BRAFVE1抗体在结直肠癌中检测BRAFV600E突变的应用

临床与实验病理学杂志Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｅｘｐ　Ｐａｔｈｏｌ　２０１６　Ｄｅｃ；３２（１２）　・１３８３・　网络出版时间：２０１６—１２—２２　０８：５３　网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅＬ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉＬ／３４．１０７３．Ｒ．２０１６１２２２．０８５３．０１６．ｈｔｍｌ　・短篇论著・　ＢＲＡＦ　ＶＥ１抗体在结直肠癌中检测ＢＲＡＦ　Ｖ６００Ｅ突变的应用　时姗姗，王摘要：目的璇，夏秋媛，陆珍凤，叶胜兵，杨万瑞，马恒辉，饶使用ＢＲＡＦ　ＶＥ１抗体免疫组化法检测结直肠癌　秋，周晓军　自动免疫组化法。免疫组化判读标准如下：在高倍镜（×　样本中ＢＲＡＦ　Ｖ６００Ｅ位点突变，并分析其敏感性和特异性。　４００）下随机选取ｌ０个代表性视野，计算细胞阳性率（阳性瘤　方法采用ＡＲＭＳ法和免疫组化法检测３６例结直肠癌组织　中ＢＲＡＦ　Ｖ６００Ｅ突变状态，并使用测序验证。结果免疫组　化法检测结直肠癌样本中ＢＲＡＦ　ＶＥ１抗体的敏感性为　１００％，特异性为６２．９％。与甲状腺样本ＢＲＡＦ　Ｖ６００Ｅ突变　相比，结直肠癌标本为细胞质着色，染色呈棕黄色。结论　免疫组化法可高效、快速、低成本初步筛选结直肠癌的　ＢＲＡＦ　Ｖ６００Ｅ突变，但需分子检测进一步确认。　关键词：结直肠肿瘤；ＢＲＡＦ　Ｖ６００Ｅ；突变检测；靶向治疗；免　疫组织化学　中图分类号：Ｒ　７３５．３　文献标志码：Ａ　文章编号：１００１—７３９９（２０１６）１２—１３８３—０３　ｄｏｉ：１０．１３３１５／ｊ．ｃｎｋｉ．ｃｊｃｅｐ．２０１６．１２．０１６　ＢＲＡＦ是ＲＡＳ／ＲＡＦ家族成员。其编码丝氨酸一苏氨酸　蛋白激酶，可以作为ＲＡＳ下游效用因子。ＢＲＡＦ　Ｖ６００Ｅ突变　可以发生不依赖ＲＡＳ作用的磷酸化，从而持续激活下游　ＭＥＫ／ＥＲＫ信号通路，促进细胞的增殖及肿瘤的形成。有研　究表明在结直肠癌中ＢＲＡＦ突变与预后相关　，同时也是预　测靶向治疗疗效的标志物　。结直肠癌ＢＲＡＦ突变准确和　快速的检测，对患者的诊断及治疗很有必要性。本组实验用　ＢＲＡＦ　ＶＥ１抗体免疫组化法检测结直肠癌中ＢＲＡＦ　Ｖ６００Ｅ　位点突变的敏感性和特异性。　１材料与方法　１．１材料收集南京军区南京总医院病理科２０１４～２０１５　年接受手术治疗的３６例原发性结直肠癌标本。男性２３例，　女性１３例，年龄３４—８４岁，平均６１．４岁。入选标准：所有　患者手术前均未行内、外放疗；标本均经常规病理诊断确诊，　且确定其基因表型。　１．２免疫组化标本经１０％中性福尔马林固定，常规脱　水，石蜡包埋，３　ｔｘｍ厚切片，常规ＨＥ染色，光镜观察。免疫　组化ＢＲＡＦ　Ｖ６００Ｅ（克隆号ＶＥ１，Ｒｏｃｈｅ公司）采用Ｒｏｃｈｅ全　收稿日期：２０１６—０６—０４　基金项目：国家自然基金面上项目（８１３７２７４３、８１４７２３９１）、南京军区　南京总医院院管课题（２０１６０５３）　作者单位：南方医科大学南京临床医学院／南京军区南京总医院病理　科，南京２１０００２　作者简介：时姗姗，女，硕士，主管技师。Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｖｄｏｕ２０００＠ｈｏｔｍｍ１．　细胞数／总瘤细胞数）×１００％。阳性细胞数占０～５％为阴　性（一），６％～１０％为灶状阳性（＋），１１％～５０％为中度阳　性（＋＋），５１％一１００％为弥漫强阳性（卅）。　