基质金属蛋白酶抑制剂的筛选及抗肿瘤转移的研究

基质金属蛋白酶抑制剂的筛选及抗肿瘤转移的研究

姓名：丁丽申请学位级别：硕士专业：内科学（血液肿瘤）指导教师：姜藻;陈宝安

20030522

基质金属蛋白酶抑制剂的筛选及抗肿瘤转移的研究研究ｍ：丁丽导师：姜藻副教授东南大学医学院中文摘要侵袭、转移足恶性肿瘤最重要的特征之一，电是临床肿瘤病人的主要死因之一。抑，基质金属蛋白酶（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，ＭＭＰｓ），尤其由于认识到ＭＭＰｓ在肿瘤侵袭转移中的重要作用，ＭＭＰｓ（特别是ＭＭＰ一２）抑制剂的筛选和玎发受到广泛的重视。目前人工合成的ＭＭＰｓ抑制剂用在人体因存在吸收、降解、毒性等问题并不理想，故此方面工作仍在探索中。本草抗肿瘤侵袭转移研究的报道甚少。由于蛇毒中含丰富的ＭＭＰｓ，我们没想从抗臼的：本研究即将几种常用抗毒蛇咬伤的本草的粗提成分，制备成药物血清，观察其对体外培养的高转移胰腺癌Ｐａｎｃ一１细胞株ＭＭＰｓ的产生和表达的抑制能力，初步筛方法：小实验用抗蛇毒中药的两种复方的粗提本草成分Ｂ１１０、Ｇ２１０分别给大鼠灌胃，制备药物血清，用５％、１０％、２０％的药物血清对培养的高转移胰腺癌Ｐａｎｃ一１细胞ｍＲＮＡ表达的影响。结果：（１）明胶酶谱法结果表明，Ｂ１１０和Ｇ２１０药物血清在１０％、２０％的浓度町抑％、２０％的Ｂ１１０和Ｇ２１０药物血清对Ｐａｎｃ一１细胞ＭＭＰ．２分泌的抑制率分别为２０．０７％、３７５９％和２８，８２％、５４９７％。（２）ＭＴ丁法结果表明，２０％的Ｂ１１０和Ｇ２１０药物血清可抑制Ｐａｎｃ一１细胞的增殖，ｌＩ同浓度的空白血清相比有显著性差异（Ｐ＜０．０５）。Ｂ１１０抑制率为２０３８％；Ｇ２１０抑制６７％。（３）ＲＴ—ＰＣＲ法结果表明，５％的Ｇ２１０和１０％、２０％的Ｂ１１０和Ｇ２１０药物血清均ｍＲＮＡ的表达，与同浓度字白血清相比均具有显著性差异（Ｐ＜００５），并呈一定的浓度依赖性。１０、２０％Ｂ１１０的抑制率分别为５１．１６％和５６．７８０／；结论：ｔ十，草药Ｂ１１０、Ｇ２１０制备的药物血清可抑制胰腺癌Ｐａｎｃ一１细胞ＭＭＰ一２的产关键词：基质金属蛋白酶，肿瘤，药物血清，侵袭，转移制肿瘤侵袭转移为当今国际研究热点。细胞外基质（包括基底膜）的降解是肿瘤侵袭转移中的关键步骤之是以Ⅳ型胶原为底物的明胶酶（ＭＭＰ一２、９），在此过程中发挥着重要作用。毒蛇皎伤的本草中筛选天然的具有抗肿瘤侵袭转移作用ＭＭＰｓ抑ｆ，＊ｊｊｆ０，为肿瘤转移的药物治疗开辟一条新途径。选出具有抑制ＭＭＰｓ能力的本革组分。株干预２４小时。（１）采用明胶酶谱法检测药物血清对Ｐａｎｃ一１细胞ＭＭＰ一２分泌的影响；（２）采用Ｍ１”１１法检测药物血清对Ｐａｎｃ一１细胞增殖的抑制作用；（３）采用ＲＴ—ＰＣＲ法检测药物』ｆ【Ｌ清对Ｐａｎｃ．１细胞ＭＭＰ．２制Ｐａｎｃ一１细胞ＭＭＰ一２的分泌，与同浓度空白血清相比具有显著性差异（Ｐ＜０．０５）。１０率为２９可抑制Ｐａｎｃ一１细胞ＭＭＰ一２５％、１０％、２０％Ｇ２１０的抑制率分别为２７．８５％、７４．７９％和８１．５２％。化和表达，且陔作用在一定范闻内具有浓度依赖性，提示其具有抗肿瘤侵袭转移的潜能。ＴｈｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｆｍｅｔａＵｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓａｎｄｔｈｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｉｒｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｉｎｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇＢａｃｋｇｒｏｕｎｄ：ｔｕｍｏｒｍｅｔａｓｔａｓｉｓＢａｓｅｍｅｎｔｍｅｍｂｒａｎｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｉＳａｃｒｉｔｉｃａｌｃｏｍｐｏｎｅｎｔｏｆｔｕｍｏｒｉｎｖａｓｉｏｎａｎｄｍｅｔａｓｔａｓｉｓｔｈａｔｉｓｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄｂｙｔｈｅｆａｍｉｌｙｏｆｅｎｚｙｍｅｓｋｎｏｗｎａｓｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓａｓ（ＭＭＰｓｌ．ＳｎａｋｅｖｅｎｏｍｓａｒｅａｂｕｎｄａｎｔａｎｄｓｔａｂｌｅｓｏｕｒｃｅｓｏｆＭＭＰｓ．ＳｏｗｅｈｙｐｏｔｈｅｓｉｚｅｔｏｓｃｒｅｅｎＭＭＰｉｒｔｈｉｂｉｔｏｒｓｆｒｏｍｍｅｄｉｃｉｎａｌｈｅｒｂｓｗｈｉｃｈｈａｖｅａｎｔｉ—ｖｅｎｏｍｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴＯｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｏｆＢ１１０ａｎｄＧ２１０．ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｍｅｄｉｃｉｎａｌｈｅｒｂｓｔｈａｔｈａｖｅａｎｔｉ—ｖｅｎｏｍｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，ｏｎｍｅｔａｓｔａｓｉｓ。ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｏｆＰａｎｃ一１ｃｅｌｌｓｆｒｏｍａｈｕｍａｎｐｏｏｒｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒａｔｅｄｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｎｃｅｒｃｅｉｌｌｉｎｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｂ１１０Ｇ２１０ｗａｓｇｉｖｅｎｔｏＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙｒａｔｓｉｎｔｒａｇａｓｔｒｉｃａｌｌｙ（Ｉｇ．）ｔｈｒｅｅｔｉｍｅｓｐｅｒ４ｈａｎｄｗｅｃｏｌｌｅｃｔｔｈｅｉｒｓｅｒｕｍｓ２ｈａｆｔｅｒｔｈｅｌａｓｔｄｒｕｇａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｏｒＰａｎｃ。１ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｉｎｃｕｂａｔｅｄｉｎｖｉｔｒｏｗｉｔｈｏｒｗｉｔｈｏｕｔｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｄｏｓｅｓｏｆＢｌｌ０ｏｒＧ２１０ｔｈｅｓｅｒｕｍ（５％，１０％，２０％）ｆｏｒ２４ｈ．ＧｅｌａｔｉｎＺｙｍｏｇｒａｐｈｙｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｓｅｃｒｅｔｉｏｎｏｆＭＭＰ一２ｏｆＰａｎｃ．１ｃｅｌｌｓ．ＭＴＴａｒｒａｙｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅＲＴ—ＰＣＲｇｒｏｗｔｈｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｂｙＢ１１０ｏｒＧ２１０ｓｅｒｕｍｉｎｃｕｌｔｕｒｅｄＰａｎｃ一１ｃｅｌｌｓ．ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｗａｓｕｓｅｄｔｏｍｅａｓｕｒｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＭＭＰ一２ＦｎＲＮＡｏｆＰａｎｃ一１ｃｅｌｌｓＲｅｓｕｌｔｓ：Ａｆｔｅｒ２４ｈｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｔｈｅＢ１１０ａｎｄＧ２１０ｓｅｒｕｍｓｒｅｄｕｃｅｄｔｈｅｓｅｃｒｅｔｉｏｎｏｆＰａｎｃ一１ｃｅｌｌｓｉｎａＭＭＰ一２ｏｆｄｏｓｅ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｍａｎｎｅｒＢ１１０ａｎｄＧ２１０ｓｅｒｕｍｓｆ２０％１ＡｎｄＢ１１０ａｎｄＧ２１０ｓｅｒｕｍａＩｓｏｉｎａｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｃｕｌｔｕｒｅｄＰａｎｃ一１ｃｅｌｌｓｆｉｒｕｈｉｂｉｔｅｄｂｙ２００８％ａｎｄ２９．６７％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，Ｐ＜０．０５１ｗｈｅｎｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｃｏｎｔｒ０１．ｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎＭＭＰ一２ｎｌＲＮＡｏｆＰａｎｃ．１ｃｅｌｌｓｄｏｓｅ．ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｍａｎｎｅｒＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＴｈｅｓｅｒｅｓｕｌｔｓｓｕｇｇｅｓｔｔｈａｔＢｌｌ０ａｎｄＧ２１０，ｗｈｉｃｈｒｅｄｕｃｅｔｈｅｓｅｃｒｅｔｉｏｎａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＭＭＰ一２ｏｆＰａｎｃ一１ｃｅｌｌｓｉｎｕｓｅｆｕｌｉｎｃａｎｃｅｒａｄｏｓｅ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，ｍｉｇｈｔｂｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ、ｔｈｅｒａｐｙ．‘。Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＭａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓｊＣａｎｃｅｒ；Ｉｎｖａｓｉｏｎ；Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ；Ｄｒｕｇ—ｓｅｒｕｍ东南大学学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的既明并表示了谢意。１一叶＿一研究生签名：．』竺曰期：２００３—０６－０６东南大学学位论文使用授权声明东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，呵以公布（包括刊登）论文的全部或部分内容。论文的公布（包括刊登）授权东南大学研究生院办理。研究生签名：＿二ｌ导师签名：运ｎ日期：２００３—０６一０６Ａ（ｏＤｌ：ＤＥＰＣ：ＤＭＳｏ：ＥＣＭ：ＥＤＴＡｌ证ＰＥＳ：ＭＭＰｓ：ＭＭＰＩ：ＭＴｌｌ：ＴＥＭＥＤ１１ｌＭＰｓ：’Ｄｉｓ：缩略词表Ｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙ光密度Ｄｉｅｔｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ焦碳酸二乙酯Ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ■甲亚砜Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕａｒｍａｔｒｉｘ细胞外基质Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄ乙二胺四乙酸Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ羟乙基哌嗪匕磺酸；Ｎ一２羟互。基哌臻一Ｎ‘一２一乙磺酸Ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ暴质金属蛋白酶Ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓｉｎｈｉｂｉｔｏｒ基质金属蛋白酶抑制剂３－ｆ４，５一ｄｉｍｅｔｈｙＩｔｈｉａｚｏｌ一２一ｙ１）一２，５一ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ四氮唑赫Ｔｅｈ．ａｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ四甲基乙二胺Ｔｉｓｓｕｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｆｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ组织基质金属蛋白酶抑制剂Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｌａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ＝ｉ羟甲基氨基甲烷日Ｕ舌侵袭、转移是恶性肿瘤最重要的生物学特征之一，也是临床肿瘤病人死广：的主要原因。抑制肿瘤侵袋、转移为当今国际研究热点。在肿瘤侵袭转移过程中，山于肿瘤细胞要多次穿越基底膜并侵入周围组织，因此对包括基底膜在内的细胞外基质（ｅｘｔＴａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘ，ＥＣＭ）的降解是肿瘤侵袭转移的关键步骤之…‘。ＥＣＭ主要由胶原、糖蛋白、蛋白多糖和氨基葡聚糖等组成。胶原是ＥＣＭ的主要成分，至少有１２种类型。Ｉ、ＩＩ、ｌｌＩ型胶原是结缔组织中的主要成分，Ⅳ型胶原主要存存基底膜。已有充分证据表明，肿瘤细胞的侵袭转移能力与其产生或诱导宿主细胞产生降解ＥＣＭ的蛋白酶的能力密切相关。降解ＥＣＭ的基质金属蛋白酶（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌＩｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，ＭＭＰｓ）是迄今为止发现的ｏｊ肿瘤侵袭转移关系最为密切的一类蛋白水解酶…１。而其中的又以明胶酶（即ＩＶ型胶原酶，ＭＭＰ一２，９）尤为重要，因为Ⅳ型胶原酶不但可以降解细胞问基质成分还能降解基底膜的主要成分Ⅳ型胶原…２。由于认识到ＭＭＰｓ在肿瘤侵袭、转移中的重要的作用，ＭＭＰｓ（特别是ＭＭＰ一２）抑制剂的筛选和Ｊ｜Ｊ发受到广泛的重视。８０年代中后期，发现在一些正常组织中存在一种天然的基质金属蛋白酶抑制剂（ｔｉｓｓｕｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｆｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，ＴＩＭＰｓｌ，这种大分子的金属蛋白酶抑制剂参与调节组织中基质金属蛋白酶的活性。重组ＴＩＭＰｓ能部分抑制Ｂ１６一Ｆ１０小鼠黑色素瘤细胞的体外侵袭能力和实验性肺转移能力“３４３；将’ＦＩＭＰｓｃＤＮＡ转移到该细胞或ｃ－Ｈａ—ｒａｓ转化的大鼠胚胎细胞中并使之稳定表达时，细胞的实验性肺转移能力也火火下降…５。但由于ＴＩＭＰｓ是一种大分子蛋白，存在降解和吸收困难等问题，小分子ＴＩＭＰｓ是一个理想的研究方向。Ｍａｆｌｙｓｔａｔｉｎ是从放线菌Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａａｔｒａｍｅｎｔａｒｉａ发酵液中分离得到的一类小分子化合物，能特异抑制ＭＭＰ一２和ＭＭＰ一９，并目．剂量依赖性的抑制ＨＴ一１０８０人纤维肉瘤细胞的体外侵袭能力…６。定向合成亦能够获得更为特异的抑制ＭＭＰｓ的化合物，如ＢＢ３１０３、ＢＢ９４和ＢＢ２５１６等。但卜述化合物用在人体内却因存在吸收、降解、毒性等问题并不理想，故目前这方面工作仍存探索之中。中草药抗肿瘤侵袭转移研究的报道甚少。国内甄永苏教授对大黄素抑制人高转移肺癌ＰＧ细胞的肿瘤转移相关性质作了研究，发现用大黄素干预ＰＧ细胞，可使细胞对人工皋底膜的侵袭能力下降，同时细胞ＭＭＰ一２和ＭＭＰ一９的分泌量也下降‘７』。韩锐教授对金荞麦提取物的抗肿瘤转移作用进行了一些研究，发现金荞麦提取物可明显抑制Ｂ１６一ＢＬ６细胞的侵袭，并能有效地抑制Ｂ１６一ＢＬ６黑色素瘤细胞在Ｃ５７／ＢＬ６小鼠体内的自发性肺转移：陔提取物还能抑制ＨＴ一１０８０细胞ＭＭＰ一２和ＭＭＰ一９的产生一眠Ｐｅｒｅｚ和Ｓａｎｃｈｅｚ…９最近在总结天然蛋白酶抑制剂抗蛇毒引起出血的研究时指出，蛇毒叶］含丰富的ＭＭＰｓ，这砦酶可通过『：预血液凝聚、防止血栓形成、降解基底膜或胞外基质部分而引起出血。而蛇及某些温血动物的血清中有ＴＩＭＰｓ，具有抗出血作用。从这些动物的血中提取ＴＩＭＰｓ，外用治疗毒蛇咬伤应有较好的疗效，但因存在降解和吸收网难等问题，难以用于肿瘤治疗。如果从抗毒蛇咬伤的本草中筛选出天然的具有抗肿瘤侵袭转移能力的小分子ＭＭＰｓ抑制剂，则可能解决诸如化学合成药毒性大，ＴＩＭＰｓ降解、吸收网难及抗原性等问题。本研究即拟将两种常用抗毒蛇咬伤的本草复方粗提成分，给大鼠灌胃制备成药物血清，再利用体外培养的高转移胰腺癌Ｐａｎｃ一１细胞株观察上述药物血清对ＭＭＰｓ的产生和表达的抑制能力，初步筛选出具有抑制ＭＭＰｓ能力的本草组分。由ｐ恶性肿瘤发病率高、转移后果严重，至今缺乏特效药。控制癌细胞侵袭、转移小仪可以延缓其发展，而且能为采取其它治疗措施赢得宝贵时间。因而研制与丌发天然ＭＭＰｓ抑制剂具有广阔的应用前景和社会经济效益。材料与方法材料１．１动物１Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ（ｓＤ）大鼠２１只，雌雄各半，普通级，体重（２５０±２０）ｇ，由本校实验动物中心提供。１．２细胞株Ｐａｎｃ—Ｉ（Ａ肤腺癌细胞株）：由德国乌尔姆大学惠赠１３药物Ｂ１１０和Ｇ２１０：购于江苏医药公司１．４试剂戊巴比妥钠：上海化学试剂分装厂，Ｓｅｒｖａ进口分装ＲＰＭＩＭｅｉｕｍ１６４０：美国ＧＩＢＣＯＢＲＬ公司产品ＨＥＰＥＳ：武汉生命技术有限公司，Ｒｏｃｈｅ进口分装小牛血清：杭州网季青生物工程公司产品青霉素、链霉素：山东鲁抗医药股份有限公司产品二甲皿砜（ＤＭＳｏ）：上海生工生物Ｔ程有限公司，ＡＭＲＥＳＣｏ分装四唑氮盐（ＭＴＴ）：Ｓｉｇｍａ公司产品胰蛋白酶：Ｄｉｆｃｏ公司进几分装焦碳酸二乙醣（ＤＥＰＣ）：上海生工生物一１：程有限公司，ＡＭＲＥＳＣｏ分装总ＲＮＡ提取液（Ｔｒｉｚｏｌｌ：南京生工生物技术服务中心产品ＲＴ—ＰＣＲ试剂盒：ＴａＫａＲａ公司产品（ＲＮＡＰＣＲＫｉｔＶｅｒ．２．１ＭａｎｕａｌＫｉｔＤＲ０１９Ａ）ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ：５０“１２５ｕ④ＡＭＶＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅＸＬ（５ｕｎｉｔｓ／ｕ１）②ＲｎａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０ｕｎｉｔｓ／１．ｔ１）ｌＩ⑧ＯｌｉｇｏｄＴ—Ａｄａｐｔｏｒｐｒｉｍｅｒ④ＲＮａｇｅＦｒｅｅｄｉｓｔｉｌｌｅｄｌｑ［２０⑨ＴａＫａＲａＴａｑ⑧１０ｘＲＮＡＰＣＲＢｕｆｆｅｒ１００ｍＭＴｒｉｓ—ＨＣＩ（ＰＨ８．３）５００ｍＭＫＣｌ⑦ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（２．５ｐｍｏＩ／ｕＩ）５０ｎ（５ｕｎｉｔｓ／ｐ１）１ｍｌ２５ｐ１１ｒｎｌｆ１０ｍＭｅａ）１５０ｐ１⑨ＭｇＣｌ２（２５ｒａＭ）ｌｍｌＤＮＡＭａｒｋｅｒ：华美生物Ｔ程公司产品，１００—１０００ｂｐ，５００ｂｐ为加强带Ｂｕｌｅ／ｏｒａｎｇｅ６×ｌｏａｄｉｎｇＤｙｅ：华美生物工程公司产品，１０％Ｆｉｃｏｌｌ４００，Ｏ．２５％ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌｂｌｕｅ，０，２５％ｘｙｌｅｎｅｃｙａｎｏｌ，０．４％ｏｒａｎｄｅＧ，１０ｍＭＴｒｉｓ—ｌｔＣｌ（ｐＨ７．５、，５０ｍＭＥＤＴＡ。琼脂糖：南京生工生物技术服务中心，ＡＭＲＥＳＣＯ分装石蜡油：ＳＮＢＣ分装澳化乙锭：Ｓｉｇｍａ公司产品乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ）：济南试剂总Ｊ一无水乙醇：分析纯，上海化学试剂有限公司氯仿：分析纯，中国宝应化学试剂厂异戊醇：分析纯，南京化学试剂厂十二二烷基磺酸钠（ｓＤｓ）：ＧＩＢＣＯＢＲＬ公司产品三羟甲基氨基甲烷（Ｔｒｉｓ）：南京生工生物技术服务中心，ＡＭＲＥＳＣＯ分装１，５１．