一种小反刍兽疫病毒PPR-N蛋白单克隆抗体的制备及其应用[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 112521495 A(43)申请公布日 2021.03.19

(21)申请号 202011528215.2(22)申请日 2020.12.22(83)生物保藏信息

CGMCC No.21413 2020.12.14

(71)申请人 北京中海生物科技有限公司地址 100081 北京市海淀区中关村南大街8

号(72)发明人 刘硕　孙亚波　徐建成　张明薇　

沈青春　才学鹏　迟鑫　王凤霞　(74)专利代理机构 北京君智知识产权代理事务

所(普通合伙) 11305

代理人 郑明(51)Int.Cl.

C07K 16/10(2006.01)C12P 21/08(2006.01)

(54)发明名称

一种小反刍兽疫病毒PPR-N蛋白单克隆抗体的制备及其应用(57)摘要

本发明涉及一种小反刍兽疫病毒PPR‑N蛋白单克隆抗体制备及其应用。通过对培养基成分和添加血清含量进行研究，并对悬浮培养的各个参数进行优化，实现了对本发明的PPR‑N蛋白单克隆抗体的规模化生产。该方法能大幅度减少培养成本、增加单位体积内细胞数、提高单克隆抗体效价。通过纯化后的纯化浓缩液，单克隆抗体浓度可提高8倍，并且能保持原有的敏感性和特异性不变，可用于小反刍兽疫病毒抗体的免疫学检测。使用本发明制备的小反刍兽疫PPR‑N改良竞争ELISA试剂盒，能更显著地区分阴、阳性对照，二者间的差值更大，相比采用传统竞争ELISA方法，具有更好的敏感性和特异性。通过对比可见在传统竞争ELISA法无法区分阴阳性界限，本发明改良竞争ELISA法可准确的区分阴阳性界限。

G01N 33/577(2006.01)G01N 33/569(2006.01)G01N 33/543(2006.01)

权利要求书1页 说明书8页

序列表1页

CN 112521495 ACN 112521495 A

权　利　要　求　书

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1.一种小反刍兽疫病毒PPR‑N蛋白单克隆抗体，其特征在于所述小反刍兽疫病毒PPR‑N蛋白单克隆抗体是由杂交瘤细胞株分泌而得，该细胞株被命名为小反刍兽疫病毒N蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株PPR‑N(P‑1‑5)，并已于2020年12月14日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No.21413。

2.一种小反刍兽疫病毒PPR‑N蛋白单克隆抗体的规模化生产方法，其特征在于，所述小反刍兽疫病毒PPR‑N蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株PPR‑N(P‑1‑5)，适应10％血清DMEM培养基；按照细胞数50万个/mL的转接量，细胞瓶转接摇瓶、摇瓶转接10L种子罐细胞生物反应器、再转接50L细胞生物反应器逐级放大培养，培养结束后，取样孔取样并且细胞计数，计数结果为600～650万个/mL。

3.一种小反刍兽疫病毒PPR‑N蛋白单克隆抗体在改良竞争ELISA试剂盒中的应用，其特征在于，小反刍兽疫病毒PPR‑N蛋白的单克隆抗体和酶标板及其配套试剂组装成用于检测小反刍兽疫病毒。

4.一种用于检测小反刍兽疫病毒抗体改良竞争ELISA试剂盒及其配套试剂，其特征在于该小反刍兽疫病毒抗体改良竞争ELISA试剂盒使用改良竞争ELISA法检测血清标本中的小反刍兽疫病毒特异性抗体；

所述的改良竞争ELISA法在于先在试剂盒的聚乙烯微孔板上预包被小反刍兽疫重组PPR‑N蛋白纯化抗原，样品血清与抗原先进行特异性结合，再与单克隆抗体进行竞争性结合，此方法增强检测的敏感性和准确性。

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一种小反刍兽疫病毒PPR‑N蛋白单克隆抗体的制备及其应用