１．３　ＤＮＡ提取石蜡包埋标本８　ｐＬｍ厚切片４张，同时完　成１张常规ＨＥ染色切片，并由病理科医师鉴定肿瘤细胞的　存在。ＤＮＡ抽提采用ＱＩＡａｍｐ　ＤＮＡ　ＦＦＰＥ试剂盒，根据说明　书提取基因组ＤＮＡ。洗脱后的ＤＮＡ经Ｎａｎｏ—Ｄｒｏｐ核酸蛋白　测定仪检测其浓度及纯度。　１．４　ＡＲＭＳ法检测ＢＲＡＦ　Ｖ６００Ｅ基因突变加入ＤＮＡ模　板的量及反应条件均按ＡＤｘ—ＢＲＡＦ突变检测试剂盒说明书　要求，最终反应结果以按其提供的判读标准确定标本ＢＲＡＦ　基因突变状态（阳性并用Ｓａｎｇｅｒ测序法进行验证）。　１．５测序检测ＰＣＲ扩增引物自行根据Ｐｒｉｍｅｒ　５．０软件设　计，弓Ｉ物序歹Ｕ　ＢＲＡＦ—Ｅｌ５　Ｆ：５　－ｃ　ＩＴＩ１ｃＡＴＡＡＴＧｃ　ＩＴＧｃＴｃＴＧ一３　，　Ｒ：５　一ＧＴＡＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＴＣＴＣＡＧ－３　；Ｋ—ＲＡＳ—Ｅ２　Ｆ：５　一ＣＴＧ—　ＧＴＧＧＡＧＴＡＴＦｒＧＡＴＡＧＴＧＴ一３　。Ｒ：５　－ＧＴＡ　ｒＣＡＡＡＧＡＡＴＧＧＴＣ—　ＣＴＧＣ－－３。反应体系包括：０．２５　Ｔａｋａｒａ　Ｅｘ　Ｔａｑ　ＨＳ液，５　ｌ　１０　ＸＴａｑ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ２　Ｐｌｕｓ），４　１　ｄＮＴＰ（均购自日本Ｔａｋａｒａ　公司），引物浓度为２０　ｉｘｍｏＬ／Ｌ，ｃＤＮＡ模版为１００　ｎｇ，无菌去　离子水加至５Ｏ　。ＰＣＲ扩增条件为９４℃变性３　ｍｉｎ后，　９４℃３０　ｓ、６０℃３０　Ｓ、７２　ｏＣ　１　ｍｉｎ，共３５次循环，最后７２℃　延伸５　ｍｉｎ。ＰＣＲ产物用３％琼脂糖，电压１００　Ｖ，电泳，溴化　乙啶染色后于紫外光下观察结果，并送测序。　２结果　２．１　两种方法检测ＢＲＡＦ敏感性的比较３６例结直肠癌　标本中，ＡＲＭＳ法检测到ＢＲＡＦ基因突变１４例，阳性率为　３８．９％，１４例突变均发生第１５外显子１７９９位点突变，即Ｔ　—Ａ，可导致蛋白质产物中第６００位的缬氨酸（Ｖ）被谷氨酸　（Ｅ）代替（Ｖ６００Ｅ），并用Ｓａｎｇｅｒ测序法进行验证。结直肠癌　中免疫组化法及ＡＲＭＳ法的灵敏度均为１００％（１４／１４），两　种检测方法的特异度分别为６２．９％及１００％，后者显著高于　前者。两种检测方法结果不一致者１３例（表１）。　２．２免疫表型与甲状腺样本相比，ＢＲＡＦ　Ｖ６００Ｅ突变结直肠　癌标本为细胞质着色，染色呈棕黄色，大部分ＢＲＡＦ　Ｖ６００Ｅ蛋白　表达一致性，２例样本中肿瘤细胞ＶＥ１染色呈局部的细胞质　阳性（图１）。实验结果亦发现，部分Ｋ—ＲＡＳ突变的结直肠癌　样本中，细胞质着色呈浅黄色，３例ＢＲＡＦ　Ｖ６００Ｅ、Ｋ—ＲＡＳ野生　型样本中存在上皮细胞及平滑肌细胞非特异染色（图１）。　・１３８４・　临床与实验病理学杂志Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｅｘｐ　Ｐａｔｈ，ｏｌ　２０１６　Ｄｅ（・；３２（１２）　图１　Ａ．ＢＲＡＦ强辟ｌ　；Ｂ．ＢＲＡＦ局部四１性；Ｃ．ＢＲＡＦ非特异５ｆＩ悱。ｓＰ法　表ｌ　结直肠癌ＢＲＡＦ　Ｖ６００Ｅ突变基因检测与　细胞无阳性染色。延长免疫组化修复及孵育时间后，结直肠　免疫组化检测结果比较　癌标本ＢＲＡＦ　Ｖ６００Ｅ突变细胞为细胞质着色，染色呈棕黄　色。仅２例样本中，肿瘤细胞ＶＥＩ染色呈局部阳性　．推测　是由于肿瘤的异质性，样本同时包含ＢＲＡＦ野生型及突变型　的肿瘤细胞，这需要显微切割进行证实。