６试剂的配制１６．１细胞培养液（ＰＨ＝７．２，１０００ｍＩ）：１．６２小牛血清：５６。Ｃ水浴灭活３０分钟，分装后于一２０。Ｃ保存。丙烯酰胺：ＢＢｌ分装Ｎ，Ｎ一亚甲双丙烯酰胺：南京牛工生物技术服务中心，ＡＭＲＥＳＣｏ分装过硫酸胺：南京创瑞生物技术有限公司进口分装四甲雄乙．胺（ＩｒＥＭＥＤ）：上海生Ｔ生物工程公司产品明胶：华美生物工程公司，Ｓｉｎｏ—ＡｍｅｒｉｃａｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ进口分装甘油：上海生Ｔ生物工程公司产品溴酚兰：南京生兴生物工程公司，ＡＭＲＥｓＣｏ分装甘氨酸：南京创瑞生物技术有限公司进口分装ＴｒｉｔｏｎＸ一１００：华美生物：ＩＩ程公司，ＡＭＲＥｓＣｏ分装Ｂｒｉｊ一３５（１二烷基聚乙二醇醚）＝－卜海医科大学病理教研室惠赠考马斯亮蓝Ｇ２５０：南京生兴生物工程公司，ＡＭＲＥＳＣｏ分装甲醇：分析纯，南京红旗化工厂乙酸：分析纯，南京化学试剂厂ＣａＣｌ２：分析纯，南京化学试剂厂ＺｎＣｌ２：分析纯，南京化学试剂厂ＮａＣｌ：分析纯，南京化学试剂一厂器材６、２４、９６孔细胞培养板：ＮＵＮＣ细胞培养瓶：江阴光明玻璃仪器厂产品Ｃ０２培养箱（ＧＢｌ６型）：德国Ｈｅｒａｅｕｓ公司产品特种净化工作台（ＳＷ—ｃＪ—ＩＦＤ）：苏州安泰空气技术有限公司产品倒置相差显微镜（ＸＳＺ－－Ｄ２型）：重庆光学仪器厂酶联免疫检测仪：ｆ＝＝１本ＢＩｏ—ＲＡＤ产品水平式ＤＮＡ凝胶电泳槽（ＤＹ—Ａ）：上海生化所西巴斯生物技术开发公司垂直电泳槽：北京六一科学仪器厂产品微量移液器：１０、２０、２００、１０００ｕｌ，ＧＩＬＳＯＮ产船台式高速普通离心机（ＴＧＬ一１６Ｃ型）：上海安亭科学仪器厂台式高速冷冻离心机：德国Ｈｅｒａｅｕｓ公司产品ＰＣＲ扩增仪：Ｈｙｂａｉｄ公司产品ＤＮＡ—ＲＮＡ检测仪：ＧｅｎｅＱｕａｎｔ，ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ产品电子天平：德圈ＳＡＲＴＯＲＩＵＳ公司产品精密ＰＨ汁：上海电磁仪器Ｊ一产品平板振荡器（７５２一Ａ型）：上海医用分析仪器厂产品电热恒温水槽（ＤＫ一８Ｄ）：上海医用恒温设备厂产品快速混匀器（ＳＫ一１型）：常州国华电器有限公司产品台式干燥箱（ＤＧＢ／２０－－００２型）：重庆试验设备Ｊ一图像分析处理系统：ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒＶＤＳ图像分析仪（美国ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ公刊）进行灰度扫描后用ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒＴｏｔａｌｌａｂ软件分析ＲＰＭＩ１６４０１０．４９，ＨＥＰＥＳ５．９９，ＮａＨＣ０３３．０９，青霉素１０万Ｕ，链霉素１０力Ｕ，加双蒸水８００ｍｉ，溶解，调ＰＨ值７ｔ２，加水定容１０００ｍｌ，４＂Ｃ放置６小叫，用直径２，２ｕｍ微孔滤膜滤器抽滤除菌，分装后一２０。Ｃ保存。１，６’３１６４１６５１６．６１６．７１６８１６９１６１０１６．１１１６．１２１．６．１３１．６．１４１．６．Ｊ５１６．１６加样缓冲液ｆ２×，ＰＨ＝６，８，５０ｍ１１１６１７电泳槽液ｆ５×，ＰＨ＝８．３，５００ｍ１１ＰＢＳ（ＰＨ＝７．２，１０００ｍ１）：ＮａＣｌ８．０９，ＫＣｌ０．２９，Ｎａ２ＨＰ０４．１２Ｈ２０３．４７８９，ＫＨ２Ｐ０４０－２９，加入８００ｍｌ水，盐酸调ＰＨ值７．２，加水定容１０００ｍｌ，混匀，高压灭菌，分装后４＂Ｃ保存。Ｄ—Ｈａｎｋｓ液（ＰＨ＝７．２，５００ｍ１）：ＮａＣｌ８．０ｚ，ＫＣｌＯ４９，Ｎａｌ‘ＩＣ０３Ｏ３５９，Ｎａ２ＨＰ０４．１２Ｈ２００．０６９，ＫＨ２Ｐ０４００６９，酚红Ｏ．０２９，加双蒸水８００ｍｌ，溶解，调ＰＨ值７２，加水定容１０００ｍｌ，混匀，高压火菌，分装后４℃保存。Ｏ．２５％蛋白酶（含０．０２％ＥＤＴＡ）：称取Ｏ，２５９胰蛋白酶，Ｏ．０２９ＥＤＴＡ，用Ｄ—Ｈａｎｋｓ液定容至１００ｍｌ混匀，４℃过夜，次Ｈ以直径０．２２¨ｍ的微孔滤膜正压过滤除菌，分装后一２（）℃保存备用。ＭＴＴ：用ＰＢＳ配制成５ｍｇ／ｍｌ溶液，抽滤除菌，避光４℃保存，隔周重配。０．１ＧＤＥＰＣ：ｌｍｌＤＥＰＣ原液溶于１０００ｍｌ双蒸水中，３７℃水浴箱过夜，商压消毒３０ｒａｉｎ，ｑ℃保存。５×ＴＢＥ缓冲液（ＰＨ＝８．０，５００ｍ１）：５４９Ｔｒｉｓ，２７５９硼酸，２０ｍｌＯ．５ＭＥＤＴＡ（ＰＨ８．０），加双蒸水４００ｍｌ，调ＰＨ值至８．０，定容至５００ｍＩ，４℃保存备用，用时稀释成Ｏ．５×ＴＢＥ缓冲液。１７％琼脂糖凝胶：称取Ｏ．６８９琼脂糖，溶于４０ｍｌ０．５×ＴＢＥ溶液中，加热完全溶觯，待冷却至６０。Ｃ左右时，加入２．５ｕｌ１ｒａｇ／ｍｌ澳化乙锭溶液，使之弥散均匀，倒入插好样品梳的水平电泳槽制胶板中，胶凝固３０ｍｉｎ后拔出梳子，将胶板置于电泳槽中，加入０．５×ＴＢＥ溶液，使液面高于胶面约Ｏ５ｍｍ，备用。３０％丙烯酰胺溶液（丙烯酰胺：亚甲双丙烯酰胺＝２９：１１：２９９丙烯酰股和１９Ｎ，Ｎ一亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为６０ｒｉｇ的去离—Ｆ水中，加热至３７。Ｃ溶解，加水至１００ｍｉ，置于棕色瓶中（有神经毒性，要带手套和帽子）。１．５ＭＴｒｉｓ（ＰＨ＝８．８，２５０ｍ１）：称耿Ｔｒｉｓ４５．４３９，加入２００ｎ＿ｌＩ去离子水，浓ＨＣＩ调ＰＨ值至８．８，加水定溶至２５０ｍ１。１０ＭＴｒｉｓ（ＰＨ＝６．８，２５０ｍ１）：称取Ｔｒｉｓ３０．２９９，加入２００ｎ咀去离子水，浓ＨＣｌ调ＰＨ值至６．８，加水定溶至２５０ｍｌ。１０％ＳＤＳ（ＰＨ＝７．２，１００ｍ１）：称取１０．０９ＳＤＳ，加入９０ｍｌ去离子水，６８．０。Ｃ助溶，调ＰＨ值至７．２，加水定溶至１００ｍｌ（微品粒易扩散，带口罩）。１０％过硫酸胺：称取２．５９过硫酸胺，溶于２５ｍ１去离子水中，４℃保存，隔周重配。１％明胶液：称取２．５异明胶，溶于２５０ｍｌ去离子水中，加热溶解，贮于４℃，用时冉加热使之溶解。含有Ｏ０８ＭＴｒｉｓ，４％ＳＤＳ，１０％甘油，Ｏ．０５％溴酚蓝称取ＴｒｉｓＯ．４８４９，ＳＤＳ２，０９，澳酚蓝Ｏ．０２５９，加入甘油５ｍｌ，再力¨入４０ｍｌ去离子水溶斛，调ＰＨ值至６．８，定容至５０ｍｌ。含有５×２５ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ，５×２５０ｍｍｏｌ／Ｌ甘氨酸，５×０．１％ＳＤＳ称耿Ｔｒｉｓ７５５９，甘氨酸４７．０９，加入２５ｍｉ１０％ＳＤＳ，ｈＨＡ．４５０ｍｌ去离子水，调ＰＨ值至８．３，定容至５００ｍｌ。１．６．１８洗脱液（２×，ＰＨ＝７．６，５００ｍ１）称取Ｔｒｉｓ６．０５７９，ＣａＣｌ２．２Ｈ２００．７３５９，ＪＪＮＡ．２５ｍｌＴｒｉｔｏｎＸ一１００，２ｍＭＺｎＣｌ２（０．１３６９加至５００ｍｌ水中）０．５ｍｌ，加去离子水４５０ｍｉ，调ＰＨ值至７．６，定容至５００ｍｌ。１．６１９漂洗液（２×，ＰＨ＝７．６，５００ｍ１）：除Ｔｒｉｔｏｎ外，余同洗脱液。１６．２０孵育液（２×，ＰＨ＝７．６，５００ｍ１）：¨殂¨忽：Ｍｎ１ｚ№ｚ¨２１４采咖：第三次给药后２ｈ自下腔静脉采血２．１．５血清分离：称取Ｔｒｉｓ３．２９９，ＣａＣｌ２・２Ｈ２００．３６７９，Ｂｒｉｊ一３５０．１９，ＮａＣｌ４．３８３９，加入２ｒａＭＺｎＣ］２Ｏ２５ｍｌ，加去离子水４５０ｍｌ，调ＰＨ值至７．６，定容至５００ｍｌ。染色液：称取考马斯亮蓝Ｇ２５０２．５９，加入甲醇１５０ｍｌ，乙酸５０ｍｌ，加去离子水定容至５００ｍｌ。脱色液：脱色液Ａ：１５０ｍｌ甲醇，５０ｍｌ乙酸，加去离子水至５００ｍｌ脱色液Ｂ：１００ｍｌ甲醇，５０ｍｌ乙酸，加去离子水至５００“１ｌ脱色液Ｃ：５０ｒａｌ甲醇，２５ｍｌ乙酸，加去离子水至５００ｍｌ方法实验分组：选取２１只体重在（２５０±２０）ｇ的ＳＤ大鼠，雌雄各半，随机分为三组：①空白对照组：７只，灌入ＮＳ②Ｂ１１０药物组：７只，灌入药物Ｂｌｌ０⑧Ｇ２１０药物组：７只，灌入药物Ｇ２１０分别放入标记笼１，２，３中，常温下饲养。药物制备：Ｂｌｌ０胶囊（０．２５９／粒）：取０．５９胶囊，置于１００ｍｌ锥形瓶中，加入７５ｍ１生理盐水，振荡摇匀。药物Ｇ２１０（黑色片剂）：耿５０片Ｇ２１０，研碎，置于１００ｍ１锥形瓶中，加入７５ｍｌ生理盐水，磁力搅拌器搅匀。灌胃：饲养的大鼠进水禁食１２小时后，按分组灌入药物，期间仍进水禁食。给药剂量：给药剂量按人鼠等效药量换算方法，相当于６０ｋｇ体重成人同用量的同倍。①对照组：灌入ＮＳ，３ｍｌ／ｒａｔ／次②药物组１：灌入Ｂ１１０，０．０２９／３ｍｌ／ｒａｔ／次③药物组２：灌入Ｇ２１０，２片／３ｍｌ／ｒａｔ／次给药方式：一次给药、．次给药、三次给药（每次给药后４ｈ再以同剂量给药一次）。步骤：１、ＳＤ人鼠称重，予０．４％戊巴比妥钠以ｌｍＩ／ｌＯＯｇ剂量腹腔麻醉２、麻醉好的大鼠仰卧位置于手术台上，予有齿镊夹起腹正中皮肤，沿腹正中线自下向上剪开皮肤，暴露内脏３、无齿镊提起皮卜｜筋膜分离，腹正中见一直径约Ｏ．５～１ｃｍ的静脉色血管（最粗），即为下腔静脉。用无齿镊把内脏推向大鼠左侧，暴露Ｆ腔静脉４、弘１０ｍＩ注射器自下腔静脉抽血，量约５～ｉｏｍｌ不等，量少者可向上剪开横膈，找到心脏，抽取房室血。每只大鼠约可抽血ｌＯｍｌ，放置于消毒后的离心管中，盖盖编号，４Ｖ静置过夜。静置后的血样予２０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，ｌｍｌ微量移液器吸出上层血清，置于药物血清的制备消毒后的玻璃瓶中，同种条件血清混匀，５６℃，３０ｍｉｎ水浴灭活，用直径２．２ｕ１１１微孔滤膜滤器抽滤除菌，分装后一２０。Ｃ保存。２２细胞培养Ｐａｎｃ一１细胞用含ｌＯ％小牛血清的ＲＰＭＩ１６４０培养液，置于３７℃，５％Ｃ０２培养箱中培养，待细胞长至培养瓶底部８０％后，弃去原培养液，用ＰＲＳ液洗瓶壁细胞＿次，用含０．０２％ＥＤＴＡ的０．２５％胰蛋白酶消化细胞，相差显微镜下见细胞收缩，细胞间隙清晰，立即翻转培养瓶使细胞离丌消化液，弃去消化液，之后加入含１０％小牛巾清１６４０培养液，用吸管将细胞自瓶壁吹打下来，按１：２或１：３比例传到新培养瓶中，给予传代培养。待细胞处于对数生长期，用于下。步实验。２．３药物丁预２．