第5章植物的快速繁殖和脱病毒技术

第5章植物的快速繁殖和脱病毒技术

利用离体培养技术，将植物外植体在人工培养基和合适的条件下进行培养，以在短期内获得大量遗传性一致的个体的方法称为离体快速无性繁殖，简称为离体繁殖（in vitro propagation）、微繁殖（micropropagation）或快速（营养）繁殖（rapid propagation）。由离体无性繁殖获得的植株称为试管苗。

无性系(无性繁殖系，克隆）：由同一外植体或细胞增殖的培养物。

一般适用范围：

1) 加速难繁殖或繁殖缓慢植物的繁殖.

2) 易染病毒植物的脱毒繁殖.

3) 不能用种子繁殖的杂合体园艺作物.

4) 需要加速繁殖的数量有限的优选单株、良种、珍稀濒危植物，以及生物工程产生的新品种.

第1节 植物的快速繁殖技术

1 离体快繁的一般技术途径和方法:

快速繁殖过程一般分成以下几个阶段:

准备阶段（0阶段）

初代培养阶段：无菌培养物的建立；

增殖阶段：芽的增殖,促长；

生根阶段：诱导芽生根；

移栽阶段：试管苗的移栽。

1.1 无菌培养物的建立(初代培养; primary culture)

一般过程包括:

(1) 外植体的选择和消毒

(2) 培养基和植物生长物质的选择

(3) 环境条件的选择和培养

初代培养注意事项

1）保证无菌

2）条件合适

3）技术过关

4）防止褐变

褐变原因：外植体中的酚类化合物在多酚氧化酶的作用下氧化。

影响褐变的因素

(1)植物种类和基因型

(2)外植体的取材部位和生理状态

(3) 培养基成分

(4) 培养条件和时间

防止褐变的常用方法

（目前尚无通用的防止褐变的有效方法.）

1) 选择适当的外植体

2) 选择合适的培养基和培养条件

3) 使用抗氧化剂

4) 及时转接等

1.2 增殖阶段 (芽的增殖; shoot multiplication)

使外植体在数量上迅速增加。

罗士韦（1978）:植物离体分化过程的类型分5种：

1）无菌短枝型:节培法;微型扦插法

2）丛生芽增殖型

3）器官发生型

4）胚状体发生型

5）原球茎型

李文安（1998）: 分10类

1）器官型

2）器官发生型

3）胚状体发生型

4）原球茎型

5）球茎芽型

6）块茎型

7）鳞茎型

8）孢子型

9）根茎型

10）微枝扦插型

1) 促进侧芽的形成和生长（丛生芽增殖型；促进腋生分枝）

基本过程：初代培养的芽在适宜的培养基上培养，使侧芽不断分化和生长，逐渐形成芽丛，反复切割和转移到新的培养基中继代培养，就可在短时间内得到大量的芽。

外植体：顶芽或侧芽。

植物生长物质：细胞分裂素:常用6-BA、KT、2ip和Zt等;一般加0.1~10mg/L，常用0.5~2mg/L ；生长素常用NAA、IBA和IAA，浓度为0.1~1.0mg/L。

培养条件：一般25oC左右;1000~2000 lx照明，每日16h或24h（或全黑暗）。

特点：能较好保持遗传稳定性；但过程较复杂。

2) 诱导不定芽形成

不定芽：除现有的芽之外，从任何器官上通过器官发生 重新形成的芽.

在许多器官和愈伤组织上都能诱导出不定芽。但可使嵌合性状遭到破坏（图5-1）。

常用细胞分裂素：6-BA,KT和Zt,浓度0.1~10mg/L;

常用生长素：NAA，IAA和IBA。

二者比例:一般细胞分裂素高于生长素，但也有采用接近1的配比。

图5-1 杂色天竺葵的茎尖（上）和叶柄（下）培养

3) 诱导胚状体的形成 (体细胞胚胎发生; Somatic embryogenesis）

外植体选择： 一般使用合子胚、分生组织或子房、花药等生殖器官.植物其它部分也有直接或间接产生胚状体的能力.