除此以外，本组实　验亦发现其中３例Ｋ－ＲＡＳ突变的结直肠癌样本中出现细胞　质染色呈ｒ｛Ｊ等或局部强阳性，文献未明确解释假阳性现　象　’　，推测由于Ｋ—ＡＲＳ突变造成持续激活下游ＭＥＫ／　３讨论　ＥＲＫ信号通路的影响　，与文献报道类似，在少量ＢＲＡＦ、Ｋ—　ＲＡＳ野生型的样本中存在上皮细胞及平滑肌细胞的非特异　染色，推测可能与其他表值发生交叉反直造成　。　有实验报道结直肠癌中ＢＲＡＦ的突变率为５％～１５％，　约９０％以上为Ｖ６００Ｅ突变　。ＣＲＣｓ主要通过两条信号通　路进展，染色体小稳定性或微　星不稳定性（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ　ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ＭＳＩ）．ＢＲＡＦ　Ｖ６００Ｅ突变与散发性ＭＳＩ　肿瘤相　关　，其检测可以用于区分散发性ＭＳ！ＣＲＣｓ及Ｉ．ｙｎｃｈ综合　与基因检测相比，在结直肠癌福尔马林固定石蜡包埋样　本中，ＶＥＩ抗体检测结直肠癌中ＢＲＡＦ’Ｖ６００Ｅ突变的敏感性　高，对组织量需求低，但特异性有所欠缺，可以采用不同的判　读标准进行改进。但相对于传统突变检测方法，免疫组化仍　症　。作为ＥＧＦＲ下游，研究发现在ＣＲＣｓ巾ＢＲＡＦ　Ｖ６００Ｅ　突变患者对靶　药物西妥昔单抗耐药　，且其与预后相　关　。　是～种快速、有效、低价的检测方法，住不具备分子检测的临　床病理科室仍具有广阔的临床应用前景。　参考文献：　［１　１　ＳｏｕｇｌａｋＯＳ　Ｊ，Ｐｈｉｌｉｐｓ　Ｊ，Ｗａｎｇ　Ｒ，ｅｔ　ａ１．Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ　ａｎｄ　ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ　ｖａｌｕｅ　ｏｆ　ｃｏｍｍｏｎ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｆｉ，ｒ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ａｎｄ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｉｎ　目前检测ＢＲＡＦ基因突变的最常用的是分子生物学技　术、Ｓａｎｇｅｒ测序法、ＡＲＭＳ及ＲＴ—ＰＣＲ等，每种方法均具有不　同的敏感性、特异性及成本　分子检测需要专门的实验　室、专业仪器及人员并需要严格的质量控制。而免疫组化技　术具有快速、敏感、低价的优势，目前已经广泛用于常规病理　诊断　　、ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ　ｃｏｌｏｒ．ｅｔａ１　ｃａＢ（ｗｆ　Ｊ］．Ｂｒ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ，２００９，　１Ｏ１（３）：４６５—７２．　随着商品化ＢＲＡＦ基因突变特异性抗体ＶＥＩ的应用，　［２　Ｊ　Ｍａｕｇｈａｎ　Ｔ　Ｓ，Ａｄａｍｓ　Ｒ　Ａ，Ｓｍｉｔｈ　Ｃ（　，ｅｔ　ａ１．Ａｄｄｉｔｉｏｎ　ｏｆ【・ｅｔｕｘ－　ｉｍａｂ　ｔｏ　ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ－ｂａｓｅｄ　ｆｌｉｎｔ・・ｌｉｎｅ　ｃｏｍｂｈｍｔｉｏｎ　ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　ｆｏｒ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｄｖａｎｃｅ（１　ｃｏ｜ｏｒｅｃｔａｌ　ｃａｎｃｅｒ：ｒｅｓｕｌｔ；ｏｆ！．　