・２７６・ 中国真菌学杂志２００８年ｌ０月第３卷第５期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｍｖｃｏｌ，Ｏｃｔｏｂｅｒ ２００８，Ｖｏｌ ３．Ｎｏ．５ ・论著・ 临床常见镰刀菌的鉴别 窦红涛 李若瑜 万哲 李然 孙旭光 ｉ、定方 王端礼 （１．北京大学第一医院皮肤科，北京１０００３４；２．首都医科大学同仁眼科中心，北京１００００５） 【摘要】 目的从分子生物学角度寻找一种快速准确鉴定临床常见镰刀菌的方法。方法 将受试镰刀菌接种于ＰＤＡ培 养基，观察其菌落及镜下形态，在此基础上ＰＣＲ扩增受试镰刀菌的ｒＤＮＡ ＩＴＳ并测其序列，在ＧｅｎＢａｎｋ核酸序列数据库进行 同源序列搜索及分析。选择性内切酶Ｄｒａ ｌＩ和ＣＭ３ Ｉ进行ＲＦＬＰ。设计了茄病镰刀菌的种特异性引物Ｓｏｌ 、Ｓｏｌ ，初步 验证其特异性。结果形态学鉴定结果显示，茄病镰刀菌所占比例最高，除２株串珠镰刀菌外，其余镰刀菌ＩＴＳ序列分析的 ｒＤＮＡ ＩＴＳ序列测定及其ＰＣＲ—ＲＦＬＰ可用于初步鉴别几种临床常见镰刀菌，合适的 结果与形态学鉴定结果一致。茄病、层生和串珠镰刀菌的Ｄｒａ ＩＩ、Ｃｆｒｌ３ Ｉ酶切带形互不相同。用Ｓｏｌ 、Ｓｏｌ 扩增受试菌的ｒＤ— ＮＡ ＩＴＳ，只有茄病镰刀菌为阳性。结论种特异性引物可以初步快速鉴定茄病镰刀菌。 【关键词】镰刀菌；内转录间隔区（ＩＴＳ）；序列测定；性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）；种特异性引物 【中图分类号】 Ｒ ３７９．９ 【文献标识码】 Ａ 【文章编号】 １６７３—３８２７（２００８）０５－０２７６－０４ Ｉｄｅｎｔｉｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ ｉｆｍｐｏｒｔａｎｔ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｐ． ＤＯＵ Ｈｏｎｇ—ｔａｏ ，ＬＩ Ｒｕｏ—ｙｕ ，ＷＡＮ Ｚｈｅ ，ＬＩ Ｒａｎ ，ＳＵＮ Ｘｕ—ｇｕａｎｇ ，ＢＵ Ｄｉｎｇ—ｆａｎｇ ，ＷＡＮＧ Ｄｕａｎ—ｌｉ （１．Ｄｅｐｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｐｅｋｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００３４；２．Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｔｏｎｇｒｅｎ Ｅｙｅ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｃａｐｉｔａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １００００５，Ｃｈｉｎａ） 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｆｎｄ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｒｅｌｉａｂｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｍｅｄｉｃａｌｌｙ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｐ．．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ＦｕｓａｒｉＭ，ｎ ＤＰ．ｔｅｓｔｅｄ ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｏｎ ＰＤＡ．Ｔｈｅｉｒ ＩＴＳ ｏｆ ｒＤＮＡ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｅｒｅ ｓｅ－ ｑｕｅｎｃｅｄ．ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗｅｒｅ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｂａｎｋ ｏｆ ｔｈｅ ＧｅｎＢａｎｋ．