３１用ＲＰＭＩ１６４０液按倍比稀释的方法把对照组空白血清、Ｂｔｌ０药物血清和６２１０药物血清分别配制成５％、１０％、２０％的药物血清。２．３２取对数生长期的Ｐａｎｃ一１细胞株胰酶消化，用含ｌＯ％小牛血清的ＲＰＭＩ１６４０培养液制成３Ｘ１０５／ｍｉ的细胞悬液，接种＿丁＝Ｊ六孔板中，每孔３ｍｌ，置于３７℃，５％ｃ０２培养箱中４８ｈ，细胞约铺满８０％，吸出培养液，用无血清１６４０培养液洗涤２次，分别加入配制好的５％、１０％、２０％的药物血清和空白血清。另设一溶剂对照，只加入１６４０培养液。置于３７℃，５％Ｃ０２培养箱继续培养２４ｈ后取出，收集培养上清，低速离心（２００Ｘｇ）去除细胞碎片，分装后立刻进行酶谱分析或存于一７０９Ｃ。细胞予ＰＢＳ沈涤２次，加入ＲＮＡ提取液，提取ＲＮＡ行ＲＴ—ＰＣＲ。２．４明胶酶谱法检测用药前后Ｐａｎｃ．１细胞ＭＭＰ．２的分泌水平２４１原理：明胶酶蔷法是以ＳＤＳ—ＰＡＧＥ系统作为手段，将培养上清或组织匀浆中各蛋白成分按分子量大小分离，并以加入凝胶中的明胶作为底物，在电泳完成后，置于适合明胶酶（ＭＭＰ一２）的条件下孵商后再染色，脱色。在明胶酶的活性区域，由于明胶已被降解，故不能被染色，表现为兰色背景下的透亮带。明胶酶含量越多，带的量度和宽度也就越大。这种方法检测的灵敏度很高，可检测到培养上清中低至４ｎｇ／ｒｎｌ的明胶酶。因此可。以用这种方法衡量药物对肿瘤细胞分泌明胶酶能力的影响。２．４２主要参数：８％分离胶，５％浓缩胶，０，１％ＳＤＳ，０．１％明胶２．４３步骤：２．４．３１８％ＳＤＳ—ＰＡＧＥ的制作（１）分离胶１５ｍｌ：去离子水５．４ｍｌ３０％丙烯酰胺４０ｍｌ１．５ＭＴｒｉｓ（ＰＨ８．８）３．８ｍｌ１０％ＳＤＳ０．１５１１１ｌ加％过硫酸胺０．１５ｍｌ１％明胶１５ｍｌＴＥＭＥＤＯ．００９ｍｌ渖：３０％丙烯酰胺有神经毒性，凝同无毒，应带手套操作尚需配制１％琼脂封口用ｆ电泳缓冲液配制）。（２）在两玻Ｉ离板ｒ＇ＨＪ隙ｒｆ；ｆ灌注丙烯酰胺溶液，留出灌注浓缩胶所需空间ｆ梳子的齿长再加１ｃｎｌ），用吸管小心的在丙烯酰胺溶液上覆盖上一层１％ＳＤＳ，将凝胶垂直放置于室温Ｆ（３）分离胶聚合完全后（约３０分钟），倾出覆盖层液体，用去离子水洗涤凝胶顶６部数次以除去未聚合的丙烯酰胺，再用纸巾吸净残留液体３．４ｍｉ去离子水（４）浓缩胶５ｍＩ：Ｏ．６８ｍｌ１ＭＴｒｉｓ（ＰＨ６．８）３０％丙烯酰胺溶液０．８３ｍｌ１０％ＳＤＳ０．０５ｍｌ１０％过硫酸胺０．０５ｍｌＴＥＭＥＤ０．００５ｍＩ（５）在已聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，立即在浓缩胶溶液中插入干净的Ｔｅｆｌｏｎ梳子，小心避免混入气泡，再加入浓缩胶溶液以充满梳了问的空隙，将凝胶垂直放置于室温下（６）浓缩胶聚合完全后（约３０分钟），小心移出梳子，立即用去离子水洗涤加样槽以除去未聚合的丙烯酰胺２．４．３２固定：凝胶田定于电泳装置上，上下槽各加入甘氨酸电泳缓，排出凝胶底部和两玻璃问的气泡２．４３，３加样：取２０“ｉ培养上清与等量２Ｘ加样缓冲液混合，用微量注射器加样至样品孔底部２．４．３．４电泳：接电源ｆ正极接下槽），浓缩胶内电压８０Ｖ，电流Ｏ．３—０．４Ａ；分离胶内１５０Ｖ，Ｏ．４Ａ。溴酚兰到达底部约４小时，关电源（取胶时，切下左下角作为标记）２．４３５洗脱：切除浓缩胶，分离胶加入洗脱液室温振摇洗脱３０分钟×２次，除去ＳＤＳ２．４３．６漂洗：加入漂洗液振摇洗２０分钟×２次２．４３７孵育：加入孵育液，于３７℃孵育４５～４８小时２．４．３．８染色与脱色：０．５％考马斯亮蓝染色３小时后，依次加入脱色液Ａ、Ｂ、和Ｃ，每次脱色约４０分钟２．４．３９保存：７％乙酸溶液保存并摄影记录２４．４凝胶结果于普通灯下观察、照相，用ＩｍａｇｅｍａｓｔｅｒＶＤＳ密度扫描定量，ＴｏｔａｌＬａｂ软件进行分析。以１６４０培养液溶剂对照组为参照，用实验组与溶剂对照组的ＭＭＰ一２的光密度体积比值（ｓａｍ／ｃｏｎ）来表示各组ＭＭＰ一２的分泌量，并把各药物组ＭＭＰ一２的分泌量与同浓度的空白血清组相比较，得到ＭＭＰ一２的抑制率。每组实验重复三次。在ＳＤＳ—ＰＡＧＥ凝胶中加入明胶作为明胶酶的底物，用于检测细胞条件培养基中的明胶酶（ＭＭＰ一２），电泳后凝胶经复性处理，使酶充分发挥其活性，再片ｊ考马斯亮蓝染色，胶中为未着色区域表明有明胶酶存在。在电泳条件下，明胶酶和金Ｊ禹蛋白酶组织抑制因子的复合体会自动解体，明胶酶原也会自动活化，因而酶原及活化形式的明胶酶均可检测到，收集药物干预２４ｈ后体外培养的Ｐａｎｃ一１细胞株的培养ｆ＝’清，经ｇｅｌａｔｉｎ－ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ电泳，检测ＭＭＰ一２的分泌量。２５ＭＴＴ浊检测Ｂ１１０、Ｇ２１０药物血清对Ｐａｎｃ一１细胞的增殖抑制作用取对数生氏期的Ｐａｎｃ一１细胞消化、计数，接种于９６孔培养板，每孔含３０００个细胞：晷液２００ｕｌ，置于３７℃，５％Ｃ０２培养箱中培养２４小时后，每孔加入用ＲＰＭＩ１６４０培养液配制好的５％、１０％、２０％的Ｂ１１０和Ｇ２１０药物血清及对照知窄内血清各２００ｂｔｌ，每一浓度设３个平行孑Ｌ，继续培养２４ｄ，Ｄ－寸，弃上清，每孔加入ＰＢＳ溶液配制的５ｍｇ／ｍｌＭＴＴ２０ｕＩ，３７℃，继续孵育４小时，终止培养，小心吸弃孔内的培养上清液。每孔加入１５０１－ｔ１ＤＭＳＯ，振荡１０分钟，溶解蓝紫色颗粒，于酶标仪上测定５７０ｎｍ波长的吸光度（Ａ５７０），再计算细胞抑制率。细胞抑制率（％）＝Ｌ１一Ａ加药血清组／Ａ空白血清组）×１００％２．６２．６，１ＲＴ—ＰＣＲ法检ｉｆ，０Ｐａｎｃ一１细胞ＭＭＰ一２ｍＲＮＡ的表达实验器械的处理用于ＲＴ—ＰＣＲ的玻璃器皿常规洗净后，在烤箱内１８０℃干烤１０ｈ。所有塑料器材（如Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管、Ｔｉｐｓ吸头、ＰＣＲ薄壁管）均为新购产品，使用前用０．１％ＤＥＰＣ浸泡１２ｈ，高压消毒、烘干。用于提取ＲＮＡ的氯仿、异丙醇均为新包装。７５％的乙醇由２５ｒｎｌ０．１％ＤＥＰＣ水与７５ｍｌ无水乙醇混匀配制而成，４。Ｃ保存。２胰腺癌细胞总ＲＮＡ的提取：２．６２６．３测ＲＮＡ浓度和纯度：２．６．４逆转录（２０“ｌ反应体系）：２６．５引物合成：（１）药物干预２４ｈ后的细胞，吸取上清用于明胶酶潜法检测ＭＭＰ．２蛋闩，细胞用ＰＢＳ洗涤两遍（２）分别加入Ｔｒｉｚｏｌ１ｍｌ，吸头吹打数次，移入ＤＥＰＣ水处理过的１．５ｍｌＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管巾，１５℃－－３０。Ｃ放置５分钟（３）加入氯仿２００Ｈｌ，剧烈手振摇１５秒，抽提ＲＮＡ，１５℃－－３０℃放黄２－－３分钟（４）离心，１２０００Ｇ×１５分钟（４。Ｃ）（５）吸取卜层无色水相置另一Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管巾（６）加入０５ｍＩ异丙醇，充分混匀，沉淀ＲＮＡ，１５。Ｃ－－３０℃放置１０分钏ｒ（７）离心１２０００Ｇ×１０分钟（４４Ｃ），ＲＮＡ在管底形成凝胶样物质（８）弃上清，加入７５％的ＤＥＰＣ配制的乙醇ｌｍｌ，洗涤ＲＮＡ，振荡器混匀（９）离心７５００Ｇ×１０分钟（４℃）（１０）弃上清，空气干燥１０分钟ｑＤ加ＤＥＰＣ处理后的水２０ｕｌ，５６℃水浴１０ｍｉｎ溶解ＲＮＡ沉淀预热ＤＮＡ—ＲＮＡ测定仪，调适好各项参数，用灭活的０．１％ＤＥＰＣ水１０００ｕ１调零。取ＲＮＡ样品１ｕ１，加入灭活的０．１％ＤＥＰＣ水９９９Ｉｘｌ，混匀。直接读取ＲＮＡ浓度和Ａ２６０／２８０比值，并根据稀释情况得出实际的ＲＮＡ浓度，重复操作三次驳乎均值。ＲＮＡ的Ａ２６０／２８０比值均在１．７以上。根据ＲＮＡ浓度加ＤＥＰＣ水，使各个样品浓度一致。立即进行ＲＴ．ＰＣＲ或置于一７０℃保存备用。按试剂盒说明加入下列反Ｊ避体系ｄｄＨ２０８５１２ｌＭｇＣｌ２４ｕＩ１０×ｂｕｆｆｅｒ２ｕ１ｄＮＴＰ２ｕｌＯｌｉｇｏ—ｄＴ１ＲＮＡ１ｌ－ｔ１ＲａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ０．５ｕｌＡＭＶ１ｕｌ混匀，瞬时离心，４２。Ｃｘ３０分钟一９９℃×５分钟一５℃×５分钟。反应产物立即扩增或一２０９Ｃ冻存。ＭＭＰ２基因引物序列设计参见文献［１０１，ＧＡＰＤＨ基因引物序列设计参见文献‘１１１，引物序列与从ＧｅｎｅＢａｎｋ上下载的ｃＤＮＡ序列核对无误后，ＭＭＰ一２引物由上海生工生物工稗有限公司合成，ＧＡＰＤＨ引物由上海博彩公司合成，各引物序列及引物特异扩增的ＰＣＲ产物长度见下ＧＡＰＤＨ引物序列：（扩增片段５２８ｂｐ）上游５７－ＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＣＴＴｏ’２６６２．６７７．统计学处理ｌｊ游５＇－ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ一３’ＭＭＰ一２引物序列：（扩增片段３９７ｂｐ）上游５＇－ＣＡＧＧＣＴＣＴＴＣＴＣＣｌｌＴＣＡＣＡＡＣ一３’下游５＇－ＡＡＧＣＣＡＣＧＧＣＴＴＧＧＴＴＴＴＣＣＴＣ．３７使用前每１个ＯＤ的引物加入适量的去离子水，配制成２０ｐｍｏｌ／ｕｌ浓度。ＰＣＲ扩增：按试剂盒加入扩增体系（５０ｕＩ）ｄｄＨ２０３０．７５ｕｌ１０×ｂｕｆｆｅｒ４ｕｌＭｇＣｌ２３ｕ１ＧＡＰＤＨＥ游Ｏ．３ｕｌＧＡＰＤＨ下游０．３ｕｌＭＭＰ一２上游０．７ｕｌＭＭＰ一２下游０７“ｌＴａｑ酶０．２５ｕｌ加入逆转录产物ｃＤＮＡ１０ｕｌ，再加入石蜡油２０ｕｌ，振荡器混匀，瞬时离心。予９４。Ｃ，２ｍｉｎ，１ｃｙｃｌｅ一９４。Ｃ３０ｓｅｃ，５５。Ｃ３０ｓｅｃ，７２。Ｃ１．５ｍｉｎ进行３０次循环一７２。Ｃ，７ｍｉｎ一４℃保存。ＰＣＲ产物半定量：将ＰＣＲ产物进行１．７％琼脂糖凝胶电泳，０．５×ＴＢＥ，３Ｖ／ｃｍ。结果于紫外灯下观察、照相，电泳胶以ＩｍａｇｅｍａｓｔｅｒＶＤＳ密度扫描，用ＴｏｔａｌＬａｂ软件对条带分析。以ＧＡＰＤＨ为内参照，ＭＭＰ．２和ＧＡＰＤＨ的光密度比值（ＭＭＰ一２／ＧＡＰＤＨ）来表示ＭＭＰ一２ｍＲＮＡ的相对表达量，并把各药物组ＭＭＰ－２ｍＲＮＡ的相对表达量与同浓度的空白血清组相比，得到ＭＭＰ一２ｍＲＮＡ的ｂ－调比例。每组实验重复三次。数据均以均值±标准差表示，统计学处理采用ＳＰＰＳ１１０软件进行单冈素方差分析。２结果１．／ｆｉ同浓度的药物血清对人胰腺癌Ｐａｎｃ一１细胞ＭＭＰ一２分泌的抑制作用以明胶酶谱法检测不同浓度的Ｂｌｌ０和Ｇ２１０药物血清对Ｐａｎｃ一１细胞分泌ＭＭＰ一２的作用。