ｔｈｅ　ｒａｎｄｏｍｉｓｅｔｉ　不仅可以提供快速的检测结果，便于ＢＲＡＦ基因突变检测在　大部分临床病理科开展，以满足临床工作的需求。大量研究　证实ＶＥＩ抗体　甲状腺乳头状癌　、黑色素瘤　。　及肺腺　癌…　检测中具有较高的敏感性及特异性。但在结直肠癌　ｐｈａｓｅ　３　ＭＲＣ　ＣＯＩＮ　ｔｉｒａｌ［Ｊ］．Ｌａｎ（・ｅｔ，２０１Ｉ，３７７（９７８３）：２１０３—　１４．　［３　Ｊ　Ｗａｎｇ　Ｌ，Ｃｕｎｎｉｎｇｈｍｎ　Ｊ　Ｍ．Ｗｉｕｔｅｒｓ　Ｊ　ｆ．，ｅｔ　ａ１．／￣ＲＡＦ　Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｃｏｌｏｎ　ｃａｎｃｅｒ　ａｒｅ　ｎｕｔ　ｌｉｋｅｌｙ　ａｔｔｒｉｂｕｔａｂｌｅ　ｔｏ　ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ　ＤＮＡ　ｍｉｓ—　中，其检测效用一・直有争议　，推测ｆｊ＿１于结直肠标本中含　有较多氧化酶及使用不同克隆号的抗体、不同免疫组化程序　造成。本实验　原发结直肠癌样本中比较免疫组化与　ＡＲＭＳ两种不同方法榆测ＢＲＡＦ　Ｖ６００Ｅ基因突变状态，结果　ｍａｔｃｈ　ｒｅｐａｉｒ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．２００３．６３（１７）：５２０９一ｌ２．　ｆ　４］Ｗｅｉｓｅｎｂｅｒｇｅｒ　Ｄ　Ｊ，Ｓｉｅｇｍｕｎｄ　Ｋ　Ｄ，Ｃａｍｐａｎ　Ｍ．ｅｔ　ａ１．ＣｐＧ　ｉｓｌａｎｄ　ｍｅｔｈｙｌａｔｕｒ　ｐｈｅｎ（￣ｔｙｐｅ　ｕｎｄｅｒｌｉｅｓ　ｓｐｏｒａｄｉ（’ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ　ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ａｕｄ　ｉｓ　ｔｉｇｈｔｌｙ　ａｓｓｏ（　ｔａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ＢＲＡＦ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｃｏｌｏｒｅｅｔｌ　ｅａｌａｌｃｅｒ　显示ＶＥＩ抗体检测ＢＲＡＦ　Ｖ６００Ｅ基因突变的敏感性可达　１００％，特异性达６２．９％　所有样本进行测序验证，均为　［Ｊ］，Ｎａｔ　Ｇｅｎｅｔ，２００６，３８（７）：７８７—９３．　［５］Ｄｏｍｉｎｇｏ　Ｅ，Ｌａｉｈｏ　Ｐ，Ｏｌｌｉｋａｉｎｅｎ　Ｍ。ｅｌ　ａ１．ＢＲＡＦ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ａｓ　ａ　ｌｏｗ—ｃｏｓｔ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｓｔｒａｔｅｇｙ　ｆｏｒ　ｓｉｍｐｌｉｆｙｉｎｇ　ＨＮＰＣＣ　ｇｅｎｅｔｉｅ　ｔｅｓｔｉｎｇ　ＢＲＡＦ　Ｖ６００Ｅ荩闪突变，其中ｌ例为少见含有Ｋ—ＲＡＳ　１２密　码子及ＢＲＡＦ　Ｖ６００Ｅ的原发双突变病例．．实验最先采用应　用于甲状腺样本免疫组化程序，但结直肠癌标本突变的肿瘤　［Ｊ１．Ｊ　Ｍｅｄ　Ｇｅｎｅｔ．２００４．４１（９）：６６４—８．　临床与实验病理学杂志Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｅｘｐ　Ｐａｔｈｏｌ　２０１６　Ｄｅｃ；３２（１２）　・１３８５・　网络出版时间：２０１６—１２—２２　０８：５３　网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０７３．Ｒ．２０１６１２２２．０８５３．０１７．