Ｅｎｄｏｕｕｃｌｅａｓｅ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｄｒａ ＩＩ ａｎｄ Ｃｆｒｌ３ １ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｔｏ ｐｅｒｆｏｒｍ ＲＦＬＰ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ａ ｐａｉｒ ｏｆ ｓｐｅｃｉｅｓ—ｓｐｅｃｉｉｆｃ ｐｒｉｍｅｒｓ—Ｓｏｌｌ ａｎｄ Ｓｏｌ２ ｏｆＦ．ｓｏｌａｎｉ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｓＤｅｃｉｆｉｃｉｔｖ ｗｅｒｅ ｔｅｓｔｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｏｌａｎｉ ｗｅｒｅ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ．Ｔｈｅ ｓｅ— ｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＩＴＳ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ｃｏｉｎｃｉｄｅｎｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅｉｒ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｅｓ ｅｘｃｅｐｔ ｔｗｏ Ｆ．ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ．Ｔｈｅ ＲＦＬＰ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｓｏｌａｎｉ． Ｆ．ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ ａｎｄ Ｆ．ｐｒｏｌ ｒａｔｕｍ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ Ｄｒａ ＩＩ ａｎｄ Ｃｆｒｌ ３ １ ｗｅｒｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｒｏｍ ｅａｃｈ ｏｔｈｅｒ．Ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｅｓ—ｓｐｅｃｉｉｆｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｃａｎ ｏｎｌｙ ａｍｐｌｉｆｙ ｒＤＮＡ ｏｆ Ｆ．ｓｏｌａｎｉ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ ＰＣＲ—ＲＦＬＰ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｒＤＮＡ ＩＴＳ ｃａｎ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｓｏｍｅ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｐ．．Ａｐｐｒｏ— ｐｒｉａｔｅ ｓｐｅｃｉｅｓ—ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｒａｐｉｄｌｙ． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】 Ｆｕｓａｒｉｕｍ；ＩＴＳ；ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ；ＲＦＬＰ；ｓｐｅｃｉｅｓ—ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｈｉｎ Ｊ Ｍｙｃｏｌ，２００８，３（５）：２７６—２７９］ 镰刀菌 （Ｆｕｓａ ｒｉｕｍＬｉｎｋｅｘＦｒ．）属于有丝 孢子真菌（Ｍｉｔｏｓｐｏｒｉｃ ｆｕｎｇｉ，旧称半知菌Ｉｍｐｅｒ— ｆｅｅｔ ｆｕｎｇｉ），广泛存在于土壤中和植物上，属于条件 致病菌，临床上常见的是引起角膜炎 ，还可引起 甲真菌病 等浅部感染，免疫力低下患者可致严重 的系统性感染 甚至危及生命。传统的分类鉴定 基金项目：卫生部临床学科重点项目（２００３－２００６） 作者简介：窦红涛，男（汉族），硕士，主管技师．Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｏｎｇｔａｏｄｕｕ ＠ｓｉｎａ．ＣＯＩｌｌ 通讯作者：李若瑜，Ｅ—ｍａｉｌ：１ｕｗｄｈ＠ｐｕｂｌｉｃ．ｂｔａ．ｎｅｔ．ｃｎ ：２００８年ｌ０月第３卷第５期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｍｙｃｏｌ，Ｏｃｔｏｂｅｒ ２００８，Ｙ ， ． 依靠其形态特征，比较费时，常常需要２～３周才能 得到最终结果，有时培养物不典型或不产孢，使得 鉴定困难，延误治疗。本实验在形态学鉴定的基础 镰刀菌、１株层生镰刀菌和１株半裸镰刀菌的ｒＤ— ＮＡ ＩＴＳ序列在ＧｅｎＢａｎｋ核酸序列数据库进行同 源序列搜索，并与ＧｅｎＢａｎｋ核酸序列数据库中已 知的标准镰刀菌株的ｒＤＮＡ ＩＴＳ序列进行序列比 上，从分子生物学角度探讨快速准确鉴定临床常见 镰刀菌的方法。 １材料与方法 １．１ 实验菌株 标准株购自中国科学院微生物研究所普通微 生物菌种保藏管理中心（ＣＧＭＣＣ）。６８株镰刀菌 来自同仁医院眼科研究所２０００年７月～２００１年 １２月间角膜真菌感染患者，其余３Ｏ株镰刀菌和１１ 株非镰刀菌（白念珠菌、毛霉、弯孢霉、烟曲霉、青 霉、拟青霉、枝顶孢霉、链格孢霉、絮状表皮癣菌、卡 氏枝孢霉及红色毛癣菌等各１株）均为北京大学第 一医院真菌中心保存菌种。 １．２形态学大培养 受试镰刀菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基 （ＰＤＡ）斜面上，２５℃黑暗培养１０ ｄ后观察菌落形 态并照相。 １．３形态学小培养（钢圈法） 培养基用ＰＤＡ，２５℃黑暗培养，每天观察其镜 下形态，一般培养至７ ｄ左右即可观察到较多的 大、小分生孢子等，用微分干涉反差显微镜照相。 １．４ ｒＤＮＡ ＩＴＳ基因ＰＣＲ扩增及测序 用氯化苄法 提取ＤＮＡ，用真菌通用引物 ＩＴＳｌ Ｌ ６］、ＩＴＳ４扩增ｒＤＮＡ基因ＩＴＳ。ＩＴＳｌ、ＩＴＳ４序 列分别为ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ（１９ ｂｐ） 和ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ（２０ ｂｐ）。ＰＣＲ 反应体系（２５ Ｌ）：（１０ Ｘ）缓冲液（含１５ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｍｇ“）２．５ ＩｘＬ，ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、 ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ各２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ）１ Ｌ，弓Ｉ物ＩＴＳ】、 ＩＴＳ４各１ ｔｚＬ，ＴａｑＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５ Ｕ／ｔｘＬ）０．２５ Ｌ，模板１ ｔｘＬ，三蒸水１８．２５ ＩｘＬ。ＰＣＲ反应条 件：９５ ｃ（＝变性３ ｍｉｎ；９５℃变性３０ Ｓ，５８ ｏＣ退火３０ Ｓ，７２ｃｃ延伸１ ｍｉｎ，共３０个循环；７２℃延伸１０ ｍｉｎ。检测ＰＣＲ产物：取５ Ｌ产物加１ Ｌ ６× 溴酚蓝上样缓冲液，于含溴化乙锭（ＥＢ）的１％ 琼脂糖凝胶上１００ Ｖ电泳１ ｈ后，在紫外灯下观 察。用玻璃奶试剂盒将ＰＣＲ产物（１００ Ｌ）纯 化后送博亚公司测序。 １．５ ｒＤＮＡ ＩＴＳ序列分析、比较 ９株茄病镰刀菌、９株串珠镰刀菌、１株尖孢 较。 １．６ ＰＣＲ．ＲＦＬＰ 通过网站（ｈｔｔｐ：／／ｆｉｒｓｔｍａｒｋｅｔ．ｃｏｒｎ／ｃｕｔｔｅｒ／ ｃｕｔ２．ｈｔｍ１）得到几种不同镰刀菌ｒＤＮＡ ＩＴＳ序列的 性内切酶位点，并比较其酶切位点的差异。 茄病镰刀菌ｒＤＮＡ ＩＴＳ序列中的Ｄｒａ ＩＩ酶切 位点有两个分别在１００ ｂｐ左右和３００ ｂｐ左右，而 其他镰刀菌ｒＤＮＡ ＩＴＳ仅在１００ ｂｐ左右有一个酶 切位点。取１０ Ｌ ＰＣＲ扩增产物，２ Ｌ缓冲液， ０．５ ｔｘＬ Ｄｒａ ＩＩ，用无菌水补齐至２０ Ｌ，混匀后， ３７ｑＣ作用２ ｈ。采用２％的琼脂糖，１００ Ｖ电泳５０ ｍｉｎ后紫外灯下观察并照相。