结果显示，在一定浓度范围内，Ｂ１１０和Ｇ２１０药物血清对Ｐａｎｃ一１细胞ＭＭＰ－２的分泌有抑制作用，这种抑制作用呈一定的浓度依赖性。５％、１０％和２０％的Ｂ１１０药物血清对Ｐａｎｃ一１细胞分泌ＭＭＰ－２的抑制率分别为５．３７％、２０．０７％和３７５９％；５％、１０％和２０％的Ｇ２１０药物ｆ｜ＩＬ清对ＭＭＰ一２的抑制率分别为７．７０％、２８．８２％和５４．９７％ｏ。经统计分析，与同浓度空白』Ｉ：『】清相比，１０％和２０％的Ｂ１１０和Ｇ２１０对ＭＭＰ一２的抑制作用具有显著性差异，Ｐ＜０．０５。（幽１，２，３，表１）壅！塑壁堕堂垦垄型至旦堡鏖堑塑垒道墅塑堕坚坚！兰坌鲨塑墅堕ｌ翌三苎！！圭璺组别ｓａｍ／ｃｏｎ空白血清Ｂｌｌ０血消Ｇ２１０血清９６．９９±１３０１９１．７８±１３００８９．５２±１０１５５３７７７０５％１０％２０％抑制牢（％）ｓａｍ／ｃｏＤ９５．４２±７２５７６．２７±９７７６７．９２±１５．７８抑制率（％）ｓａｍ／ｃｏｎ９８．６９＋１１．３０抑制率（％）３７５９＊５４９７＋２０．０尹２８．８２＋６１．５９±１２．８９４４．４４±４．２５注：与同浓度的火鼠空白血清相比，＊Ｐ＜０．０５蚴∞ＩａＢ１黝∞∞鲫鞭瞅臻㈧如委艘搿舯。乜。憎ｉｉｉｉ！ｉ帽Ｔ１０％２０％药物血清浓度图３：不同浓度药物血清对Ｐａｎｃ一１细胞ＭＭＰ，２分泌的影响图１：Ｂ１１０药物血清对Ｐａｎｃ．１细胞ＭＭＰ。２分泌的影响（１、２、３分别为５、１０、２０％空自血清，４、５、６分别为５、１０、２０％Ｂ１１０药物血清，７为溶剂对照１图２：Ｇ２１０药物血清对Ｐａｎｃ一１细胞ＭＭＰ一２分泌的影响（１、２、３分别为５、１０、２０％空白血清，４、５、６分别为５、１０、２０％Ｇ２１０药物血清，７为溶剂对照１２．不同浓度的药物血清对人胰腺癌Ｐａｎｃ．１细胞的增殖抑制作用ＭＴＴ法检测不同浓度的Ｂ１１０和Ｇ２１０药物血清对Ｐａｎｃ。１细胞的增殖抑制作用。结果显示，Ｂ１１０和Ｇ２１０药物血清在达到一定浓度时，剥Ｐａｎｃ一１细胞的增殖有抑制作用。与同浓度的空白血清相比，Ｂ１１０药物血清在浓度为５％、１０％和２０％时，对Ｐａｎｃ一１细胞的增殖抑制率分别为５．１４％、９．８６％和２０．３８％；Ｇ２１０药物血清在浓度为５％、１０％和２０％时，对Ｐａｎｃ一１细胞增殖抑制率分别为６６２％、１４．４４％和２９．６７％。但经统计学分析，与同浓度空白血清相比，只有２０％的Ｂ１１０和Ｇ２１０对细胞的增殖抑制率有显著性差异，Ｐ＜０．０５。（表２，图４）鲞！坚！！鲨坌塑！至旦鲨壁堑塑坐适型塑些堡丛生篓塑星堕（翌三ｉ２１ｉ圭旦组别５％１０％２０％ＯＤ值（‰）抑制率（％）ＯＤ值（‰）抑制率（％）ＯＤ值（‰）抑制率（％）空白ｍＩ清２１８．６７＿＋２６．０８２４８００４－１５．１３２４６．３３±２２．５０Ｂ１１【）Ｉｍ浩２０７．３３±２４．９５５１４２２３３３４－１１５０９．８６１９６．６７±２７．３０２０．３８＊Ｇ２１０ｍ清２０４００＿＋２２．６１６６２２１２．３３±１９．１４１４．４４１７２００±１２７７２９．６７＊注：与同浓度的大鼠空白血清相比，＊Ｐ＜０．０５３００与同浓度的空白珈清相比，＋ＪＤ＜０．０糍肌清２５０趔２００口量１５０再１００５００膻偶／ｉ５％１０９６２０％药物血清浓度图４：不同浓度药物血清对细胞体外生长的影响３不同浓度的药物血清对人胰腺痛Ｐａｎｃ一１细胞ＭＭＰ一２基因ｍＲＮＡ表达的影Ｈ向ＲＴ—ＰＣＲ法检测不同浓度的Ｂ１１０和Ｇ２１０药物血清对Ｐａｎｃ一１细胞ＭＭＰ一２ｍＲＮＡ表达的影ｎ向。结果显示，Ｂ１１０和Ｇ２１０药物血清在一定浓度范围内均可下调Ｐａｎｃ一１细胞ＭＭＰ－２ｍＲＮＡ的表达，并呈一定的浓度依赖性。与同浓度的空白血清相比，ＭＭＰ－２的表达在５％、１０％和２０％的Ｂ１１０药物血清组分别下调，９．１１％、５１．１６％和５６．７８％：在５％、１０％和２０％的Ｇ２１０药物血清分别下调了２７．８５％、７４．７９％和８１．５２％。经统计分析，与同浓度的空白血清相比，５％的Ｇ２１０和１０％、２０％的Ｂ１１０和Ｇ２１０对Ｐａｎｃ一１细胞ＭＭＰ一２ｍＲＮＡ表达的ｆ、涮作用具有显著性差异，Ｐ＜０．０５。（图５，６，表３）５％１０％３６．４９±３．５０１７．８２±１．７５ｔ２０％３６．３０±１．９０１５．６９±１７５＊６．７１±０．９４＊牢臼血清３７．４２±３８９３４．０１±２．２７２７．００±２．１０＋Ｂ１１０血清Ｇ２１０血清９．２０±１．０５＊注：与同浓度的大鼠空白血清相比，＊Ｐ＜０．０５蓦。４；：＿５与同浓度的空白血清相比，叩＜００踮∞蛎∞＝ｍ００５％１０％２０％药物血清浓度图５：小同浓度药物血清对Ｐａｎｃ一１细胞ＭＭＰ．２ｍＲＮＡ表达的影响３图６：不同浓度药物血清对Ｐａｎｃ一１细胞ＭＭＰ一２ｍＲＮＡ表达的影响ｆ１、２、３为５、１０、２０％的空白血清，４、５、６为５、１０、２０％的Ｂ１１０咖．清，７、８、９为５、１０、２０％的Ｇ２１０血清，１０为Ｍａｒｋｅｒ）４讨论肿瘤的侵袭转移是恶性肿瘤最显著的生物学特征之一，也是临床肿瘤病人的主要死冈，故抑制肿瘤侵袭、转移为当今国际研究热点。肿瘤转移是指肿瘤细胞脱离原发生长部位，通过各种途径的转运，在机体内的远隔部位的器官／组织继续增殖生长，形成同样性质肿瘤（转移瘤）的过程。它是一个复杂的多步骤的连续过程，在此过程中瘤细胞要多次穿越基底膜侵入周围组织，因此对包括基底膜在内的细胞外基质（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕａｒｍａｔｒｉｘ，ＥＣＭ）的降解是肿瘤侵袭转移的关键步骤之～。ＥＣＭ主要由胶原、糖蛋白、蛋白多糖和氨基葡聚糖等组成。胶原是ＥＣＭ的主要成分，至少有１２种类型。Ｉ型、ＩＩ型和ＩＩＩ型胶原是结缔组织中的主要成分，Ｉｖ型胶原主要存在于基底膜。已有充分证据表明，肿瘤细胞的侵袭转移能力与其产生或诱导宿主细胞产生降解ＥＣＭ的蛋白酶的能力密切相关。各种ＥＣＭ成分的降解需要其特定的蛋白水解酶来完成，整个ＥＣＭ的降解需要多种基质水解酶的协同作用才能完成。正常情况１、‘＇蛋白水解酶和蛋白酶抑制剂往往是１刊时存在的，ＥＣＭ的降解程度最终取决于蛋白酶的活性以及与蛋向酶抑制剂二者之间的相互作用。与肿瘤细胞降解ＥＣＭ有关的蛋白水解酶可分为四大类：丝氨酸蛋白酶，金属蛋白酶，弹力蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。基质金属蛋白酶ｆｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，ＭＭＰｓ）是迄今为止发现的与肿瘤侵袭转移关系最为密切的一类蛋白水解酶…１。而其中又以明胶酶（即Ⅳ型胶原酶，包括ＭＭＰ一２和ＭＭＰ一９）尤为重要，因为【Ｖ型胶原酶不但可以降解细胞间基质成分，还能降解基底膜的主要成分Ⅳ型胶原Ｈ２。基质会属蛋白酶指一系列生理情况下可降解细胞外基质及基底膜的内肽酶总称［１２】。通常由纤维母细胞、中性粒细胞、巨噬细胞及肿瘤细胞产生。已发现ＭＭＰｓ家旅成员有２０余种。１３１，其均具有以下几个特点：①酶活性部位含有一个锌离子，去除锌离子会明显抑制酶的活性；②各种ＭＭＰｓ之间具有序列同源性；③均以无活性的酶原形式产生，经有限的蛋白水解而被激活：④可被特异的金属蛋白酶组织抑制因子（Ｔｉｓｓｕｅｉｎｌｎｉｂｉｔｏｒｓｏｆｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，ＴＩＭＰｓ）所抑制。ＭＭＰｓ按其作用底物刁ｉ同分为５种：胶原酶（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ，ＭＭＰ一１、８、１３）、明胶酶（ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ，ＭＭＰ．２、９）、间质溶解素（ｓｔｏｍｅｌｙｓｉｓ，ＭＭＰ－３、１１）、膜型基质蛋白酶（ｍｅｍｂｒａｎｅ—ｂｏｕｎｄｔｙｐｅ）及其他未分类的ＭＭＰｓ。在正常稳定状态组织中ＭＭＰｓ表达量极少，而在炎性细胞因了、激素、生长冈予刺激Ｆ和细胞转化过程中其表达量上升。此过程涉及人体多种生理及病理过程，如炎症、血管形成、肿瘤侵袭转移等。Ｈ前认为ＭＭＰｓ在肿瘤转移中的作用主要有以下几点。①降解细胞外基质。Ｌｉｏｔｔａ等㈣证实了肿痛转移与明胶酶降解基底膜之间的关系。Ｙａｍａｇａｔａ等【１５１６】分离并检测鼠结肠癌细胞株的明胶酶，以含明胶的聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测其明胶酶活性，发现高转移能力的ＬｕＭｌ、ＬｕＭ４细胞株产生大量的明胶酶；而低转移能力的ＮＭｌｌ和ＮＭｌ６细胞株则产生较少的明胶酶。Ｈｏｆｍａｎｎ等［１７】以８种不同转移能力的黑色素细胞株予裸鼠皮下注射，转移能力最强的ＭＶ３和ＢＬＭ细胞株ＭＭＰ－２表达最高，进一步证实了ＭＭＰ一２在肿瘤侵袭与转移中的重要作用。②调节肿瘤的发生与生长。近来，有报道表明高表达ＭＭＰ一３的转基因小鼠，乳腺癌形成率增加，可能与肿瘤演进过程中多阶段的改变有哭‘１８Ｊ。高表达ＭＭＰ，７的转基因小鼠在乳腺癌模型中肿瘤形成率增加。１９１。这些依赖于ＭＭＰｓ所引起的肿瘤起始和发生率增加均发生在肿瘤演进的早期，远在转移之前。这些结果均支持ＭＭＰｓ在肿瘤发生和生长中的作用。③在新生血管形成中的作用。新，ｌｉ血管形成包括毛细血管内皮层下基底膜降解、内皮细胞迁移和增殖、新生【ｆ【Ｌ管形成和新的基底膜形成等一系列过程。因为血管内皮细胞必须穿越基底膜才能形成新的血管，所以在血管生成过程中ＭＭＰｓ活性对内皮细胞的侵入是非常重要的。２０。。由于基底膜的主要成分是ｌｖ型胶原，故以ｉＶ型胶原为主要底物的明胶酶（ＭＭＰ－２．ＭＭＰ－９）对基底膜的降解与肿瘤侵袭转移的关系非常密切。④调节细胞粘附。基质余属蛋白酶的调控有ｉ种水平：①转录水平的调控；ＭＭＰｓ的表达受到生长因子、癌基因、细胞因子的调１，，如ＩＬ一２、Ｒａｓ可促进其表达，而ＴＧＦ一０、视黄酸则可使其表达下降。②分泌的酶原活化的调控；ＭＭＰｓ是以酶原形式分泌的，其活化则需由外源性水解酶切除氨基前肽。③ＴＩＭＰｓ对ＭＭＰｓ的拮抗作用。２１１。由于认识到ＭＭＰｓ在肿瘤侵袭、转移中的重要作用，ＭＭＰｓ（特别是ＭＭＰ．２）的表达和活性抑制剂的筛选和开发受到广泛的重视。ＴＩＭＰＳ是ＭＭＰｓ的天然抑制剂，其以１：１的非共价键形式与ＭＭＰｓ结合，并抑制其活性。尽管ＴＩＭＰｓ的体外研究已证实ＴＩＭＰｓ对于肿瘤侵袭有抑制作用，但由于其半衰期较短，不能用于｜Ｊ服，临床应用困难。