分离胶与快速培养富集法在MALDI-TOF MS快速检测报阳血培养样本的方法学比较

血培养样本的方法学比较

方毅;张景皓;赵虎

【摘 要】目的 使用分离胶促凝管离心和细菌快速培养两种方法富集细菌,再采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)直接检测报阳血培养样本,分析比较两种方法的效果.方法 收集华东医院血培养阳性样本共209例,首先采用分离胶促凝管直接从报阳血培养瓶中富集细菌后直接采用MALDI-TOF MS进行检测;同时将从分离胶促凝管富集到的细菌再进行4h快速培养,采集培养后的菌苔用MALDI-TOF MS进行菌种鉴定;并对血培养报阳性的样本进行进一步的常规转种孵育,再使用Vitek 2 Compact全自动微生物分析系统(简称Vitek 2 Compact)对培养出的菌落进行菌种/属鉴别.比较以上三种方法鉴定结果的符合率.如果三种方法检测结果皆不同,就按照基因测序法的结果为准.结果 报阳血培养瓶中,革兰阴性杆菌主要是肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌和粘质沙雷菌,前两种富集方法种水平的总鉴定符合率分别是69.2％ (90/130)和77.7％ (101/130).革兰阳性球菌主要是金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌,前两种富集方法种水平的总鉴定符合率是57.0％ (45/79)和32.9％ (26/79).结论 革兰阴性杆菌两种前处理方法差异无统计学意义(P＞0.05);革兰阳性球菌采用分离胶促凝管富集细菌后直接用MALDI-TOF MS检测符合率较高(P＜0.05).分离胶促凝管离心富集细菌后采用MALDI-TOF MS进行直接鉴别报阳的血培养样本准确、快速,具有较高的临床应用价值. 【期刊名称】《老年医学与保健》 【年(卷),期】2018(024)006

【总页数】5页(P705-708,761)

【关键词】血培养;分离胶促凝管;快速培养;基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 【作 者】方毅;张景皓;赵虎

【作者单位】复旦大学附属华东医院检验科,上海200040;复旦大学附属华东医院检验科,上海200040;复旦大学附属华东医院检验科,上海200040 【正文语种】中 文

随着医疗科技水平的飞速发展和我国人口不断老龄化的现状，临床上侵入性治疗不断增多，同时各种广谱抗菌药物使用量也逐年增加，血流感染率与日俱增。有调查研究显示，血流感染导致的死亡率处于疾病死亡率的前10位 [1]。复旦大学附属华东医院是具有老年医学重点实验室的三甲综合医院，血培养送检的患者年龄大多在65岁以上。而老年人通常基础疾病较多、免疫功能低下并且侵袭性治疗应用较多，这些情况都容易导致血流感染频发。相较与其他疾病，患者病死率更高。目前对血流感染的病原体进行鉴别的金标准依然是血培养。但报阳后的血培养，传统方法是需要根据血培养报阳瓶的种类及涂片镜检结果选择不同的培养基进一步分离培养和生化表型鉴定，至少耗费1～2天时间，检验周期较长，不能及时向临床报告病原学结果，提供诊疗依据。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 (matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry，MALDITOF MS)相比较生化表型鉴定的方法，它鉴定分离培养后的纯菌落更加快速、准确[2-3]。本研究对两种血培养报阳样本的细菌富集方法进行比较，一种方法是分离胶促凝管富集法，另一种方法是分离胶促凝管富集后再快速培养4 h进行富集，之后采用MALDITOF MS进行直接鉴定，评估两种细菌富集方法鉴定的准

确性和符合性，以期提高血培养鉴定的速度，尽可能早地为临床提供诊疗依据。 1 材料与方法

1.1 样本来源 收集2017年4月—2017年12月复旦大学附属华东医院门急诊及住院部送检的老年患者（患者年龄为65～99岁之间）血培养的阳性样本209例（由于真菌生长较慢，经过4 h快速培养难以形成菌膜，故已剔除假阳性瓶和真菌瓶等），均为单一菌种感染的血培养瓶。