技术领域

[0001]本发明涉及一种小反刍兽疫病毒PPR‑N蛋白单克隆抗体的制备及其应用。属于兽用生物制品领域。

背景技术

[0002]小反刍兽疫(Peste des petits ruminants，PPR)俗称“羊瘟”，又名肺肠炎(pneumoenteritis)，是一种小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus，PPRV)引起的烈性传染病，主要感染的动物有羊亚科、长角羚等小反刍动物，发病率达90％以上，主要症状表现为高烧、口腔内膜炎、腹泻不止、肺炎等，在高危地区致死率可达100％。据FAO(2019年)推测，全球60％的小反刍类养殖行业受到该病的威胁。我国的第二产业就是养殖业，并且是经济体系不可分割的一部分，平均每年养羊量可达5.6‑6亿只。该病2007年首次传入我国西藏阿里地区，随后几年间出现集体爆发疫情现象，发病率达100％，死亡率可达80％以上。由于我国规模化养殖体系的不完善和生物制品的匮乏，造成巨大的经济损失。此病是世界动物卫生组织(OIE)规定的必须及时上报的动物疫病。截至目前，我国尚无成熟的小反刍兽疫诊断试剂申报注册，基本依靠进口诊断试剂。发明内容

[0003]本发明人针对小反刍兽疫病原微生物诊断检测技术和抗原抗体生产纯化等关键技术问题特别是在病原微生物鉴定分离和单克隆抗体规模化生产技术上取得了实质性突破，获得单克隆抗体杂交瘤细胞，并对此细胞进行低血清培养基悬浮培养驯化，可以投放在大规模生产企业进行生产，并且生产成本比市场化培养基更加低廉。针对可分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞进一步开发出了经济实用、特异性温和、敏感性高的小反刍抗体改良竞争ELISA试剂盒，将有助于小反刍兽疫检测技术缺乏的问题，并为我国养羊业带来显著的经济和社会效益。因此，本发明的目的是根据上述领域的需求和不足，本发明提供一种敏感性强、特异性温和、效价高的小反刍兽疫病毒PPR‑N蛋白的单克隆抗体，本发明单克隆抗体可以应用于检测小反刍兽疫病毒抗体。[0004]本发明的技术方案：

[0005]1.一种小反刍兽疫病毒PPR‑N蛋白单克隆抗体，其特征在于所述小反刍兽疫病毒PPR‑N蛋白单克隆抗体是由杂交瘤细胞株分泌而得，该细胞株被命名为小反刍兽疫病毒N蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株PPR‑N(P‑1‑5)，并已于2020年12月14日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No.21413；

[0006]所述PPR‑N蛋白单克隆抗体含有序列1，该序列是按大肠杆菌密码子特征进行优化后的小反刍兽疫N蛋白基因的主要抗原区序列。

[0007]2.本发明所述一种小反刍兽疫病毒PPR‑N蛋白单克隆抗体的规模化生产方法，其特征在于，所述小反刍兽疫病毒PPR‑N蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株PPR‑N(P‑1‑5)，适应

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10％血清DMEM培养基；按照细胞数50万个/mL的转接量，细胞瓶转接摇瓶、摇瓶转接10L种子罐细胞生物反应器、再转接50L细胞生物反应器逐级放大培养，培养结束后，取样孔取样并且细胞计数，计数结果为600～650万个/mL。

[0008]3.本发明所述一种小反刍兽疫病毒PPR‑N蛋白单克隆抗体在改良竞争ELISA试剂盒中的应用，其特征在于，小反刍兽疫病毒PPR‑N蛋白的单克隆抗体和酶标板及其配套试剂组装成用于检测小反刍兽疫病毒。

[0009]4.本发明所述一种用于检测小反刍兽疫病毒抗体改良竞争ELISA试剂盒及其配套试剂，其特征在于该小反刍兽疫病毒抗体改良竞争ELISA试剂盒使用改良竞争ELISA法检测血清标本中的小反刍兽疫病毒特异性抗体；