故目前『Ｆ在寻找天然的基质金属蛋白酶抑制剂（ＭＭＰｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＭＭＰＩ），并人工合成了一系列的ＭＭＰｌ。如前言所述，ＭＭＰＩ的合成从大分子到小分子合成物有多种；从另一方面说，ＭＭＰＩ按其作用机制不同又可分为三类：一、与ＭＭＰｓ催化中心Ｚｎ２＋螫合而抑制其水解酶活性。这是目前绝大多数人工合成ＭＭＰｓ抑制剂的作用机制，其特点是：①为与ＭＭＰｓ类似的小分子物质；②均具有锌结合区；③体外发挥作用的有效浓度仅为ｎｍｏｌ／Ｌ水平。该类药物发展经历了三个阶段：早期为广谱的ＭＭＰｓ抑制剂，如口服生物利用度低的ｂａｔｉｍａｓｔａｔ（ＢＢ９４）；随后出现了ｕ服生物利用度好、便ｊ二长期服用的ｍａｒｉｍａｓｔａｔ（ＢＢ２５１６）；目前正在开发的为可选择抑制ＭＭＰｓ，特别是ＭＭＰ一２及ＭＭＰ一９的非肽类抑制荆，如ＡＧ３３４０、ＣＧＳ２７０２：３Ａ及ＢＡⅥ２－９５６６等。２２。。一、阻断ＭＭＰｓ酶原活化。ＭＭＰＳ以无活性的酶原形式分泌至细胞外，被多种蛋白酶和非蛋白酶水解剂切除Ｎ一末端区域活化后才能起作用，药物作用于此靶点可有效抑制ＭＭＰｓ的活化，进而抑制其降解ＥＣＭ的作用。三、其他。目前已经进入临床试验的ＭＭＰＩ有ＢＢ９４和ＢＢ２５１６等几种。ＢＢ９４是一种有效的广谱的ＭＭＰｓ抑制剂，也是最早合成并用于临床试验的ＭＭＰＩ，它是一种与作用底物肽链结构相似的异羟肟酸衍生物，半衰期９～１０小时，主要在肝脏代谢。但由于其口服牛物利用率低而不理想，主要局限于胸腔或腹部直接注射控制胸腔或腹腔积液。ＢＢ２５１６是与ＢＢ９４相类似的广谱的ＭＭＰｓ抑制剂，它也是一类异羟肟酸衍生物，其结构类似于间质组织胶原酶降解的胶原分子起始段，能可逆的结合ＭＭＰｓ含锌离子的活性区，从而抑制其活性‘２３Ｊ。Ｉ期临床试验结果显示ＢＢ２５１６口服吸收快，具有较高的生物利用度，清除半衰期８～１０小时，６０％经盯肋！代谢，４０％以原形经。肾脏排泄０２４１。１Ｉ期临床试验发现，ＢＢ２５１６对晚期胃癌和食管癌治疗７个月后，出现了肿瘤细胞的减少和基质组织的增生‘２５１，鉴于这一结果，其目前已进入ＩＩＩ期临床试验。但它也有一些副作用，如发热、恶心、呕吐等，较为明显的有骨髂肌的疼痛和乏力及严重的关节疼痛，而且这些症状具有剂量依赖性，发生机会和严重程度随剂量的增加而增加。Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ‘９．９６３等对１２例晚期胃癌患者治疗刁‘１个多月，就有６例出现了肩关节僵硬。目前国外对人工合成的ＭＭＰＩ已作了一些研究，个别药物正处于临床试验阶段。我们要想发挥自己的优势，就要根据自己的国情，从别的途径寻找天然的ＭＭＰＩ或合成一些新的ＭＭＰＩ。由于我国中草药资源丰富，并有了几千年的用药经验，目前应用于临床的中草药经过了历史的筛选和检验，临床应用有效且副作用较少。故我们设想从中草药中寻找天然的ＭＭＰＩ，这即符合我国圈情，还拥有了自己的知识产权。蛇毒的毒作用复杂，主要有神经毒、血循毒和肌肉毒等毒性。血循毒临床表现明显，局部症状以肿胀疼痛，出血、水疱和组织坏死为主；全身症状有发热、恶一Ｌ、呕吐、心悸和血便、』ｆ】ｌ尿及令身皮肤瘀点、瘀斑，甚至血压下降等。蛇毒中的蛋白水解酶破坏细胞问的綦质蛋白，损伤组织和血管壁以及蛇毒中的磷脂酶Ａ２使毛细血管内皮细胞肿胀溶解，基底膜中糖蛋白、纤维连接蛋白及其它基质成分分解，毛细血管壁通透性改变，导致组织水肿、出血和坏死，加速蛇毒吸收和向全身扩散【２７１。这种作用与临床上蛇毒的血循毒症状密切相关。蛇毒被誉Ｊ，ｊ自然界最集中的酶原之一，其中有功能独特的酶、毒性蛋白质和活性短肽等。目前已经从蛇毒中分离出至少１５０种蛋白水解酶，这些蛋白酶可分为丝氨酸蛋白酶和金属蛋Ａ酶。蛇毒中的金属蛋白酶可以通过干预血液凝聚、防Ｊ｝＿：血栓形成、降解基底膜或胞外基质部分而引起山【ｆｌＬ‘２８。。现已从同一种属的蛇毒中分离出１００多种金属蛋白酶，并已有２０种酶的序列已经测序，它们都含有ｚｎ“的序列。蛇毒金属蛋白酶最初以无活性的酶原７髟式存在于蛇的毒腺，并在ｔＦ序列处有一保守的巯基基团，通过结合而封闭了活性位点。从毒腺释放的酶原，被蛋白水解加工而去除了这一巯基基团，使其成为具有活性的酶ｍ’。Ｐｅｒｅｚ和Ｓａｎｃｈｅｚ“９晟近在总结天然蛋白酶抑制剂抗蛇毒引起出血的研究进展时指出，蛇毒中含有丰富的ＭＭＰｓ，以通过干预血液凝聚、防止血栓形成、降解基底膜或胞外基质部分而引起山；而蛇及某些温ｊｆ【：Ｌ动物的血清中有ＴＩＭＰｓ，具有抗出血作用。如从南美普通负鼠分离出的一类抗矛头蝮组份，它能抑制蛇毒的细胞外基质蛋白的水解，是一种蛇毒金属基质蛋白酶的抑制剂，其对抗矛头蝮蛇毒引起的出血的作用与此有关‘３０１。从这些动物的ｍ中提取ＴＩＭＰｓ，外用治疗毒蛇咬伤应有较好的疗效，但是因存在降解和吸收困难等问题，难以用于肿瘤治疗。Ｉ艋床上用中草药治疗蛇咬伤已有多年，具有肯定疗效，且无明显的副作用。故我们设想从抗蛇毒咬伤的本草中筛选天然的具有抗肿瘤侵袭转移的ＭＭＰｓ抑制剂，从而为肿瘤侵袭转移的治疗提供新的有效药物。目前这方面的工作国内外还没有报道。Ｐａｎｃ．１细胞是’‘株高转移的人胰腺痛细胞株，其能产生大量的基质金属蛋白酶，尤其是ＭＭＰ一２‘３ｐ。本实验采用『ｆ『Ｌ清药理学方法，即将两种常用的抗蛇毒咬伤的本草复方的粗提成分Ｂｌｌ０和Ｇ２１０，分别给大鼠灌胃，制备成药物血清，利用体外培养的高转移的胰腺癌Ｐａｎｃ一１细胞株，观察药物血清对细胞ＭＭＰ一２的产生和表达的抑制能力，初步筛选出具有抑制ＭＭＰｓ能力，具有抗肿瘤转移潜能的本草组分。衡量药物对肿瘤细胞产生明胶酶水平的影响，是评价该药物抗侵袭转移作用的一个重要方面。明胶酶谱法结果表明，与同浓度的空白血清相比，５％的Ｂ１１０和Ｇ２１０药物向清对Ｐａｎｅ一１细胞ＭＭＰ－２的分泌无明显影响；１０％和２０％的Ｂ１１０和Ｇ２１０药物血清抑制了Ｐａｎｃ一１细胞ＭＭＰ一２的分泌，且随着药物血清浓度的增高，其抑制作用增强，晕一定的浓度依赖性，Ｇ２１０的抑制作用相对更强。结果提示，在一定浓度范围内，此两种药物血清可抑制Ｐａｎｃ一１细胞ＭＭＰ一２蛋白的分泌。分析药物血清抑制ＭＭＰ一２分泌的原因有：①抑制了Ｐａｎｃ４细胞的增殖，肿瘤细胞数量减少，故分泌的ＭＭＰ一２的量也减少。②药物直接抑制了Ｐａｎｃ一１细胞ＭＭＰ－２的分泌。ＭＴＴ法结果表明，与ｌ司浓度的空白血清相比，５％、１０％浓度的Ｂ１１０和Ｇ２１０药物血清对Ｐａｎｃ一１细胞的增殖无抑制作用；浓度达到２０％时，出现了抑制作用。提示，Ｂ１１０和Ｇ２１０约物在达到一定浓度时具有抑制肿瘤细胞增殖的作用。由于其划细胞增殖的抑制率明显低于明胶酶谱法测得的其对ＭＭＰ一２产生的抑制率，从而验证了明胶酶谱的结果，即此两种药物即可抑制肿瘤细胞的增殖，又可抑制ＭＭＰ．２蛋白的分泌。我们用ＲＴ—ＰＣＲ法检测药物血清下预前后Ｐａｎｃ．１细胞ＭＭＰ．２ｍＲＮＡ的表达。实验巾采用大多数细胞高表达的ＧＡＰＤＨ基因作为内参照，以ＭＭＰ．２／ＧＡＰＤＨ的光密度比值半定＿阜＝检测ＭＭＰ一２基凶ｍＲＮＡ的表达水平。结果显示５％浓度的Ｂ１１０对细胞ＭＭＰ一２的表达无影响，１０％、２０％的Ｂ１１０和不同浓度的Ｇ２１０药物血清均下凋了ＭＭＰ一２ｍＲＮＡ的表达。提示在一定浓度范围内，Ｂ１１０和Ｇ２１０药物血清均可抑制ＭＭＰ一２ｍＲＮＡ的表达，且这种抑制作用呈浓度依赖性。药物血清对ＭＭＰ一２ｍＲＮＡ表达的抑制率明显高于对ＭＭＰ一２产生的抑制率，考虑可能与蛋白质的表达滞后于ｍＲＮＡ的表达有关。以上结果均提示：在一定浓度范围内，Ｂ１１０和Ｇ２１０药物血清能够抑制Ｐａｎｃ一１细胞ＭＭＰ一２的产生和表达，目．这种抑制作用呈现明显的浓度依赖性。由此可见，此两种药物血清具有抗肿瘤侵袭转移的能力，且随着其浓度的增加，抗侵袭转移能力逐渐增强。提示Ｂ１１０和Ｇ２１０药物具有作为抗肿瘤转移药物开发的潜力。闩前国内也肯中草药抗肿瘤侵袭转移报道。国内甄永苏教授对大黄素抑制人高转移肺癌ＰＧ细胞的肿瘤转移相关性质作了研究，发现用大黄素干预ＰＧ细胞，可使细胞对人工基底膜的侵袭能力下降，同时细胞ＭＭＰ一２和ＭＭＰ一９的分泌量也下降Ｌ７。。韩锐教授刈金养麦提取物的抗肿瘤转移作用进行Ｔ一些研究，发现金荞麦提取物明显抑制了Ｂ１６．ＢＬ６细胞对人工基底膜的侵袭，并能有效地抑制Ｂ１６一ＢＬ６黑色素瘤细胞在Ｃ５７／ＢＬ６小鼠体内的自发性肺转移；该提耿物同时还能抑制ＨＴ一１０８０细胞ＭＭＰ一２和ＭＭＰ。９的产生【８】。但是他们用大黄素单体和会荞麦提取物直接作用于体外培养的肿瘤细胞，具有一些不足之处。因为中草药所含的化学成分复杂，其单体溶解性也较差，需用二甲亚砜作为溶剂，而二甲亚砜本身就有细胞毒性，可影响体外培养的细胞的生长。用中药的粗提取物直接干预体外培养的细胞，进行体外实验所取得的实验结果，在许多情况下不但不能与体内实验结果相吻合，而日更不能被临床应用所证实，以致假阳性假阴性结果不断出现。而我们把药物的粗体成分给大鼠灌胃后，制备含有药物成分的咖清来代替中药粗提取物进行体外实验，存某种程度卜可排除上述干扰，使结果的可信度火大提高。因为这种血清所含有的药物成分是经过体内，＋系列生物转化后真正发挥作用的有效成分，同时也包括那些在药物作用下机体所产生的内生性有效成分；另外，血清的理化性质与细胞所处的内环境基本相同，也就克服了中药本身的理化性质对实验结果的影响，在理论上更具有科学的理论依据。实验结果，由于客观的模拟了药物与机体的相互作用过程，就更具有确定性、真实性和鲜明的说服力。３２‘３３’。我们的实验结果表明：Ｂ１１０和Ｇ２１０药物血清均能抑制Ｐａｎｃ．１细胞ＭＭＰ一２的产生和表达，且随着药物浓度的增加，其抑制作用逐渐增强。故Ｂ１１０和Ｇ２１０药物具有作为抗肿瘤转移药物开发的潜力。临床肿瘤病人在就诊时约有６０％已有了肿瘤的转移，侵袭转移是其治疗失败的主要原因，故急需用药控制肿瘤细胞的侵袭及转移播散，延缓肿瘤进展，延长患者ｑｊ命。抗蛇毒的中草药在临床上是常用的中草药，应用已有多年，没有明显毒副作用，口服用药方便，还能长期服用。用抗蛇毒的中草药治疗肿瘤的侵袭转移，目前国内外均未见报道，我们的工作处于困内外领先阶段。假如我们的药物具有抗肿瘤转移的能力，很可能其他的抗蛇毒的中草药也具有抗肿瘤转移的潜能，这样就可为肿瘤转移的药物治疗开辟一个新的领域。为此，本课题值得进一步的深入研究。在今后的工作中，我们可以进行一系列的体外试验进一步证实药物对肿瘤细胞侵袭转移能力的抑制作用。如可用ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｆ进一步证实药物血清对ＭＭＰ一２产生的抑制作用：用重组基底膜侵袭实验观察药物对Ｐａｎｃ一１细胞侵袭能力的影响：扩大瘤谱，观察药物对其他高转移癌细胞株的肿瘤转移相关性质的抑制作用；还可进行体内实验观察药物对肿瘤侵袭转移的抑制作用并进入临床试验。