藻类的实验室培养方法优化-1

藻类的实验室培养方法优化

第1章 绪论

1.1 研究背景及目的

由于水体富营养化加重，河流、湖泊（水库）中火量藻类繁殖，直接影响了人们的饮用水安全。为了有效控制藻类的生长，对藻类的研究是非常必要的。众所周知，富足的氮、憐等营养物质，缓慢的水流速度，适宜的气候条件包括水湿、光照等是特定优势藻生长繁衍所必需的环境条件。目前人们对于富营养化水体中藻类的研究主要集中在温度、光照、营养盐水平下的藻类生长，并且找出了藻类生长与温度、光照、营养盐等之间的对应关系。但是水体中浮游生物的种群交替和生物量的变化，不仅与水体的温度、光照周期、营养物质及生物自身的生理状态相关，还受到水体流动的影响。

本实验分别以实验室培养铜绿微囊藻为实验对象，参照藻类生长的最适宜环境条件，在温度、光照、pH值及营养盐条件一定的条件下，研究影响藻类生长的规律，为生态调水、生态河道设计流速的确定提供理论依据，控制或减少水体富营养化现象的发生。

1.2 藻种的分类

藻类植物并不是一个单一的种群，它的分布范围极广，对环境条件要求不严，适应性较强。有些种类的水藻在极低的营养浓度、极微弱的光照强度和相当低的温度下也能生活。不同研究系统对藻类的分类方法各不相同，常用的分类系统，如，根据藻类的结构特征和藻细胞的生理生化特点，将藻类分为蓝藻门、硅藻门、黄藻门、绿藻门等共十一门，引起水体富营养化的藻类植物主要为蓝藻门和绿藻门；根据藻类在水中生长的位置，将藻类分为浮游藻类、飘浮藻类和底栖藻类。硅藻门、甲藻门和绿藻门的单细胞种类以及蓝藻门的一些丝状的种类浮游生长在海洋、江河、湖泊，称为浮游藻类。一下简要说明蓝藻和绿藻的种类、分布、形态和繁殖特征。引起水体富营养化的藻类植物主要为蓝藻门和绿藻门。

1.2.1 蓝藻

在中国，蓝藻是有毒有害性最强、分布范围最为广泛的一类淡水藻。有毒的蓝藻藻种有：铜绿微囊藻，泡沫节球藻，水华鱼腥藻，阿氏颤藻，水华束丝藻等。蓝藻是广适性藻类，分布十分广泛。蓝藻的主要生存环境为淡水和海洋，它们能在

咸水、咸淡水、淡水、冰冷和沸腾的泉水中生存，但大多数生活在淡水，少数生活在海洋。蓝藻的抗逆性很强，能在其它藻类无法生存的环境中繁衍。例如，有些蓝藻能在60-85℃的温泉中生长繁殖；有的在54℃条件下还能生长、固氮；有的可-35℃的低温（如地木耳）；有一些在过饱和盐水中也可生长。蓝藻还具有

在贫瘠基质（如火山灰、沙漠、岩石）上生存的卓越能力，常常在岩石的裸露面和土壤深层中（如土壤蓝藻），它们通过一些特殊的机制（如吸收紫外线辐射的外鞘色素）增强其在相对暴露的陆地环境中的适应性。大多数蓝藻都是好氧的光合自养生物，但是在自然界中，一些蓝藻也能在完全黑暗的环境中长期存活，某些蓝藻还有进行异养生长的独特能力。有些蓝藻能与菌、苔藓、蕨类和裸子植物、被子植物形成共生关系。

蓝藻中结构最简单的是单细胞体，其次还有群体以及丝状体。其中有些单细胞体内部结构也有相对比较复杂的，主要是因为单细胞分裂后并没有脱落，还在新的细胞体内，然后新的和旧的细胞反复分裂，使得原来的单细胞内存在多个细胞从而形成细胞群。如果细胞破裂，则可以形成新的小群体。丝状体是由于细胞分裂时在同一个分裂面反复分裂形成的。丝状体的分裂也是各种各样的，有时会出现异形的细胞，有些丝状体会出现分枝或者伪枝，有些会进行极性的分化。当然丝状体也可能在分裂的过程中形成群，方式和单细胞的分裂有相同点。