[0010]所述的改良竞争ELISA法在于先在试剂盒的聚乙烯微孔板上预包被小反刍兽疫重

再与单克隆抗体进行竞争性结组PPR‑N蛋白纯化抗原，样品血清与抗原先进行特异性结合，

合，此方法增强检测的敏感性和准确性。[0011]本发明取得的新技术效果

[0012]本发明涉及一种小反刍兽疫病毒PPR‑N蛋白单克隆抗体制备及其应用。通过对培养基成分和添加血清含量进行研究，并对悬浮培养的各个参数进行优化，实现了单克隆抗体的规模化生产。该方法能大幅度减少培养成本、增加单位体积内细胞数、提高单克隆抗体效价。通过纯化后的纯化浓缩液，单克隆抗体浓度可提高8倍，并且能保持原有的敏感性和特异性不变，可用于小反刍兽疫病毒抗体的免疫学检测。使用规模化生产的小反刍兽疫病毒PPR‑N蛋白单克隆抗体，并对反应时间和样品添加顺序进行了优化，制备了小反刍兽疫PPR‑N改良竞争ELISA试剂盒，能更显著地区分阴、阳性对照，二者间的差值更大，相比采用传统竞争ELISA方法，具有更好的敏感性和特异性。通过试验数据对比，在传统竞争ELISA法无法区分阴阳性界限，改良竞争ELISA法可以成功并且准确的区分阴阳性界限。[0013]本发明涉及微生物资源信息

[0014]本发明所用免疫抗原为小反刍兽疫病毒PPR‑N蛋白，参照NCBI的公布的小反刍兽疫病毒N蛋白抗原的核苷酸序列，由本实验室选取其中N末端抗原决定簇较为集中区域，经密码子优化后人工合成序列，克隆到pET28a(+)表达载体后，转化大肠杆菌Transetta DE3进行表达，将表达产物纯化后，作为免疫抗原。[0015]检测抗原为小反刍兽疫病毒浓缩抗原，选用的毒种为Clone 9疫苗株，由中国兽医微生物菌种保藏中心提供。

具体实施方式

[0016]1.单克隆抗体杂交瘤细胞的培育

[0017]参照NCBI的公布的小反刍兽疫病毒N蛋白抗原的核苷酸序列，选取N末端抗原决定簇较为集中区域，经密码子优化后人工合成序列(序列1)，并克隆到pET28a(+)表达载体，转化大肠杆菌进行原核表达。[0018]小反刍兽疫病毒Clone 9疫苗株接种生长良好的Vero细胞，经多代培养后，使用Purose 6Fast Flow填料纯化病毒，即为小反刍兽疫病毒浓缩纯化液。将重组PPR‑N蛋白作为抗原对Balb/c小鼠进行免疫，当抗体效价达到1:20000以上，取脾细胞悬液与SP20细胞按一定比例融合后铺板，5％CO2 37℃静置培养。融合后第4、8天半量换液。融合后第12天，取

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细胞板孔底部出现细胞簇的上清液进行筛选。对强阳性孔进行扩繁与亚克隆,经三次亚克隆后置液氮中冻存。该小反刍融合细胞株被命名为小反刍兽疫病毒N蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株PPR‑N(P‑1‑5)，并已于2020年12月14日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No.21413。[0019]2.本发明所述一种小反刍兽疫病毒PPR‑N蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述小反刍兽疫病毒PPR‑N蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株PPR‑N(P‑1‑5)，适应10％血清DMEM培养基；按照细胞数50万个/mL的转接量，细胞瓶转接摇瓶，摇瓶转接10L细胞生物反应器。培养72h时，进行种子罐转接50L细胞生物反应器。50L反应器装液量在50％左右；转速控制在70～100r/min；pH值控制在7.0～7.2范围内；DO值变化控制在40％以下；CO2值前期控制在4％～5％左右；温度控制在(37±1)℃；罐压控制在0.1MPa左右；补料在培养56h后进行流加补充能量物质(碳源、氮源、氨基酸、生长因子等)，流加速度为200～300mL/h。培养周期在72～80h。培养结束后，取样孔取样并且细胞计数，计数结果为600～650万个/mL。此套培养系统实现了单克隆抗体的规模化生产。并且使用全自动层析纯化操作系统进行单克隆抗体提纯。以上方法能大幅度减少培养成本、增加单位体积内细胞数、提高单克隆抗体效价与纯度。