ｈｔｍｌ　肺癌中Ｅｇ５、Ｋｉ－６７的表达及临床意义　袁艳龙，赵静雅，田云霄，杨建华，张小辉，宋晓明　摘要：目的观察Ｅｇ５、Ｋｉ－６７在肺癌中的表达及与临床病理　自２Ｏ世纪中期以来，全球近５０多个国家均报道肺癌的　特征的关系，探讨两者与肺癌预后的关系。方法采用免疫　发病率和病死率呈明显上升趋势，男性肺癌的发病率和病死　组化法检测７９例肺癌组织、２Ｏ例肺良性病变组织中Ｅ　、　率均位居所有恶性肿瘤的第１位，其５年存活率为１０％～　Ｋｉ－６７蛋白表达，分析两者表达与临床病理特征的关系；并随　１５％。因此，深入研究与肺癌相关的因子对于肺癌的治疗及　访患者生存期，采用Ｋａｐｌａｎ—Ｍａｉｅｒ生存分析和Ｃｏｘ回归法分　判断预后具有重要意义。Ｅｇ５是一种有丝分裂驱动蛋白，可　析Ｅｇ５、Ｋｉ－６７在肺癌组织中表达和预后的关系。结果Ｅ　以利用ＡＴＰ产生的能量沿着微管正向运动，目前认为，Ｅｇ５　在肺癌组织中的阳性率为６５．８％，Ｋｉ－６７在肺癌组织中的强　主要与细胞分裂中染色体的定位、中心体的分离以及双极纺　阳性率为４８．１％，Ｅｇ５、Ｋｉ－６７表达均与患者临床分期、淋巴　锤体的形成和分离有关。Ｃａｓｔｉｌｌｏ等…研究表明Ｅｇ５的持续　结转移明显相关。Ｋａｐｌａｎ—Ｍａｉｅｒ生存分析提示Ｅｇ５阳性、淋　高表达扰乱了纺锤体的正常组装和与其功能相关的力量平　巴结转移和中晚期的肺癌患者预后较差（Ｐ＜０．０５）；Ｃｏｘ多　衡，最终导致单极纺锤体形成、基因组的不稳定以及肿瘤的　因素回归分析显示临床分期、淋巴结转移是影响肺癌患者预　发生。Ｅｇ５在肿瘤细胞中的高表达提示与肿瘤的发生、发展　后的独立危险因素，Ｅｇ５表达与淋巴结转移明显相关（ｒ＝　密切相关。本组实验运用免疫组化法检测肺癌组织中Ｅｇ５、　０．５３９，Ｐ＜０．０５）。结论Ｅ　蛋白在肺癌组织中呈阳性表　Ｋｉ－６７蛋白表达，并探讨其与肺癌临床病理特征和预后的相　达；Ｅｇ５、Ｋｉ－６７蛋白高表达与淋巴结转移密切相关，Ｅｇ５阳性　关性　提示肺癌患者预后不良。　关键词：肺肿瘤；Ｅｇ５；Ｋｉ．－６７；预后；免疫组织化学　１材料与方法　中图分类号：Ｒ　７３４．２　文献标志码：Ａ　文章编号：１００１—７３９９（２０１６）１２—１３８５—０４　１．１材料收集河北省邯郸市中心医院病理科２０１２～２０１５　ｄｏｉ：１０．１３３１５／ｊ．ｃｎｋｉ．ｃｊｃｅｐ．２０１６．１２．０１７　年存档的手术切除肺癌标本，患者术前均未接受放疗、化疗。　共收集各类型有效肺癌标本７９例（制片丢失８例），其中男　性４９例，女性３Ｏ例；患者年龄＞６０岁者４２例，＜６０岁者３７　收稿日期：２０１６—０６—２９　例；肿瘤直径＞３　ｃｍ者５４例，＜３　ｃｍ者２５例；按照ＷＨＯ　基金项目：邯郸市科学技术研究与发展计划（１３２３１０８０８７－４）　（２０１５）肺癌组织病理学分类：肺腺癌３５例，肺鳞状细胞癌　作者单位：河北省邯郸市中心医院病理科，邯郸０５６００１　２８例，小细胞肺癌１６例（图１）；有淋巴结转移者４４例，无淋　作者简介：袁艳龙，男，硕士，主治医师。Ｔｅｌ：（０３１０）２１１８１７９，　巴结转移者３５例；按照肺癌国际ＴＮＭ分期标准：Ｉ期２７　Ｅ—ｍａｉｌ：ｙｕａｎｙａｎｌｏｎｇ１９８０＠１６３．ｃｏｒｎ　例，Ⅱ＋Ⅲ期５２例；术后随访条件为生存３个月以上，术后３　［６］Ｄｉ　Ｎｉｃｏｌａｎｔｏｎｉｏ　Ｆ，Ｍａｒｔｉｎｉ　Ｍ，Ｍｏｌｉｎａｒｉ　Ｆ，ｅｔ　ａ１．Ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ　ＢＲＡＦ　［１１］Ｉｌｉｅ　Ｍ，Ｌｏｎｇ　Ｅ，Ｈｏｆｍａｎ　Ｖ，ｅｔ　ａ１．