蓝藻的生活史以及其特殊的行为特点使得它们能够有效适应各种磷环境。如：微囊藻对磷的最大摄取速率值较高；与其它藻类相比储存磷的能力更强，它们可以在细胞中储存足够提供细胞分裂 2-4 次的磷；比其它藻类对营养盐的结合力更高等，这样它们利用磷时会更加有效，尤其在氮、磷含量受限的情况下，与其它藻类相比它们会具有更高的竞争力。因此，许多大型湖泊、水体中尽管氮、磷浓度较低，却也可以见到蓝藻水华的发生。许多水华藻生长所需的营养盐不必完全依赖于外界的输入，而是在水体内部的营养盐循环、微生物过程等作用下，就可以得到再生、补充。因此，与生长在小型水体中的水华藻相比，它们受营养盐的限制更少。此外，有些学者指出，风浪的扰动可能比水体中的营养盐的含量本身对铜绿微囊藻生长的影响更大。

1.2.2 绿藻

绿藻属于真核生物，依据形态和大小可以分为不同的类，比如单细胞，丝状，管状和群体。绿藻以有性生殖为主，其配子有 2 或 4 条鞭毛。绿藻的其繁殖方式如下：

①营养繁殖：植物体不通过形成生殖细胞来进行繁殖。绝大多数单细胞种类通过细胞分裂的方式来形成新个体；群体也以细胞分裂来增加群体的细胞数目，这是常见的营养繁殖方法。群体、丝状体在进行营养繁殖时，还可以通过藻体断裂分离的方式进行。某些单细胞会在遇到不良生长环境时进行细胞分裂，从而形成胶群体，进行营养繁殖。

②无性生殖：是指植物体形成的生殖细胞不需经过结合而直接萌发成新的植物体的繁殖方式。动孢子：是绿藻中最常见的一种无性生殖方法，由细胞内原生

质体收缩或分裂为 1、2、4、8 个或者更多的动孢子。动孢子一般无细胞壁，具有 2 条等长鞭毛，常形成于夜间，在黎明时或环境条件突然改变时形成，进而萌发形成新植物。不动孢子：与动孢子不同的是，不动孢子无鞭毛，不能运动，并且具有细胞壁。似亲孢子：似亲孢子也是一种不动孢子，与一般不动孢子不同的是，此种孢子与母细胞的形态完全相同。休眠孢子：运动细胞在环境不良时，由细胞壁增厚，细胞内积累大量的养分和色素而形成。当环境适合时，萌发产生新个体。

③有性生殖：这种生殖方法是通过生殖细胞的结合，形成合子，合子萌发形成新植物体。绿藻分布十分的广，大多数存在于淡水中，由于绿藻呈现出绿色，在水中一般能够看到，在水中的岩石和木头上也会存在，在陆地上最为明显的就是和真菌共同组成地衣。

1.3 藻类生长影响因素

1.3.1 温度的影响

藻类的生长繁殖受到温度的影响很大，适宜的水温能够促进藻细胞自身的生理活性，也能帮助藻类更加充分的吸收水体中的营养物质，提高营养物质的利用率。每年屯、八月份水体中藻类迅速繁殖，水质恶化，富营养化严重，水华爆发。而温度较低的冬季，藻类减少甚至消失，水质有所改善。

有研究表明，年均气温每増加1.0℃．年均藻类生物量会増加化0.145倍，且水体富营养化程度越里著，温度升髙对藻类生长的影响越大。当温度达到25℃时，藻细胞迅速增殖，且比増长率最火，温度对藻类的生长速率和最终生长量有着重要影响。温度升高，藻类的生长繁殖率随之上升。实验发现，栅藻的最适生长温度为25℃，微囊藻的最适生长温度35℃，小球藻的适宜生长温度为25℃-42.3℃。虽然各种藻类的最适生长温度不同，但一般而言，25℃是大多数藻类生长的适宜温度。