1.2 仪器与试剂 VERSATREK血培养仪和血培养瓶、核酸分析仪（型号：Thermo Nanodrop 2000）购自美国ThermoFisher公司；细菌基因组DNA抽提试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；VITEKMS质谱仪、质控菌株（大肠埃希菌 ATCC8739）、基质液（CHCA， -氰基-4-羟基肉桂酸）、靶板、巧克力平板、VITEK2 COMPACT及鉴定板条均购自法国Biomerieux公司；甲酸和乙腈购自德国SIGMA公司；Vacutainer分离胶促凝管来自BD公司；血琼脂和中国蓝平板来自科玛嘉公司。 1.3 方法

1.3.1 涂片染色镜检 从血培养仪中拿出仪器报阳瓶，抽取阳性样本涂片，干燥后进行革兰染色。通过镜下观察排除真菌感染的样本及血培养假阳性的样本并初步确定阳性样本中待检细菌的种类，同时记录结果。

1.3.2 菌种生化表型鉴定 将血培养报阳后通过镜检确认为细菌的样本转种血琼脂平板、中国蓝平板和巧克力平板，置于CO2环境中孵育18～24h。经过18～24h培养后的菌落处理：根据细菌的生长特征和镜检结果，选择正确的鉴定板条，采用VITEK2COMPACT进行鉴定，同时记录其中可信度最高的检测结果。

1.3.3 分离胶促凝管法富集细菌 将血培养阳性瓶混匀后，使用无菌注射器抽取5 mL阳性瓶内容物分别取2.5 mL注入两支分离胶促凝管中。3 000 rpm离心5 min。通过离心，多数有形杂质和血细胞到达分离胶的下部，倒掉上清液后在其上

部表面可发现的灰白色附着物，即为菌体复合物[4]。

1.3.4 快速培养法富集细菌 用无菌棉签挑取上述的一支分离胶促凝管内灰白色沉淀，直接转种巧克力平板，置于CO2环境中孵育4 h[5]。 1.3.5 MALDI-TOF MS的鉴定流程

1.3.5.1 分离胶促凝管法富集细菌前处理 用一次性棉签蘸取灰白色附着物，转移至含有300L去离子水的 EP管中。加入900L无水乙醇，震荡后在13 000rpm的条件下离心2min。弃上清液，加入50 L70%的甲酸裂解其细胞壁。并加入50L乙腈萃取蛋白，再次混匀后在13 000 rpm条件下离心2 min，取上清液备用 [4,6]。 1.3.5.2 点样 （1）取上清液1L加至质谱仪靶板孔位上，室温干燥后加入基质液，待样本全部干燥后放入MALDI-TOF MS仪器中鉴定。（2）经过4 h短期培养的平板，挑取少许菌苔直接涂布于靶板孔位上，立即加入配套基质液，待样本全部干燥后放入MALDITOF MS仪器中鉴定。Vitek MS质谱结果判读标准：绿色表示唯一的鉴定结果，可信度60.0%～99.9%；黄色则代表有2～4个可疑菌，可信度＞60.0%，应该进一步鉴别；红色就表示无法鉴别，可信度＜60.0%，与数据库中所有的峰图都不一样[7]。参数设置：鉴定率在60.0%～99.9%认为鉴定结果可靠。 1.3.6 测序法菌种确认 若三者的鉴定结果都不相同，则使用测序法确认病原菌种类。 1.3.6.1 引物设计由上海桑尼公司合成细菌的通用引物F：5

AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3；R：5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3。 1.3.6.2 DNA的抽取 将三种方法鉴定结果均不相同菌株，采用细菌基因组DNA提取试剂盒抽提菌株样本DNA。使用核酸浓度测定仪测定抽提的DNA浓度后在-20℃条件下冻存。