我们最后还可进行拆方，从复方到单方，筛选出最有效的单方和最佳组合的复方。总之，出于目前肿瘤是危及人类健康和生命的第二大类疾病，发病率较高，侵袭转移足其治疗失败的主要原凶，故寻找具有抑制肿瘤侵袭转移能力的药物具有广阔的应＿｝＝｝ｊ前景和社会经济效益。结论１、在一定浓度范围内，Ｂ１１０药物血清可抑制Ｐａｎｃ一１细胞ＭＭＰ一２的分泌和表达，并呈一定的浓度依赖性。在达到一定浓度时，还可抑制Ｐａｎｃ一１细胞的增殖２、在一定浓度范围内，Ｇ２１０药物血清可抑制Ｐａｎｃ一１细胞ＭＭＰ－２的分泌和表达，并呈一定的浓度依赖性。在达到一定浓度时，还可抑制Ｐａｎｃ一１细胞的增殖３、实验结果提示Ｂ１１０和Ｇ２１０药物能抑制肿瘤的侵袭转移，具有作为抗肿瘤转移药物开发的潜力。参考文献１２张遁蘅主编．Ａｚｎａｖｏｏｒｉａｎ医学分子生物学【Ｍ】．北京医科大学出版利‘，１９９９：８７４Ｓ，ＭｕｒｐｈｙＡＮ，Ｓｔｅｔｌｅｒ—ＳｔｅｖｅｎｓｏｎＷＧ，ｅｔａ１．ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｓｐｅｃｔｓｏｆｔｕｌｎｏｒｃｅｌｌｉｎｖａｓｉｏｎａｎｄｍｅｔａｓｔａｓｉｓⅡ】Ｃａｎｃｅｒ，１９９３，７１：１３６８—１３８３，３ＨｕｍｐｈｒｉｅｓＭＪ，ＯｌｄｅｎＫ，ＹａｍａｄａＫＭ．ＡｓｙｎｔｈｅｔｉｃｐｅｐｔｉｄｅｆｒｏｍｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎｉｎｈｉｂｉｔｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｍｅｔａｓｔａｓｉｓｏｆｍｕｒｉｎｅｍｅｌａｎｏｍａｃｅｌｌｓＵ】Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８６，２３３ｔ（４７６２）：４６７—４７０，４ＳｃｈｕｌｔｚＲＭ，ＳｉｌｂｅｒｍａｎＳ，ＰｅｒｓｋｙＢ，ｅｔａ１．ｔｉｓｓｕｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｂｙｈｕｍａｎｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｍｅｔａＩｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓｏｆｈｕｍａｎａｍｎｉｏｎｉｎｖａｓｉｏｎａｎｄｔｕｎｇｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎｂｙｍｕｒｉｎｅＢ１６一Ｆ１０ｍｅｌａｎｏｍａｃｅｌｌｓ【Ｉ】．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ，１９８８，４８０９）５５３９—５５４５．５ＩｍｒｅｎＳ，ＫｏｈｎＤＢ，ＳｈｉｍａｄａＨ，ｅｔａ１．ＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｇｒｏｗｔｈａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎｔｉｓｓｕｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆｍｅｔａｌｌｏＤｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ一２ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ—ｍｅｄｉａｔｅｄｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｒｉｎｖｉｖｏｉｎｈｉｂｉｔｓｔｕｍｏｒ６ＴａｎｚａｗａＫ，ＩｓｈｉｉＵ１。ＣａｎｃｅｒＲｅｓ，１９９６，５６（１３）：２８９１—２８９５．Ｍ，ＯｇｉｔａＴ，ｅｔａ１．Ｍａｔｌｙｓｔａｔｉｎｓ，ｎｅｗｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｆｔｙｐｅＩＶｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅｓｆｒｏｍＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ７ａｔｒａｍｅｎｔａｒｉａ．Ｉｔ，ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｉｅｓＵＪ，Ａｎｔｉｂｉｏｔ（Ｔｏｋｙｏ），１９９２，４５（１１）：１７３３—１７３７．大黄素抑制人高转移巨细胞肺癌ＰＧ细胞的肿瘤转移相关性质Ｕ】王心华，甄永苏痛症，２００１，２０ｆ８）：７８９—７９３．刘红岩，韩锐．金荞麦提取物抑制肿瘤细胞侵袭、转移和ＨＴ一１０８０产生Ｉｖ型胶原酶８的研究Ｕ】．药理学通报，１９９８，１４（１）：３６—３９９ＰｅｒｅｚｌＣ，ＳａｎｃｈｅｚＥＥＮａｔｕｒａｌｐｒｏｔｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｔｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｎｓｉｎｓｎａｋｅｕｓｅｍｍｅｄｉｃｉｎｅＵＩ，Ｔｏｘｉｃｏｎ，１９９９，３７（５）：７０３—７２８１０ＭｃＫｅｎｎａＯＪ，ＣｈｅｎＹ，ＳｍｉｔｈＲＭ，ｅｔａ１．Ａｒｏｌｅｆｏｒｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓａｎｄｔｕｍｏｒｈｏｓｔｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｉｎｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕ］ａｒｃａｒｃｉｎｏｍａｓＵ】．ＡｍＪＳｕｒｇ，２００２，１８３（５）：ＶｅＤ０１ＴＬＳａｎｄｔｈｅｉｒｐｏｔｅｎｔｉａｌ５８８—５９４．１１ＫａｎｅｔｏＨ，ＭｏｒｒｉｓｓｅｙＩ，ＫｔａｈｒＳ．ＩｎｃｒｅａｓｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴＧＦ—ｂｅｔａ１ｍＲＮＡｉｎｔｈｅｏｂｓｔｒｕｃｔｅｄｋｉｄｎｅｙｏｆｒａｔｓｗｉｔｈｕｎｉｌａｔｅｒａｌｕｒｅｔｅｒａＩｌｉｇａｔｉｏｎＩＪ］ＫｉｄｎｅｙＩｎｔ，１９９３，４４ｆ２）：３１３－３２１．１２１３ＷＧ，ＢｏｄｄｅｎＭＫ，ｅｔａ１．Ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ：ａｒｅｖｉｅｗ１１１．ＣｒｉｔＲｅｖＯｒａｌＢｉ０１Ｍｅｄ，１９９３，４：】９７—２５０．Ｓｔｅｔｌｅｒ—ＳｔｅｖｅｎｓｏｎＷＧ．Ｔｈｅｒｏｌｅｏｆｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓｉｎｔｕｍｏｒｉｎｖａｓｉｏｎ，Ｂｒｉｋｅｄａｌ—ＨａｎｓｅｎＨ，Ｍｏｏｒｅｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，ａｎｄａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓＵ】．ＳｕｒｇＯｎｃｏｌＣｌｉｎＮｏｒｔｈＡｍ，２００１，１０：３８３—３９２．１４ＬｉｏｔｔａＬ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆａｐｒｏｔｅｉｎｔｈａｔｓｔｉｍｕｌａｔｅｓｂｌｏｏｄｖｅｓｓｅｌｇｒｏｗｔｈ０１Ｎａｔｕｒｅ，１９８５，３１８（６０４１１：１４１５Ｋｉｓｈｉｆ，ＴａｎａｋａＲ，ＫｏｉｗａｉＯ，ｅｔａ１．ＧｅＩａｔｉｎａｓｅｓａｎｄｍｅｔａＩＩｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｅｃｒｅｔｅｄｂｙｍｕｒｉｎｅｃｏｌｏｎｉｃｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｓｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｉｎｇｍｅｔａｓｔａｔｉｃｐｏｔｅｎｔｉａｌＣｅｌｌＢｉｏｌＩｎｔ，１９９４，１８（３１：１６５．７０．１６ＨｙｕｇａＳ，ＮｉｓｈｉｋａｗａＹ，ＳａｋａｔａＫ，ｅｔａｌｏｆＡｕｔｏｃｒｉｎｅｆａｃｔｏｒｅｎｈａｎｃｉｎｇｔｈｅｓｅｃｒｅｔｉｏｎＵ】．ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ９）ｉｎｓｅｒｕｍ—ｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｗｉｔｈｍｕｒｉｎｅｍｅｔａｓｔａｔｉｃｃｏｌｏｎｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｓＩＪ】Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ，Ｍ｛ｒ）９５，０００ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ（ｍａｔｒｉｘ１９９４，５４（１３）：３６１１—３６１６．１７ＨｏｆｍａｎｎＵＢ，ＷｅｓｔｐｈａｌＪＲ，Ｖａｎｗｉｔｈａｌｐｈａ（ｖ）ｂｅｔａ（３）ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓＫｒａａｔｓＡＡ，ｅｔａ１．ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｉｎｔｅｇｒｉｎｍｅｍｂｒａｎｅ—ｔｙｐｅｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏ｛ｅｉｎａｓｅ一１ｆＭＴｌ一ＭＭＰ）ａｎｄｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－２（ＭＭＰ－２）ｉｎｈｕｍａｎｍｅｌａｎｏｍａｃｅｉｌｓｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｉｎｖｉｖｏＵ】ＩｎｔＪＣａｎｃｅｒ，２０００，８７（１）：１２—１９．