CCP抗原可以意外提高抗CCP抗体检测试剂盒的空白限性能，精密度和准确度。[0197]在并不受原理限制的前提下，发明人尝试对本发明的原理作出如下解释：本发明的新型抗CCP抗原通过使用修饰过的谷氨酸代替传统CCP抗原中的天然谷氨酸，使合成的新型CCP抗原中的谷氨酸不再含有羧基。这种新型CCP抗原在连接蛋白载体时，很好地通过C端的羧基进行偶联，避免了蛋白载体连接到谷氨酸的羧基后对CCP抗原活性的影响，因此获得了更好的技术效果，实现了本发明期望的技术目的。[0198]在传统的未经修饰的CCP抗原中，谷氨酸所含的羧基距离免疫活性关键位点瓜氨酸很近，两者只相隔2个氨基酸。当载体蛋白通过谷氨酸的羧基连接时，势必导致CCP抗原中的瓜氨酸过于靠近蛋白载体，从而受到空间位阻效应的影响，降低CCP抗原连接蛋白载体后的衍生物的抗原活性，进而降低检测抗CCP抗体的精密度和准确度。[0199]另一方面，本发明使用所述新型CCP抗原与蛋白载体形成的衍生物包被磁球，以对小分子抗原进行衍生放大，提高后续检测抗Anti-CCP抗体的精密度和准确度。这也有助于本发明技术目的的实现。[0200]以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
[0195]
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