培养条件：

在含有丰富铵态氮的培养基上,加2,4-D诱导胚状体的发生,然后转移到降低2,4-D浓度或没有生长素的培养基上使胚状体成熟和萌发.

优点：增殖率高,且具双极性. 应用：人工种子等

缺点：很多主要的作物还不能形成胚状体, 或产生的胚状体难以形成植株,或成苗率太低,以及遗传性不够稳定。

1.3 生根（根的诱导;根的再生;Rooting）

方法：将增殖的芽剥离下来，分别种植到新的培养基上，诱导生根。

植物生长物质：一些植物可以在无激素培养基上生根,其它的需要在培养基中加入适量

的生长素,一般浓度为1~10.0mg/L,常用NAA、IBA和IAA。

基本培养基：一般用盐浓度较低的培养基。蔗糖浓度可降低到1.0~1.5%左右。

1.4 试管苗的移栽（Transplantation）

炼苗（驯化）：试管苗逐步锻炼和适应外界环境条件的过程.

试管苗解剖学特点：叶表无角质、蜡质,表皮毛无或极少而薄,气孔不能关闭等.

过程：逐渐降低湿度,逐渐增强光照；加生长延缓剂等。

2 快速繁殖生产中应注意的问题

2.1 遗传稳定性

影响遗传稳定性的因素主要有：

A 外植体来源

B 继代培养

C 再生植株发生方式

D 植物生长物质

提高遗传稳定性,减少变异发生的措施主要有:

a 选择合适外植体

b 减少继代次数,缩短继代时间;

c 使用生长点或侧生分枝方式扩繁;

d 选用适当的植物生长物质种类和较低浓度等

e 定期检查,剔除形态和生理异常苗;

f 尽量促进再生植株开花结实,以检查其生物学性状和经济性状是否稳定.

2.2 玻璃化

玻璃化现象：指试管苗茎叶呈半透明或水浸状，外观形态往往异常的现象。培中特有的一种生理病变。

影响玻璃苗发生的因素：

是植物组

（1）培养材料

（2）环境因素

（3）培养基成分

可能的预防性措施：

（1）采用固体培养，适当增加琼脂浓度，提高培养基中的蔗糖含量或加入渗透剂，降低容器内的空气相对湿度。

（2）注意通气，改善容器内的氧气供应。避免培养温度过高，一般昼夜变温交替效果较好。酌情调整光照时间和强度等。

（3）降低培养基中的NH4+浓度，根据具体情况调整其他元素的含量。适当降低培养基中细胞分裂素的浓度。注意碳源种类和浓度的选择。

（4）其他：如采用热激处理、给培养基添加青霉素G钾、活性炭、聚乙烯醇、CCC或PP333等。

3 快繁实例

1) 唐菖蒲(Gladiolus gandavensis)

2) 月季

唐菖蒲快繁

7~10d

消毒茎尖→→MS0培养基 → → 茎尖膨大

① ② ↓

↓ ③

MS+6-苄基嘌呤(BA)1.0mg/L+萘乙酸(NAA)0.01mg/L或

MS+ 6-BA1. 0mg/L+ 激动素1.0mg/L+NAA0.5mg/L的固体培养基

④ ↓约25d

形成芽丛(每个茎尖可产生10~40 个芽)

⑤ ↓

芽丛切割,重复③~⑤

⑥ ↓

延长培养,苗的基部逐渐膨大，芽梢伸长转绿

⑦ ↓苗长到2.0cm时

MS+吲哚丁酸(IBA) 0.5mg/L固体培养基上诱导生根

⑧ ↓7~8天

见到根的突起,20多天可产生大量的根

⑨ ↓

进行移栽.

月季快繁

健壮优良母株的嫩茎去叶

↓

消毒(70%酒精0.5~2sec, 0. 1%HgCl2 5~8min),

↓ 嫩茎切段(0.5~1.0cm)

固体培养基（MS+ 6-BA0.5~3.0mg/L+NAA0.01~0.2mg/L）

↓日温20~250C,夜温15~200C,每日光照10h,光照强度1000lx.