[0020]实施例

[0021]以下实施案例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的方法和产品，均落在本发明的保护范围之内。

[0022]实施例1——单克隆抗体规模化中试生产[0023]1.单克隆抗体杂交瘤细胞的制备

[0024]参照NCBI的公布的小反刍兽疫病毒N蛋白抗原的核苷酸序列，选取N末端抗原决定簇较为集中区域，经密码子优化后人工合成序列(序列1)，并克隆到pET28a(+)表达载体，转化大肠杆菌进行原核表达。[0025]小反刍兽疫病毒Clone 9疫苗株接种生长良好的Vero细胞，经多代培养后，使用Purose 6Fast Flow填料纯化病毒，即为小反刍兽疫病毒浓缩纯化液。将重组PPR‑N蛋白作为抗原对Balb/c小鼠进行免疫，当抗体效价达到1:20000以上，取脾细胞悬液与SP20细胞按一定比例融合后铺板，5％CO2 37℃静置培养。融合后第4、8天半量换液。融合后第12天，取细胞板孔底部出现细胞簇的上清液进行筛选。对强阳性孔进行扩繁与亚克隆,经三次亚克隆后置液氮中冻存。该小反刍融合细胞株被命名为小反刍兽疫病毒N蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株PPR‑N(P‑1‑5)，并已于2020年12月14日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No.21413。[0026]序列1：按大肠杆菌密码子特征进行优化后的小反刍兽疫N蛋白基因的主要抗原区序列。

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2.小反刍融合细胞复苏及扩繁传代

[0029]从液氮中取一支小反刍融合细胞，使用含20％血清DMEM培养基，在6孔细胞板中复苏培养，CO2培养箱静止培养3天。转接小号细胞瓶，进行传代培养。[0030]3.小反刍融合细胞低血清驯化及培养基优化[0031]对生长状态良好的细胞进行梯度降血清驯化，按照20％、17％、14％、10％的血清添加比例进行驯化，每个血清比例培养3代，使细胞缓慢适应低血清培养基，经过10‑12次传代培养后，细胞逐步适应含10％血清DMEM培养基。在低血清培养基中添加0.5％葡萄糖、0.1％谷氨酰胺、0.08％L‑半胱氨酸和0.2％牛血清白蛋白，经过3～4次传代培养后，经电子显微镜观察，细胞形态饱满，生长状态良好。(此新型改良培养基以下简称10％改良DMEM培养基)

[0032]4.小反刍融合细胞扩大培养[0033]使用10％改良DMEM培养基，小号细胞瓶转接中号细胞瓶，CO2培养箱静置培养3天。按照细胞数40万个/mL的转接量，中号细胞瓶转接摇瓶，摇瓶装液量在20％左右，震荡培养箱培养2～3d。摇瓶震荡培养足够量后，转接上罐进行种子液悬浮培养。[0034]5.小反刍融合细胞10L种子罐悬浮培养[0035]使用10％改良DMEM培养基，按照细胞数40万个/mL的转接量进行摇瓶转接10L细胞生物反应器(种子罐)。生物反应器控制参数为装液量、转速、pH值、DO值、CO2值、温度等，10L反应器装液量在30％～40％之间；转速控制在80～90r/min；pH值控制在7.0～7.2范围内；DO值变化缓慢控制在50％以下；CO2值控制在5％左右，温度控制在(37±0.5)℃。培养时间为72h。培养结束后，取样孔取样并且细胞计数，计数结果为400～450万个/mL。[0036]6.小反刍融合细胞50L规模化中试生产[0037]使用10％改良DMEM培养基，按照细胞数50万个/mL的转接量进行种子罐转接50L细胞生物反应器。生物反应器控制参数为装液量、转速、pH值、DO值、CO2值、温度、罐压、补料等，50L反应器装液量在50％左右；转速控制在70～100r/min；pH值控制在7.0～7.2范围内；DO值变化控制在40％以下；CO2值前期控制在4％～5％左右；温度控制在(37±1)℃；罐压控制在0.1MPa左右；补料在培养56h后进行流加补充能量物质(碳源、氮源、氨基酸、生长因子等)，流加速度为200～300mL/h。培养周期在72～80h。培养结束后，取样孔取样并且细胞计数，计数结果为600～650万个/mL。