1.3.6.3 测序聚合酶链反应 (polymerasechainreaction,PCR)扩增：扩增体系的总体积为25L，每个反应体系DNA模板为1L。扩增条件：热循环参数为94℃预变性3 min；94℃30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，共30个循环；72℃延伸

5 min。PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳后,使用凝胶成像分析仪（北京六一仪器厂 WD9413B）观察条带，割胶回收 PCR产物，送上海桑尼生物科技有限公司进行测序。测序结果用NCBIBLAST进行比对，判定细菌种类，将细菌划分到属或种。

1.3.7 统计学分析 使用Stata14.0统计软件统计分析，二分类变量及无序多分类变量使用2检验。以 P＜0.05为差异有统计学意义。 2 结果

2.1 分离胶促凝管富集法Vitek MS质谱仪直接鉴定结果 在本实验中，把标识绿色的检测结果作为209份报阳血培养样本的质谱检测结果。见表1。

2.2 4 h快速培养法Vitek MS质谱仪鉴定结果 在本实验中，同样仅将绿色的鉴定结果作为209份阳性样本的质谱鉴定结果。见表1。

2.3 传统培养鉴定结果 Vitek2Compact对血培养阳性样本分离培养后的菌株能够鉴定到种，且该样本菌种的鉴定百分率在95%以上，表示其鉴定结果可靠。见表1。

表1 单菌株血流细菌感染鉴定结果注：*杰士棒杆菌用分离胶促凝管联合MALDI-TOF MS鉴定结果正确，而Vitek 2 Compact鉴定结果被错误地鉴定为玫瑰库克菌，用测序法确认是杰士棒杆菌菌株 株数分离胶促凝管富集法 短期培养法 Vitek 2 Compact种水平鉴定准确率%鉴定错误率%未检出率%种水平鉴定准确率%鉴定错误率%未检出率%种水平鉴定准确率%鉴定错误率%未检出率%革兰阴性杆菌肺炎克雷伯菌大肠埃希菌粘质沙雷菌鲍曼不动杆菌铜绿假单胞菌阴沟肠杆菌克氏柠檬酸杆菌伊丽莎白败血杆菌琼氏不动杆菌摩根摩根菌洛菲不动杆菌流感嗜血杆菌产气肠杆菌粪产碱假单胞菌人苍白杆菌产吲哚黄杆菌奇异变形杆菌革兰阳性球菌金黄色葡萄球菌表皮葡萄球菌溶血葡萄球菌粪肠球菌人葡萄球菌屎肠球菌头状葡萄球菌草绿色链球菌口腔链球菌停乳链球菌藤黄微球菌科氏葡萄球菌*杰士棒杆菌130 47

27 17 9 9 5 3 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 7 9 20 16 9 9 7 5 4 2 2 2 1 1 1 69.2 80.9 85.2 70.6 11.1 77.8 60.0 100.0 0.0 0.0 100.0 0.0 0.0 100.0 0.0 0.0 0.0 0.0 57.0 55.0 37.5 66.7 88.9 42.9 100.0 50.0 0.0 50.0 50.0 100.0 0.0 100.0 5.4 8.5 0.0 0.0 0.0 11.1 20.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100.0 12.6 20.0 12.5 11.1 0.0 14.2 0.0 0.0 100.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 25.4 10.6 14.8 29.4 88.9 11.1 20.0 0.0 100.0 100.0 0.0 100.0 100.0 0.0 100.0 100.0 100.0 0.0 30.4 25.0 50.0 22.2 11.1 42.9 0.0 50.0 0.0 50.0 50.0 0.0 100.0 0.0 77.7 85.2 80.9 44.4 0.0 0.0 100.0 88.9 100.0 0.0 100.0 0.0 40.0 50.0 100.0 0.0 100.0 100.0 32.9 0.0 11.1 35.0 25.0 100.0 60.0 0.0 0.0 0.0 50.0 0.0 14.3 0.0 6.9 0.0 8.5 0.0 100.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 50.0 60.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 16.5 0.0 22.2 5.0 18.7 0.0 0.0 50.0 100.0 0.0 0.0 0.0 28.6 0.0 15.4 14.8 10.6 55.6 0.0 100.0 0.0 11.1 0.0 100.0 0.0 50.0 0.0 50.0 0.0 100.0 0.0 0.0 50.6 100.0 66.7 60.0 56.3 0.0 40.0 50.0 0.0 100.0 50.0 100.0 57.1 100.0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 98.7 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1.3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