1.3.2 营养盐的影响

水体富营养化过程可用以下反应式表示：

106CO2+16NO3-+HPO42-+122H2O+18H++能量+微量元素=C106H263O110N16P1（藻类原生质）+138O2。

从上面的反应式可以看出藻类的生长繁殖主要是利用碳、氮、磷三种元素，当然此外还需要铁、镁、钾、钠、硫等微量元素。很多学者研究发现，氮和磷是导致水体富营养化和水华发生的重要因子，氮磷对于蓝藻细胞的生物量有很大的影响。但是影响藻类生长的氮磷并不是一个确定值，随着藻类生长状态的改变及水体环境的变化，最优的氮磷比是在不断变化的。当氮磷比不是最佳比值时，氮磷都会成为限制藻类生长的因素。还有学者研究发现，浮游植物的第一营养限制

因子，是富营养化的决定因子，而氮元素与浮游植物的生物量没有突出的相关性。有研究表明，不同氮磷比值培养液中，影响蓝藻细胞变化趋势的只有磷浓度，与氮磷比值关系不大。当培养液中磷充足，即使氮磷比较低，微囊藻也能正常生长，所以只有在磷充足的条件下，培养液中的氮磷比值才会在一定程度上对藻类的生长产生影响。对比三峡水库成库后的７次监测结果，发现截流后营养盐浓度（ＴＮ、ＴＰ）在各断面均有所增高。当然也有学者对其他微量元素进行探究，比如铁元素，它是原核生物和真核生物生命活动中不可替代的元素，位居植物必需微量元素的首位。在浮游植物的生长过程中，氮的吸收利用、氧的新陈代谢、电子传递、呼吸作用及叶绿素的光合作用等都受到铁的影响。刘静等人对Fe3+研究，发现Fe3+浓度较低时铜绿微囊藻的生长明显受到抑制，而高Fe3+浓度能够促进铜绿微囊藻的生长和光合作用，但随后叶绿素ａ浓度和生物量迅速下降，这种现象有可能是Fe3+促进了细胞的自溶导致的。

1.3.3 光照的影响

光照是藻类生长的主要能量来源，也是其繁殖的重要生态因子。在温度、营养盐和pH值恒定的条件下，光照的强弱直接决定藻类光合作用产物的多少，从而影响藻类的繁殖和生长。随着光照的增强，光合作用的速率直线上升，到达一定强度后，当光照强度继续加强，光合作用的速率不再增加，甚至下降或停止，表现出光抑制的现象。在夏季，光照周期变长，藻类生长加快，可见光照在一定程度上对水体富营养化产生影响。

在1000-5000lX范围内，光照的增加，有利于铜绿微囊藻的生长，达到3000lX时，比增殖速率趋于平缓，表明微囊藻是喜光物种有实验得出，铜绿微囊藻在9h的光照周期下生长状态最好，其最大细胞数和最大比增长率均为最大。而绿色微囊藻在12h光照周期下生长最好，实验可见不同藻种有其各自生长的最佳光照周期。

1.3.4 pH的影响

pH值是影响藻类生长的又一重要因素。pH值过高或者过低都会抑制藻类的生长，只有在藻类最适宜的pH值范围内，藻类才会加速繁殖生长。水体pH主要从两方面对藻类产生影响；一是通过改变水体环境的酸碱度，酸性过强（H+浓度过高）或碱性过强（OH-浓度过高）都会对伤害藻细胞，因此只有在适宜的pH值范围内，藻类才能够正常的繁殖生长；二是通过影响碳酸盐平衡系统和不同形态无机碳（CO2、H2CO3、HCO3-及CO32-等）的分配关系来影响藻细胞的生长繁殖湖泊、水库中的pH值主要受水体中CO2含量的影响，而水体中CO2的含量并非受单一因素的影响，例如溶解离子、水湿、微生物等都会影响其含量的多少。在富营养化的水体中，氧和CO2主要受其中生物生命活动的控制。因此，

当藻类数量増加到一定程度时，其数量的多少及生命活动的活跃程度将主导作用水体的pH值变化。

换言之藻类对水体的pH值起到调节的作用。藻类生长对水体pH值的影响与pH值对藻类生长的影响是一个相互的过程，藻类对水体的pH值有很强的缓冲能力，能够通过自身的生长繁殖活动调节水体pH值，使pH值达到适宜藻类生长的范围。研究发现，微碱性的水体益于蓝绿藻的生长。刘春光等人通过人为控制pH值的方式，得出pH8.5是水体碳酸系统稳定性较商的一个数值，在这一pH值下藻类生长状况最好。由此我们可以推断，人为改变水体pH值，使其偏离8.5就能够在一定程度上抑制藻类的生长繁殖。