[0038]细胞液无菌环境下取出后进行离心处理，收集上清液进行纯化处理。

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实施例2——单抗的纯化和检测

[0040]使用直径350mm纯化柱和全自动纯化操作系统，准备注射用水、样品、平衡溶液[PB溶液(20mM、pH7.2)]、洗脱溶液[PB溶液(20mM、pH7.2)+NaCl溶液(0.5M、pH7.2)]、20％乙醇溶液等(以上溶液均使用0.45μL滤器进行除杂)。在纯化柱内加入填料(protein G)，加盖后进行排气，柱内无气泡后进行加压，待填料沉淀后进行手动压缩排空液体，装柱成功。按照全自动操作系统进行纯化，系统参数与操作流程：柱压控制在3～5MPa；注射用水冲洗柱子3次；平衡溶液过柱3个柱体积；样品(细胞上清液与PB溶液(20mM、pH7.2)等体积混匀液)进行上样；平衡溶液过柱3个柱体积；洗脱溶液上柱，收集洗脱峰的纯化浓缩液；注射用水冲洗柱子3次；20％乙醇溶液洗柱3次。

[0041]由于目前还没有小反刍兽疫病毒的标准血清和标准抗原，本研究采用小反刍兽疫病毒Clone9株纯化抗原液作为标准抗原，以10μg/mL浓度包被酶标板，用于测定单克隆抗体效价，对上清液与纯化液进行间接ELISA抗体值检测，检测结果在OD值1.0附近的稀释梯度为：上清液稀释倍数为512倍；纯化液稀释倍数为4000倍,。纯化液比上清液的抗体浓度提高了8倍。

[0042]实施例3——小反刍兽疫PPR‑N蛋白改良竞争ELISA抗体检测试剂盒[0043]本试剂盒在传统竞争ELISA试剂盒的基础上做以更精密的改进，传统竞争试剂盒样品与单抗同时加入包被板内，进行竞争表位反应，从而通过显色反应分辨阴阳性。但是传统竞争法存在以下问题：特异性结合过强、灵敏性不高、竞争压力下表位不稳定等现象，通过我们团队的不懈努力与尝试，成功研发出改良竞争ELISA检测方法。此改良方法优先样品与包被抗原反应，反应一段时间后，加入单抗进行竞争表位反应，此方法可以有效的降低竞争压力、减小特异性反应、增加灵敏性，样品可以更好与抗原进行结合、并且阴阳性界限范围更加宽广。

[0044]1.酶标板的制备

[0045]使用包被液(碳酸盐缓冲液，pH＝9.4～9.6)将阳离子填料纯化后的大肠杆菌表达小反刍兽疫病毒PPR‑N蛋白抗原进行比例稀释后包板，每个样孔100μL，4～8℃包被18～24h，用洗涤液(0.01mol/L的PBS，pH＝7.4，含0.2％Tween‑20)洗涤3次后，再加入含5％脱脂奶粉的PBS(0.01mol/L，pH＝7.4)封闭液37℃静置封闭1～2h。用含2.5％蔗糖的样品稀释液覆盖后晾干。静置烘干8h，抽空封装，置4℃保存。[0046]2.试剂盒其他成分的配置[0047](1)样品稀释液：0.01mol/l的PBS，pH＝7.4，含0.15％蔗糖和5％马血清。[0048](2)单抗竞争液：使用样品稀释液，将protein G填料纯化的单克隆抗体稀释512倍。[0049](3)酶标试剂：用稀释液将兔抗鼠酶标二抗稀释1:5000，即得酶标试剂。[0050](4)对照样品：使用合适滴度的羊抗小反刍兽疫的阳性血清作为阳性对照样品。使用胎牛血清作为阴性对照样品。[0051](5)标准阳性血清的制备:将小反刍兽疫灭活病毒抗原使用超滤离心管进行浓缩处理，选取通用免疫复合体微水胶佐剂(赛德奥)与浓缩抗原进行低速匀浆乳化制成灭活疫苗，采用颈部肌肉多点注射的方法进行免疫山羊。首免14天后进行加免，此后免疫间隔7‑8天。最后一次免疫后7～9日采血检测，羊血清抗体值采用间接ELISA检测试验进行测定，检