↓20 d左右 ↑

形成丛生芽→芽丛切割→→↑

↓

壮苗培养（MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.01mg/L固体培养基）

↓枝条长到3cm左右时，切下枝条

诱导生根（MS+1mg/L IBA或0.5~1.0mg/L NAA）

↓7~10d

基部愈合并形成根原基

↓

将苗取出，直接插入稻壳灰与土(1:1)的营养钵中,用塑料薄膜覆盖

↓5~6天

小苗生根,新梢生长 1Mon. 定植或上盆.

第2节 无病毒植物的培养

附表：危害部分园艺植物的病毒数目

1 防治植物病毒病的方法

1.1 物理方法

1）热处理脱病毒（又称温热疗法，thermotherapy）：

温汤浸渍处理(温水浸泡)：适用于休眠器官、剪下的接穗或种植的材料；

热风处理（干热处理）： 休眠组织和正在生长的组织都适用，特别是茎尖培养结合热处理可获得较理想的脱病毒效果。

热处理的时间和温度因植物种类及器官生理条件不同而异.

原则：既能使体内病毒钝化,又能保证一定程度的寄主存活率.

2) 低温处理脱病毒（冷冻法：cryotherapy）

1.2 化学方法

利用能钝化、抑制和消除植物病毒的一些化合物

化 合 物 植物病毒* 寄 主

三氮唑核苷 CMV, PVY, TMV 烟草

(ribavirin) ACLSV 苹果

LSV, TBV 百合

ORSV 大花惠兰

PVY, PVX, PVS, PVM 马铃薯

EMCV 茄子

阿糖腺苷(vidarabine) OMV 虎眼万年青

碱性孔雀绿(malachite green) PVX 马铃薯

2-硫尿嘧啶(2-thiouracil) PVY 烟草

放线菌素-D(actinomycin-D) TMV 大白菜

*：CMV：黄瓜花叶病毒；PVY：马铃薯病毒Y；TMV：烟草花叶病毒；ACLSV：苹果褪绿叶斑病毒；LSV：百合潜隐病毒；TBV：郁金香碎色病毒；ORSV：虎眼万年青环斑病毒；PVX：马铃薯病毒X；PVS：马铃薯病毒S；PVM：马铃薯病毒M；EMCV：茄子杂色皱病毒；OMV：虎眼万年青花叶病毒。

1.3 生物方法

1) 种子繁殖 适用于不侵染种子的病毒. 但无性繁殖作物不适宜.

2) 茎尖培养(shoot-tip culture)

A. 茎尖培养脱毒的原理

越靠近生长点，病毒浓度越低。

可能原因：传导抑制；酶缺乏；能量竞争；抑制因子

B. 茎尖培养脱毒一般过程

取材：一般带一两个叶原基的茎尖比较合适.

剥离和接种

培养基：植物生长物质的种类和浓度

培养条件

影响茎尖培养脱毒成功的因素

脱毒培养是否成功取决于两点:离体茎尖能否成活;成活的茎尖还有没有病毒.

1) 茎尖大小

离体茎尖越大,越易成活,但病毒越难去除.

一般带一两个叶原基的茎尖比较合适.

2) 培养基

植物生长物质的种类和浓度

茎尖培养的基本过程

选择母株──可能时预先进行病毒测定

↓ ──必要时进行预先热处理(30~36oC,6~12周)

剥离合适大小的茎尖

↓

培养─必要时可热处理(30~40oC)

↓─必要时在培养基中加入抗病毒化合物

再生植株

↓

切段或其它繁殖形成的无性系

↙ ↓ ↘

部分保留 部分移入室内备病毒鉴定用 部分试管苗直接用于病毒鉴定

↓ ↓

↓ (1)指示植物 (2)免疫学 (3)电镜(4)分子生物学方法

保存 →移栽→无性系选择(有无生理或遗传上的变异)