2.4 测序结果 两种VitekMS质谱仪鉴定方法与Vitek 2 Compact三者不一致的鉴定结果，以基因测序的结果予以确证。Vitek2Compact将1例杰士棒杆菌错误鉴定为玫瑰库克菌。

2.5 三种鉴定方法的符合率 经过统计，此209例血培养阳性样本中检出率前三位的革兰阴性杆菌是肺炎克雷伯菌，大肠埃希菌和粘质沙雷菌；分离胶促凝管联合MALDI-TOF MS和短期培养联合MALDI-TOF MS革兰阴性杆菌的鉴定符合率分别是69.2%和77.7%(P＞0.05)；血流感染检出率前三位的革兰阳性球菌是金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌，分离胶促凝管联合 MALDI-TOF MS和

短期培养联合MALDI-TOF MS革兰阳性球菌的鉴定符合率分别是57.0%和 32.9%(P＜0.05)，见表 1。 3 讨论

复旦大学附属华东医院是具有老年医学特色的综合性医院，患者群体主要为老年人。因老年患者本身往往免疫功能相对低下，加上患有较多且较为严重的基础性疾病，较其他患者更易患血流感染，且病死率很高。若能够采用快速、准确鉴定血流感染病原菌的方法，可让临床医师在患者感染早期得到病原学诊断依据，及时采用正确的抗菌药物进行治疗，则可以大大降低血流感染患者的病死率。在我国主要城市的三级甲等医院中，最常见的可导致患者血流感染的细菌依次为凝固酶阴性葡萄球菌、大肠埃希菌、和克雷伯菌属[8]。我院老年患者血流感染细菌排名前三的是肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌。本次研究结果和全国统计结果报道有所不同，考虑其原因同我院患者与其他报道患者的年龄差异有关。

MALDI-TOF MS是近几年应用于临床微生物鉴定的新方法，具有鉴定准确、快速、操作简单和经济的特点[9-11]。MALDI-TOFMS鉴定微生物的主要原理是检测已知微生物菌种的蛋白质图谱建立数据库后，将待检样本的蛋白质图谱与数据库中的参考图谱比对后可以得到鉴定结果 [11]。

有国外报道，在固体培养基上用短期快速培养法培养报阳血培养瓶的沉淀物，然后进行鉴定和药敏试验，其血培养的周转时间（从抽血到最终结果报告），从传统方法83.1h到现在的61.4h，共减少了21.7h[12]。国内已有采用分离胶试管法富集报阳血培养瓶中细菌后，再采用 MALDI-TOF MS直接鉴定细菌的报道，大大缩短了鉴定的时间[4]。采用分离胶法富集细菌后，是否需要转种培养进一步提升鉴定的准确率这是本文所要研究的内容。

本研究采用分离胶法、以及进一步采用快速培养法富集报阳血培养瓶内细菌，再使用MALDI-TOFMS进行直接鉴定。对于革兰阴性杆菌，因其生长速度较快，可以

在短期（4h）培养形成一定数量的菌苔（细菌的数量较分离胶富集法高），故MALDI-TOFMS鉴定的准确率较仅采用分离胶富集法高，但无显著性差异（P＞0.05）。而对于革兰阳性球菌，因其生长速度较缓慢，短期（4h）培养后尚不能产生一定菌量的菌苔，不足以达到MALDI-TOFMS鉴定的最低检出限，故鉴定的准确率反而较分离胶富集法低，两者差异有统计学意义（P＜0.05）。