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测抗体值在1:2000以上，即可心脏采血提取血清，用于试剂盒的阳性标准血清。[0052](6)浓缩洗涤液(20×)：0.2mol/L的PBS，pH＝7.4，含2％Tween‑20。[0053](7)显示液：市售的显色A和显色B液。[0054](8)终止液：1mol/L H2SO4溶液。[0055]3.检测步骤[0056](1)检测前准备[0057]取30ml 10倍浓缩洗涤液，用去离子水稀释至300mL工作夜备用。对待检样品进行编号，并标记相应的检测孔，每次检测需设立2组阴、阳性对照孔。[0058](2)样品处理与加样[0059]取待检血清30μL，加入30μL的稀释液，充分混合后，取50μL加入到反应孔中。如需测定待检血清滴度，则使用样品稀释液对待检血清一定比例倍比稀释后再进行检测。[0060]将阴、阳性对照样品各取50μL，分别加入阴、阳性对照孔。[0061](3)孵育：密封后静置37℃反应30min后，再加入50μL单抗竞争液。密封后静置37℃反应20min后，弃反应液。[0062](4)洗板：每孔加入300μL洗涤液，室温静置4min，反复洗涤3遍。[0063](5)加二抗：分别在相应孔中加入100μL稀释后的酶标试剂。[0064]弃反应液。重复步骤(4)。(6)密封后静置37℃反应30min后，[0065](7)显色：将显色A和显色B液等比例混合，每孔加入新鲜配制的显色液100μL，置37℃培养箱避光显色10min。[0066](8)测定吸光值，每孔加入40μL终止液终止反应(终止时间不得超过15分钟)，采用450nm单波长测定各孔OD值。[0067](9)结果判定

[0068]PPRV‑N阴性血清的OD值即OD；酶标抗体对照OD值即nPPRV‑N阳性血清的OD值即ODc；ODp；样品OD值即ODs；

[0069]阳性血清抑制率PI(c/p)＝[(1‑OD/OD)×100]％cp

[0070]阴性血清抑制率PI(n/p)＝[(1‑OD/OD)×100]％np

[0071]阳性血清抑制率PI(s/p)＝[(1‑OD/OD)×100]％sp[0072]根据抑制率判断检测结果，PI(c/p)＞60％，PI(n/p)＜40％，试验结果有效；否则重新进行试验。[0073]判定：PI(s/p)＞50，结果为阳性；PI(s/p)≤50，结果为阴性。[0074]该试剂盒可灵敏、特异地检测的小反刍类动物血清中小反刍兽疫抗体。[0075]实施例4——小反刍融合传统竞争ELISA试剂盒检测方法

[0076]1.酶标板的制备和试剂盒其他成分的配置(同实施例4制备方法一致)。[0077]2.检测步骤[0078](1)检测前准备

[0079]取20mL浓缩洗涤液又用去离子水稀释至工作浓度，即400mL备用。对待检样品进行编号，并标记相应的检测孔，每次检测需应设阴、阳性对照孔。[0080](2)样品处理与加样[0081]取待检血清60μL，加入60μL的单抗竞争液，充分混合后，取100μL加入到反应孔中。

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如需测定待检血清滴度，则使用样品稀释液对待检血清一定比例倍比稀释后再进行检测。[0082]将阴、阳性对照样品各取60μL，分别加入60μL的单抗竞争液，混匀后取100μL分别加入阴、阳性对照孔，[0083](3)孵育：密封后置微量振荡器上中速室温振荡60min或37℃反应30min后，弃反应液。[0084](4)洗板、加酶标二抗、显色等环节(同实施例4的步骤相同)。[0085](5)测定吸光值，每孔加入100μL终止液终止反应，采用450nm(检测波长)/630nm(参考波长)双波长测定各孔OD值。[0086](6)结果判定