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　ｖａｌｕｅ　ｏｆｉｍｍｕｎｏｈｉｓ—　ｉｓ　ｒｅｑｕｉｒｅｄ　ｆｏｒ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ　ｏｒ　ｃｅｔｕｘｉｍａｂ　ｉｎ　ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ　ｔｏｅｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＢＲＡＦＶ６００Ｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｐｒｉｍａ—　ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｏｎｃｏｌ，２００８，２６（３５）：５７０５—１２．　ｒｙ　ｌｕｎｇ　ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃａｕｃａｓｉａｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ［Ｊ］．Ａｎｎ　Ｏｎｃｏｌ，２０１３，　［７］Ｇａｖｉｎ　Ｐ　Ｇ，Ｃｏｌａｎｇｅｌｏ　Ｌ　Ｈ，Ｆｕｍａｇａｌｌｉ　Ｄ，ｅｔ　ａ１．Ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ　２４（３）：７４２—８．　ａｎｄ　ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ　ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｉｎ　ｓｔａｇｅ　ＩＩ　ａｎｄ　ＩＩＩ　ｃｏｌｏｎ　ｃａｎｃｅｒ：ａｎ　ａｓ－　［１２］Ａｄａｃｋａｐａｒａ　Ｃ　Ａ，Ｓｈｏｌｌ　Ｌ　Ｍ，Ｂａｒｌｅｔｔａ　Ｊ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏ－　ｓｅｓｓｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅｉｒ　ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ　ａｎｄ　ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ　ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ　ｖａｌｕｅ［Ｊ］．　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ＢＲＡＦ　Ｖ６ＯＯＥ　ｍｕｔａｔｉｏｎ－－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎ－　－Ｃｌｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，２０１２，１８（２３）：６５３１—４１．　ｔｉｂｏｄｙ　ＶＥ１　ｉｓ　ｎｏｔ　ａ　ｕｓｅｆｕｌ　ｓｕｒｒｏｇａｔｅ　ｆｏｒ　ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ　ｉｎ　ｃｏｌｏｒｅｃｔｌａ　ａｄ—　［８］Ｐｉｎｚａｎｉ　Ｐ，Ｓａｎｔｕｃｃｉ　Ｃ，Ｍａｎｃｉｎｉ　Ｉ，ｅｔ　ａ１．ＢＲＡＦＶ６００Ｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ［Ｊ］．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０１３，６３（２）：１８７—９３．　