１８ＳｔｅｒｎｌｉｃｈｔＭＤ，ＬｏｃｈｔｅｒＡ，ＳｙｍｐｓｏｎｃＪ．ＴｈｅｓｔｒｏｍａｌｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＭＭＰ１９２０３／ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎｐｒｏｍｏｔｅｓｍａｍｍａｒｙｃａｒｃｉｎｏｇｅｓｉｓＵ】，Ｃｅｌｌ，１９９９，９８（２）：１３７—１４６．ＭｕｌｌｅｒｗＪＴｈｅｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｍａｔｒｉｌｙｓｉｎｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓｅａｒｌｙ—ｓｔａｇｅＣａｎｃｅｒＲｅｓ，１９９８，５８（２３）：５５００—５５０６．ｍａｍｍａｒｙｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓＩＪｌＭａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｉｎａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ：ａｍｏｖｉｎｇＳｔｅｔｌｅｒ—ＳｔｅｖｅｎｓｏｎＷＧ．２１Ｕ】．ＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ，１９９９，１０３（９）：１２３７—１２４１ＶｉｎｃｅｎｔｉＭＰ，Ｔｈｅｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ＭＭＰ）ａｎｄｔｉｓｓｕｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆｍｅｔａⅡｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ＴＩＭＰ）ｇｅｎｅ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌａｎｄｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｅｔｉｏｎａｎｄｃｅｌｌ—ｔｙｐｅ—ｓｐｅｃｉｆｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎⅡ】．ＭｅｔｈｏｄｓｔａｒｇｅｒｆｏｒｔｈｅｔａｐｅｕｔｉｃｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎＭｏｌＢｉｏｌ，２００１，１５１：１２１—１４８．Ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｍ．ＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒＲｅｓＴｒｅａｔ，１９９８，５２（１—３）：１２５—１３６，２３ＳｔｅｗａｒｄＷＰＭａｒｉｍａｓｔａｔ（ＢＢ２５１６）：Ｃｕｒｒｅｎｔｓｔａｔｕｓｏｆｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ『ＩＩ．ＣａｎｃｅｒＣｈｅｍｏｔｈｅｒＰｈａｒｍａｃｏｌ，１９９９，４３（Ｓｕｐｐｌ）：￥５６—６０．２２ＢｒｏｗｎＰＤ２４ＲｏｓｅｍｕｒｇｙＡ，ＨａｒｒｉｓＪ，ＬａｎｇｌｅｂｅｎＡ，ｅｔａ１．Ｍａｒｉｍａｓｔａｔｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈａｄｖａｎｃｅｄｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｎｃｅｒ：ａｄｏｓｅ—ｆｉｎｄｉｎｇｓｔｕｄｙＩＪｌ．ＡｍＪＣｌｉｎＯｎｃｏｌ，１９９９，２２（３）：２４７—２５２２５ＴｉｅｍｅｙＧＭ，ＧｒｉｆｆｉｈＮＲ，ＳｔｕａｒｔＲＣ，ｅｔａ１．Ａｐｉｌｏｔｓｔｕｄｙｏｆｔｈｅｓａｆｔｙａｎｄｅｆｆｅｃｔｓｃａｎｃｅｒｏｆｔｈｅｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｍａｒｉｍａｓｔａｔｉｎｇａｓｔｒｉｃ２６Ｕ】，ＥｕｒＪＣａｎｃｅｒ，１９９９，３５（４）：５６３—５６８．Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ１ｗ，ＴｉｅｍｅｙＧＭ，ＰａｒｓｏｎｓｈｏｕｌｄｅｒｉｎｄｕｃｅｄｂｙｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈＳＬ，ｅｔａ１．Ｄｕｐｕｙｔｒｅｎ＇ｓｄｉｓｅａｓｅａｎｄｆｒｏｚｅｎａｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｍｌＢｏｎｅＩｏｉｎｔＳｕｒｇＢｒ，１９９８，８０ｆ５１：９０７－９０８．２７陈灏珠主编。实用内科学［Ｍ】２８１ｗａｎａｇａ＆Ｔａｋｅｙａ人民卫生出版社，７９１—７９４ＳｔｒｕｃｔｕｒｅＨ．ａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｓｎａｋｅｖｅｎｏｍｉｎｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｆａｍｉｌＹ［Ｍ１，ＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅＩｎ：ＩｍａｎｈｏｒｉＫ，ＳａｋｉｙａｍａＦ．ＭｅｔｈｏｄｓＡｎａｌｙｓｉｓ，ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９３，１０７．１１５．２９刘智慧．蛇毒中的基质金属蛋白酶Ｕ】．蛇志，２００１，１３（２）：５９－－６１．３０Ｎｅｖｅｓ—ＦｅｒｒｅｉｒａＡＧＣ，Ｐｅｒａｌｅｓｌ，ＯｖａｄｉａＭ，ｅｔａ１．ＩｎｈｉｂｉｔｏｒｙｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｔｈｅｃｏｍｐｌｅｘｆｒｏｍｔｈｅＳｏｕｔｈＡｍｅｒｉｃａｎｍａｒｓｕｐｉａｌｉｓ）ｓｅｒｕｍＥ１］．Ｔｏｘｉｃｏｎ，１９９７，３５：８４９—８６３ａｎｔｉｂｏｔｈｒｏｐｉｃ３１ＺｅｒｖｏｓＥＥ，ＳｈａｆｉｉＡＥ，ＨａｑｏｐｏｓｓｕｍｆＤｉｄｅｌｐｈｉｓＭ，ｅｔａ１．ＭａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓＭＭＰ－２ａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＰＡＮＣ一１ｃｅｌｌｓｉｎｖｉｔｒｏＥｌｉ，ＪＳｕｒｇＲｅｓ，１９９９，８４（２１：１６２—１６７．３２崔晓兰，贺玉琢，高英杰，等中国中药药理研究的新思路．中药血清药理学Ⅱ１中医药利技，１９９７，４ｆ４）：２３９３３张群豪，陈旧。冀血清药理学在中药及复方中的应用评价ＩＪ］．中国中西医结合杂志，１９９６，１６ｆ３１：１３１．２１致谢三年的时间匆匆飞逝，我要向所有帮助、关心和支持我，陪伴我顺利走过这三年艰辛历程的师长、朋友和家人，表达我最诚挚的谢意！首先我要感谢我的导师姜藻老师，从课题的选题、设计、实验、统计、直至论文的撰丐，无不倾注了导师的心血。导师在繁重的医疗和教学工作中抽出宝贵的时间刺实验予以指导和帮助，为实验的ｊｌ骄ｌｊ完成提供了有力的保障，其严谨求实的作风、不懈的探索精神和崇高的敬业精神给我留下了极深的印象，这将使我终生受益。同时，我还要感谢我的另‘位导师陈宝安教授，二年来，他始终关心着我的工作、学习和生活。特别感洲他对我的无私的帮助和不厌倦的指导。我还要特别感谢病理教研室的陈平圣老师，从课题的选题、设训，直至实验的进行、论文的撰写，陈老师都给于我大量的无私的帮助和支持。感谢中大医院血液肿瘤科孙耘玉老师、高冲和金宝翠主任和张琳、顾晓怡医师及所有医疗组及护理部的老师们所给予的指导和帮助。在实验过程中，临床医学院中心实验室宋平老师、高峰老师、病理教研象的张爱风老师给予我大量的帮助和指导，刘松桥、刘宏、王兆红、王海军、杨玉华、文玉杰、王惠、孙静、邹春芳等同学以及我的师兄张苏江、师姐周云和师妹胡洁给予了大量的的无私帮助，在此对他们表示真诚的感谢。感谢研究牛部王７０７＂Ｊ老师、年级办唐天奎老师及临床医学院、设备科、以及图书馆的老师的帮助！感谢多年来一直灭心和帮助我的老师和同学们！最后，感谢我的家人多年来对我的期望和支持！作者简介作者简介丁丽，女，２８岁，汀苏半县人。１９９２年就读于南京铁道医学院临床医学系，１９９７年毕ｊ№分配至徐州铁路医院内科１作，作为住院医师，先后在呼吸、消化、心血管和神经等内科轮转。２０００年又回到母校攻读内科学血液肿瘤专业硕士学位，师从于东南大学附属中大医院肿瘤科姜藻副教授和血液科陈宝安教授。在校期间学习较为刻苦，通过了江另、省硕士英语学位考试利大学英语六级统考，共修课程２２门课程，应修学分３２分，实修学分４５；５分，规格化平均成绩８４分。研究生期间通过对科研方法论、医学统计学、高级生化与肿瘤的细胞和分子生物学等课程的学习，具备了一定的科研思维能力和实验能力。通过在肿瘤科和血液科的九个月的临床实践，对血液肿瘤科疾病的诊治和发展有了一定的认识。综述性文献《生长抑素类似物基因治疗恶性肿瘤展望》已在《国外医学・肿瘤学分册》２００２年第４期发表。课题研究方向为“基质金属蛋白酶抑制剂的筛选及抗肿瘤侵袭转移的研究”，现已经完成了部分实验工作。该实验采用【１Ⅱ清药理学方法，把抗蛇毒中药的两种复方备勺粗提本草成分Ｂ１１０、Ｇ２１０分别给大鼠灌胃，带６备药物血清，用不同浓度的药物血清对培养的高转移胰腺癌细胞株Ｐａｎｃ．１干预，采用明胶酶谱法和ＲＴ—ＰＣＲ法检测药物血清对Ｐａｎｃ一１细胞ＭＭＰ．２的分泌和表达的影响，得出Ｂ１１０和Ｇ２１０可抑制ＭＭＰ一２的分泌和表达，具有作为抗肿瘤转移药物开发的潜力的结论，为今后的进一步Ｌ作打下了基础。发表综述生长抑紊类似物基因治疗恶性肿瘤展望．２７２～２７４国外医学肿瘤学分册．２００２，２９（４）基质金属蛋白酶抑制剂的筛选及抗肿瘤转移的研究

作者：

学位授予单位：

丁丽东南大学

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