[0087]当阴性对照孔吸光值≥0.5，阳性对照孔吸光值≤0.1时，试验成立，否则需重新试验。

[0088]临界值：50％*阴性对照孔OD值；[0089]OD值＞50％*OD，阴性判定样品小反刍兽疫抗体阴性；[0090]OD值≤50％*OD，阴性判定样品小反刍兽疫抗体阳性。[0091]该试剂盒可灵敏、特异地检测的小反刍类动物血清中小反刍兽疫抗体。[0092]实施例5——本发明与传统竞争ELISA对比对检测试验[0093]羊场采集46个血清样品，对这些样品使用OIE推荐标准竞争ELISA试剂盒、传统竞争ELISA试剂盒和改良竞争ELISA试剂盒进行检测与比较。样品检测加样顺序为：A1～B1为空白对照、C1～D1为阴性对照、E1～F1为阳性对照；第2列往下往后依次为样品1～44号，从E7往下往后为1～44号的重复检测孔。

[0094]1.OIE推荐标准竞争ELISA试剂盒检测44个样品结果

[0095]通过OIE推荐标准竞争ELISA试剂盒进行样品OD值检测和阴阳性判定(按照试剂盒操作流程进行检测)，其结果表明：阳性样品18个和阴性样品26个，阴阳性数据差距范围显著；同步进行2次检验，重复率达到100％，标准竞争ELISA试剂盒稳定性良好(见表1)。[0096]表1标准竞争ELISA试剂盒检测结果

[0097]

[0098]

注：下划线为阳性样品

[0099]2.传统竞争ELISA试剂盒检测44个样品结果

[0100]通过传统竞争ELISA试剂盒进行样品OD值检测和阴阳性判定(按照实施例4的操作流程进行检测)，与OIE推荐标准竞争ELISA试剂盒结果对比表明：阳性样品2个，阴性样品42个，无法成功进行阴阳性界限判定，并且重复试验，相同样品数值差异较大，此传统竞争ELISA试剂盒无法进行检测(见表2)。

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说　明　书

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表2传统竞争ELISA试剂盒检测结果

[0102]

[0103]

注：下划线为阳性样品

[0105]3.改良竞争ELISA试剂盒检测44个样品结果

[0106]通过改良竞争ELISA试剂盒进行样品OD值检测和阴阳性判定(按照实施例4的操作流程进行检测)，与OIE推荐标准竞争ELISA试剂盒结果对比表明：阳性样品17个，阴性样品27个，成功进行阴阳性界限判定，符合率可达90％以上。并且重复性试验，相同样品数值差异较小，此改良竞争ELISA试剂盒研制成功，并且可以投入生产形成商业化产业(见表3)。[0107]表3改良竞争ELISA试剂盒检测结果

[0104]

[0108]

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注：下划线为阳性样品

[0110]4.通过三种不同试剂盒试验数据对比可以清晰发现，传统竞争法无法克服特异性较强的抗原与单抗结合，也不能提高灵敏性，阴阳性界限模糊，并且重复相同样品检测数据偏差较大；而改良竞争法成功克服了特异性问题，灵敏性也得到提高，阴阳性界限清晰，并且符合率与重复性都有良好体现。改良竞争法与传统竞争法在相同抗原、抗体和试剂的基础上，得到的试验结果却是千差万别。优化抗原抗体反映顺序、时间和空间，使用改良竞争体系减少了特异性结合力强和一抗灵敏性高等缺陷。试验数据证明改变检测工艺可以大大提升检测质量与效率。以标准竞争法检测数据为依据，改良竞争法的符合率高达90％以上、重复率高达98％以上，相同样品检测数据偏差极小，符合商品化生产标准。

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序　列　表

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序列表<110> 北京中海生物科技有限公司<120> 一种小反刍兽疫病毒PPR‑N蛋白单克隆抗体的制备及其应用<160> 1<170> SIPOSequenceListing 1.0<210> 1<211> 544<212> DNA<213> 按大肠杆菌密码子特征进行优化后的小反刍兽疫病毒N蛋白基因的主要抗原区序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

 1<400>

ggatcccgtc tggcatgtaa ggaggattac cgttacgcaa tcagcagcac caacgaaatc 60

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