ｍｅｌｎａｏｍａ　ｉｓ　ｈｉｇｈｌｙ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｂｙ　ＣＯＬＤ－ＰＣＲ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ　Ｃｈｉｍ　Ａｃｔａ，　［１３］Ｌａｓｏｔａ　Ｊ，Ｋｏｗａｌｉｋ　Ａ，Ｗａｓａｇ　Ｂ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＢＲＡＦ　２０１１，４１２（１１—１２）：９０１—５．　Ｖ６００Ｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｉｎｃｏｌｏｎ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ｃｒｉｔｉｃａｌ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｍｕｎｏ—　［９］Ｋｏｐｅｒｅｋ　Ｏ，Ｋｏｒｎａｕｔｈ　Ｃ，Ｃａｐｐｅｒ　Ｄ，ｅｔ　ａｌ　ｈｉｓｔｏｅｈｅｍｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ［Ｊ］．Ａｍ　Ｊ　Ｓｕｒｇ　Ｐａｔｈｏｌ，２０１４，３８（９）：１２３５　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＢＲＡＦ　Ｖ６ＯＯＥ—ｍｕｔａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｐａｐｉｌｌａｒｙ　ｔｈｙｒｏｉｄ　—４１．　ｃａｒｃｉｎｏｍａ［Ｊ］．Ａｍ　Ｊ　Ｓｕｒｇ　Ｐａｔｈｏｌ，２０１２，３６（６）：８４４—５０．　［１４］Ｐａｔｉｌ　Ｄ　Ｔ，Ｍａ　Ｓ，Ｋｏｎｉｓｈｉ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｕｔｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ＢＲＡＦ　Ｖ６００Ｅ　ｍｕｔａ－　［１０］Ｌｏｎｇ　Ｇ　Ｖ，Ｗｉｌｍｏｔｔ　Ｊ　Ｓ，Ｃａｐｐｅｒ　Ｄ，ｅｔ　ａ１．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｉｓ　ｔｉｏｎ－－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｉｎ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ＢＲＡＦ　Ｖ６００Ｅ－ｍｕ－　－ｈｉｇｈｌｙ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｓｐｅｃｉｉｆｃ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｖ６００Ｅ　ＢＲＡＦ　ｍｕ—　ｔａｒｅｄ　ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｓｔｏｒｍａｌ　ｔｕｍｏｒｓ［Ｊ］．Ａｍ　Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｐａｔｈｏｌ，２０１５，　ｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｍｅｌａｎｏｍａ［Ｊ］．Ａｍ　Ｊ　Ｓｕｒｇ　Ｐａｔｈｏｌ，２０１３，３７（１）：６１—５．　１４４（５）：７８２—９．