↓ ↘ 品种对比实验(产量,对环境适应性及抗病性等)

选择适宜的无性系进行大量繁殖

↓

无病毒原原种

↓

扩大繁育生产体系

↓

供给农户

3）微体嫁接（microgrfting，离体微型嫁接）

是将茎尖培养与嫁接方法相结合，用以获得无病毒苗木的技术。

把茎尖作为接穗嫁接到培养出的无菌实生试管苗砧木上，然后连同砧木一起继续培养，愈合后成为完整植株。

因接穗易成活，可培养很小的茎尖（<0.2 mm）

目前主要应用在果树脱毒方面。

4）珠心组织培养

柑橘类多胚品种有多个珠心胚。

珠心与维管束系统无直接联系，由珠心组织培养产生的植株可能免除病毒危害。

问题：变异率较高（约20%~30%），幼年期较长等。

5）愈伤组织培养脱毒法

植物脱分化培养诱导产生的愈伤组织，经过几次继代后再分化形成的小植株中可能得到无病毒苗。

在烟草、天竺葵、大蒜和草莓等植物上已获得成功。

可能的机理：

①病毒在植物体内不同器官或同一器官的不同组织中分布不均匀。

②有些愈伤组织细胞中病毒浓度较低，在愈伤组织细胞快速分裂过程中，病毒的复制能力衰退或丢失。

③继代培养的愈伤组织容易产生抗性变异细胞等。

问题：易产生变异。

6） 茎圆盘半球培养法 （stem-disc dome culture,简称SD-Dome culture）

植株感病的大蒜蒜瓣

↓表面消毒

切成薄片

↓

接种在含激素的培养基上

↓ 5d

圆盘表面长出半球体

↓在培养的5~7d后

从外植体剥离半球体,转移到无激素的LS培养基上

↓2周

高约1cm的苗

↓ 8周

带根的高8cm的试管苗

↓

移栽(不呈现病毒症状)

↓

进行RT-PCR分析(,结果表明这些植株均不含供体植株携带的大蒜病毒)

2 再生植株病毒鉴定

1） 症状直接检测: 植株茎叶中是否有该病毒所特有的可见症状.

2） 指示植物测定:

指示植物：对某种或某些特定病毒非常敏感的植物.

将受检植物的液汁轻轻涂于指示植物叶片上,加细石英砂适当用力磨擦, 使指示植物叶表面受到侵染,但又不要损伤叶片… ….

3）免疫学方法 : 先给动物注射已知病毒获得抗血清,再将分离的待测植株液汁加入, 观察有无沉淀出现。

酶联免疫法（ELISA）：用酶标记抗原或抗体的微量测定法。

4） 电镜法: 直接观察有无病毒微粒的存在，以及微粒的大小、形态和结构，借以鉴定病毒的种类。

5）分子生物学方法 ：核酸杂交；PCR；dsRNA 等。

3 操作实例：葡萄脱毒及无毒苗试管繁殖技术（曹孜义等，1991）

将盆栽葡萄在38oC热处理箱中处理2~3个月，然后把新长出的枝蔓消毒，再取下顶尖和侧芽，剥取2~3mm长的茎尖，接种到茎尖培养基上（1/2MS基本培养基，每升附加0.1mg NAA、0.1mg KT、4mg 硫酸腺嘌呤、30g蔗糖）。然后放在28oC2oC下，在连续光照下

培养。

待芽增大生长后，再转入生茎培养基(1/2MS基本培养基，每升附加0.1mg BA、0.2mg IAA、0.5mg KT、4mg 硫酸腺嘌呤、30g蔗糖)，促进丛生芽生长。

再转入生根培养基(1/2B5基本培养基，每升附加0.1mg NAA或2mg IAA、20g蔗糖)，即可获得无病毒生根试管苗。

用这种方法使29个品种脱除了葡萄扇叶病毒、卷叶病毒、茎痘病毒和栓皮病毒等4种主要葡萄病毒。