1.4 研究内容

研究首先选择三种典型的富营养化铜绿微囊藻作为研究对象。 （1）在两种不同培养基培养铜绿微囊藻，研究其生长曲线； （2）在不同温度下培养铜绿微囊藻，研究其生长曲线； （3）在不同光照强度下培养铜绿微囊藻，研究其生长曲线。

第二章 实验方法

2.1 培养基选择

铜绿微囊藻均为蓝绿藻水华中常见的藻类，且 M11和水生四号两种培养基都有应用于蓝绿藻培养，两种培养基分别针对不同藻种的培养也有一些报道。但并未看到具体针对两种培养基在相同实验条件下培养铜绿微囊藻效果比较的研究。本实验选择这两种培养基作为实验用培养基，并对它们的培养效果进行比较。

M11培养基成分为：NaNO3 100mg/L，K2HPO4 10mg/L，MgSO4·7H2O 75mg/L，CaCl2·H2O 40mg/L，Na2CO3 20mg/L，柠檬酸铁6mg/L，Na2EDTA·2H2O 1mg/L，pH值8.0。

水生四号培养基成分为：Ca(H2PO4)2·H2O＋2（CuSO4·H2O）30mg/L，(NH4)2SO4 20mg/L，Mg SO4·7H2O 80mg/L，Na HCO3 10mg/L，KCl 2.5mg/L，Fe Cl3（1%）0.15ml，土壤浸出液0.5ml。

2.2 实验方法

2.2.1 培养方式

试验实验采用批量培养方式，在 500ml 锥形瓶中装入培养液 200ml，并经过 121℃高温灭菌20min。取处于对数生长期的铜绿微囊藻种分别定量接入培养基中，然后放入人工气候箱中进行培养。一定培养温度和光照强度，光暗比 12:12。在光照周期内，每天摇动锥形瓶3-4次，并随机交换锥形瓶位置。

2.2.2 藻类生物量测定

藻类生物量测定采用血球计数板计数方法。每天上午9:00 取样，每个样品计数 3次取平均值。实验周期为 24 天。

第三章 结果与讨论

3.1 不同培养基下铜绿微囊藻生物量变化情况

取灭菌后的铜绿微囊藻种分别定量接入培养基（水生4号和M11）中，然后放入人工气候箱中进行培养。25℃培养温度和3000lux光照强度，光暗比 12:12的条件下，实验周期内细胞浓度计数结果见表1。

表1 铜绿微囊藻在水生 4 号和 M11 培养基下的藻密度计数结果 时间/天 水生4号中的藻密度（×106个/ml） M11中的藻密度（×106个/ml） 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 16 17 18 19 20 21 22 23 24 1.02 1.59 4.19 6.93 8.37 9.45 10.5 12.46 14.86 15.89 17.04 16.75 17.96 16.56 14.72 12.54 11.09 9.73 8.28 6.56 3.82 2.01 1.02 1.23 2.01 2.89 3.45 5.01 6.78 7.02 8.98 10.34 13.02 15.73 18.3 21.89 23.93 25.92 26.03 23.84 18.03 14.92 9.02 7.02 5.38 3.04 根据每日藻细胞浓度计数结果，分别绘制铜绿微囊藻在水生四号和 M11 两种培养基中的生长情况曲线，如图1所示。

30水生4号M11藻细胞浓度（×106个/ml25201510501234567891011121314161718192021222324时间/天 图3-1 铜绿微囊藻在两种培养基中的生长曲线

图1所示为铜绿微囊藻在两种培养基中的生长曲线。由图中曲线可知，铜绿微囊藻在 M11 培养基中经过17天培养达到最大生物量，为26.03×106个/ml；而在水生四号培养基中第13天即达到了最大生物量，仅为17.96×106个/ml。从生长曲线的整体趋势来看，铜绿微囊藻在M11培养基中的生长情况优于在水生四号培养基中的情况。