本实验已经剔除了真菌感染的阳性瓶，主要是因为真菌的生长周期较慢，经过短期培养，形成的菌膜根本不能达到质谱仪的最低检出限，鉴定的准确率非常低。在今后的实验研究中，将着重于如何提高血培养真菌阳性样本使用质谱直接鉴定的准确率，可以通过文献的搜集和进一步实验方法的改进来优化直接鉴定阳性样本前真菌的富集流程。老年患者由于基础疾病较多，例如糖尿病患者体内高糖环境可为真菌提供适宜的生存环境，使得真菌感染率增加，并且血流感染中真菌感染比细菌感染者治疗更加困难、致死率更高，所以快速准确地为临床诊疗提供真菌病原学依据非常重要。

本次实验共收集阳性样本209例，由于样本总量较少，部分少见菌数量不足导致统计结果有偏差，故本实验结果仅供参考。但从本次实验仍可以看出，分离胶促凝管直接离心法联合质谱 (MALDI-TOF MS)技术，是目前较为快速的一种直接鉴定阳性血培养样本中病原菌的方法，可以进一步提高质谱直接鉴定血培养阳性样本中病原菌的能力，尤其针对革兰阴性杆菌，其鉴定的准确率较高，可以基本满足临床早期诊断与干预血流感染的需求。 参考文献

【相关文献】

[1] Kochanek KD,Xu J,Murphy SL,et al.Deaths:preliminary data for 2009[J].Natl Vital Stat Rep,2011,59(4):1-51.

[2] Tanaka T,Oliveira LMF,Ferreira BFA,et al.BactecTMblood culture bottles allied to MALDI-TOF mass spectrometry:rapid etiologicdiagnosis of bacterial endophthalmitis[J].DiagnMicrobiol Infect Dis,2017,88(3):222-224.

[3] Angeletti S.Matrix assisted laser desorption time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF MS)in clinical microbiology[J].J Microbiol Methods,2017,138:20-29.

[4]陈峰,李媛睿,皇甫昱婵,等.分离胶促凝管联合MALDI-TOF MS直接检测血培养阳性细菌 [J].检验医学,2015,30(2):113-121.

[5] Kohlmann R,Hoffmann A,Geis G,et al.MALDI-TOF mass spectrometry following short incubation on a solid medium is a valuable tool for rapid pathogen identification from positive bloodcultures[J].IntJ MedMicrobiol,2015,305(4-5):469-479.

[6] Febbraro F,Rodio DM,Puggioni G,et al.MALDI-TOF MS versus VITEK?2:comparison of systems for the identification ofmicroorganisms

responsibleforbacteremia[J].CurrMicrobiol,2016,73(6):843-850.

[7] 黄声雷,胡必杰,陈蓉,等.两种MALDI-TOF MS系统快速鉴定血培养中白念珠菌以外酵母样真菌[J].检验医学,2015,30(2):128-131.

[8] 李光辉,朱德妹,汪复,等.2012年中国CHINET血培养临床分离菌的分布及耐药性 [J].中国感染与化疗杂志,2014,14(6):474-481.

[9]IdelevichEA,Grünastel B,PetersG,et al.Directbloodculturing on solid medium

outperforms an automated continuously monitored broth-based blood culture system in terms of time to identificationandsusceptibilitytesting[J].NewMicrobesNew Infect,2015,10:19-24.

[10]蒋月婷,黎健成,易建云,等.分离胶辅助VITEK-MS质谱仪快速鉴定血培养阳性菌的方法学研究 [J].国际检验医学杂志,2016,37(15):2071-2073.

[11]中国临床微生物质谱共识专家组.中国临床微生物质谱应用专家共识 [J].中华医院感染学杂志,2016,26(10):前插1-前插 4.

[12]Mauri C,Principe L,Bracco S,et al.Identification by mass spectrometry and automated susceptibility testing from positive bottles:a simple,rapid,and standardized approach to reduce the turnaround time in the management of blood cultures[J].BMC Infect Dis,2017,17(1):749.