3.2 不同温度下铜绿微囊藻生物量变化情况

取灭菌后的铜绿微囊藻种分别定量接入培养基M11中，然后放入人工气候箱中进行培养。3000lux光照强度，光暗比 12:12，不同培养温度（20℃、25℃、30℃）的条件下，实验周期内细胞浓度计数结果见表2。

表2 在不同温度下的藻密度计数结果 时间/天 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

铜绿微囊藻密度（×106个/ml） 20℃ 1.05 1.62 2.22 2.99 3.71 3.99 4.61 5.39 6.22 7.97 9.8 11.28 13 25℃ 1.23 2.01 2.89 3.45 5.01 6.78 7.02 8.98 10.34 13.02 15.73 18.3 21.89 30℃ 1.29 2.29 3.2 4.93 6.2 8.03 11.83 14.83 18.2 18.01 17.1 15.92 14.29

14 16 17 18 19 20 21 22 23 24 13.59 14.75 15.57 15.12 13.76 8.31 6.59 3.85 2.04 1.05 27.93 34.92 29.03 23.84 18.03 14.92 9.02 7.02 5.38 3.04 12.92 10.82 9.92 8.2 7.03 6.28 5.29 4.25 2.91 2.01 根据每日藻细胞浓度计数结果，分别绘制三种藻类在不同温度下的生长情况曲线，如图2所示。

3025藻细胞浓度（×106个/ml201510501234567891011121314161718192021222324时间/天20℃25℃30℃ 图3-2 所示为铜绿微囊藻在不同温度下的生长曲线

图2所示为铜绿微囊藻在不同温度下的生长曲线。由图中曲线可知，铜绿微囊藻在25℃培养基中经过17天培养达到最大生物量，为26.03×106个/ml；而在20℃和30℃培养基中分别在第17天和第9天即达到了最大生物量，仅分别为

15.57×106个/ml和18.2×106个/ml。从生长曲线的整体趋势来看，铜绿微囊藻在

25℃中的生长情况优于其他温度的情况。

3.3 不同光照下铜绿微囊藻生物量变化情况

取灭菌后的铜绿微囊藻种分别定量接入培养基M11中，然后放入人工气候箱中进行培养。培养温度25℃，光暗比 12:12，不同光照强度（2000lux、3000lux、4000lux）的条件下，实验周期内细胞浓度计数结果见表3-1。

表3 在不同光照强度下的藻密度计数结果 时间/天 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 16 17 18 19 20 21 22 23 24 2000lux 0.92 1.72 2.93 3.91 5.13 6.28 8.23 10.68 12.74 15.28 17.2 15.29 14.28 13.69 12.01 10.72 9.76 9.2 8.21 6.36 3.734 2.47 1.74 铜绿微囊藻密度（×106个/ml） 3000lux 1.23 2.01 2.89 3.45 5.01 6.78 7.02 8.98 10.34 13.02 15.73 18.3 21.89 23.93 25.92 26.03 23.84 18.03 14.92 9.02 7.02 5.38 3.04 4000lux 1.39 2.24 3.68 4.28 6.589 8.43 11.8 14.367 16.94 18.481 19.61 15.31 14.18 12.51 10.19 9.81 9.09 8.92 7.17 6.18 5.14 3.8 1.9 根据每日藻细胞浓度计数结果，分别绘制铜绿微囊藻在不同光照强度中的生长情况曲线，如图3-1所示。

302520藻细胞浓度（×106个/ml1510501234567891011121314161718192021222324时间/天2000lux3000lux4000lux 图3 铜绿微囊藻在不同光照强度下的生长曲线

图3所示为铜绿微囊藻在不同光照强度下的生长曲线，由图中曲线可知，铜绿微囊藻在光照强度3000lux培养基中经过17天培养达到最大生物量，为26.03×106个/ml；而在光照强度2000lux和3000lux培养基中均在第11天达到了最大生物量，仅分别为17.2×106个/ml和19.6×106个/ml。从生长曲线的整体趋势来看，铜绿微囊藻在25℃中的生长情况优于其他温度的情况。

第四章 结论

研究了铜绿微囊藻在不同培养基、不同光照强度和不同温度下的实验室培养情况，得出结论在M11培养基、光照强度为3000lux和25℃培养温度下，经过17天培养达到最大生物量，能达到26.03×106个/ml。

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