９株茄病镰刀菌、１ 株串珠镰刀菌、１株尖孢镰刀菌、１株层生镰刀菌 和１株半裸镰刀菌的ｒＤＮＡ ＩＴＳ用Ｄｒａ ＩＩ进行了 ＰＣＲ—ＲＦＬＰ。 Ｃｆｒｌ３ Ｉ在茄病、层生、串珠和尖孢镰刀菌ｒＤＮＡ ＩＴＳ序列中的酶切位点不同。取１Ｏ Ｌ ＰＣＲ扩增 产物，１０ Ｘ Ｋ缓冲液２ ＩｘＬ，０．５ Ｌ Ｃｆｒｌ３ Ｉ，用无菌 水补齐至２０ Ｌ，混匀后，３７￣Ｃ作用２ ｈ。采用２％ 的琼脂糖，１００ Ｖ电泳５０ ｍｉｎ后紫外灯下观察并照 相。１株茄病镰刀菌、２株串珠镰刀菌、１株尖孢镰 刀菌和３株层生镰刀菌的ｒＤＮＡ ＩＴＳ用Ｃｆｒｌ３ Ｉ进 行了ＰＣＲ．ＲＦＬＰ。 １．７茄病镰刀菌种特异性引物的研究 引物设计 利用网上序列分析软件（ｈｔｔｐ：／／ ＷＷＷ．ｅｂｉ．ａｅ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａ１．Ｗ）比较多株茄病镰刀菌及 与其他种镰刀菌ｒＤＮＡ ＩＴＳ序列问的种内、种间差 异，利用ｐｒｉｍｅｒ３软件（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｅｂ． ｕｍａｓｓｍｅｄ．ｅｄｕ／ｂｉｏａｐｐｓ／ｐｒｉｍｅｒ３一ＷＷＷ．ｃｇｉ）设计出 一对引物：Ｓｏｌ 和Ｓｏｌ：，其序列如下，Ｓｏｌ ：５‘一ＣＣＧＣ— ＣＡＧＡＧＧＡＣＣＣＣＴＡＡＣＴ一３’，２０ ｂｐ，Ｓｏｌ２：５‘一ＴＧＴＧＣ－ ｃＣＡ／ＧＣＡＧＧＧＧＧＣｒｒｒ一３’，１ ８ ｂｐ，第八位碱基为Ａ／ Ｇ，退火温度为６１ｃｃ。 特异性实验 模板验证，用真菌通用引物 ＩＴＳ 、ＩＴＳ ＰＣＲ扩增茄病镰刀菌２０株，串珠镰刀菌 １０株，层生镰刀菌３株，尖孢镰刀菌１株，半裸镰 刀菌１株，白念珠菌、毛霉、弯孢霉、烟曲霉、青霉、 拟青霉、枝顶孢霉、链格孢霉、絮状表皮癣菌、卡氏 枝孢霉及红色毛癣菌等各１株的ｒＤＮＡ ＩＴＳ，ＰＣＲ ２００８年ｌ０月第３卷第５期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｍｙｃｏ１．Ｏｃｔｏｂｅｒ ２００８．Ｖｏｌ ３．Ｎｏ．５ 扩增条件同前。用种特异性引物Ｓｏｌ，、Ｓｏｌ 扩增上 述菌种的ｒＤＮＡ ＩＴＳ。ＰＣＲ反应体系（２５ ｐ，Ｌ）：１０ ×缓冲液（含１．５ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｍｇ ）２．５ Ｌ，ｄＮＴＰ （ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ各２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ）１ Ｌ，弓Ｉ 物Ｓｏｌｌ和Ｓ０ｌ２各１ Ｌ，Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５ Ｕ／ ｐ，Ｌ）０．２５ Ｌ，模板１ Ｌ，三蒸水１８．２５ ｔｘＬ。ＰＣＲ 反应条件：９５ ｃ（＝变性３ ｒａｉｎ；９５℃变性３０ Ｓ，６１ ｏＣ退 火３０ Ｓ，７２℃延伸３０ Ｓ，共３Ｏ个循环；７２ｃ（＝延伸５ ｍｌｎ ２结 果 ２．１形态学鉴定结果 茄病镰刀菌５３株（７７．９％），串珠镰刀菌１３ 株（１９．１％），尖孢镰刀菌和半裸镰刀菌各１株 （各占１．５％）。ＢＭＵ１９３４、１９３６、１９３７和１９３９为茄 病镰刀菌，１９３８为尖孢镰刀菌，１９７４为半裸镰刀 菌，２０１ｌ、２０２３和２０２７为串珠镰刀菌。茄病镰刀菌 的菌落及镜下形态：大分生孢子比较粗壮，小分生 孢子通常以假头状着生，其分生孢子梗较长，产孢 细胞多大于２５ ｍ以上（见图１～３）。 ２．２ ｒＤＮＡ ＩＴＳ序列分析 ９株茄病镰刀菌同源序列搜索的结果一致，均 为茄病镰刀菌；ＢＭＵＯ１９３８的结果为尖孢镰刀菌； ＢＭＵ０１９０６的结果为层生镰刀菌。９株串珠镰刀菌 中有２株——ＢＭｕ０ｌ２７０与ＢＭＵ０２０１１的同源序 列搜索的结果为层生镰刀菌。 ２．３ ＲＦＬＰ分析 Ｄｒａ Ｉ１分析，茄病镰刀菌的酶切带形与其他镰 刀菌的不一致，茄病镰刀菌被切成两条带（实际上 是三条带，一条约１００ ｂｐ，两条带约２００ ｂｐ有重 叠）；串珠镰刀菌、层生镰刀菌及尖孢镰刀菌被切成 两条带，一条约１００ ｂｐ，一条约４００ ｂｐ（见图４）； Ｃｆｒｌ３ １分析，茄病镰刀菌、层生镰刀菌、串珠镰刀菌 的Ｃｆｒｌ３ Ｉ酶切带形不同（见图５）。 ２．４ Ｓｏｌｌ、Ｓｏ１２扩增茄病镰刀菌的特异性 用真菌通用引物ＩＴＳ．、ＩＴＳ ＰＣＲ扩增２０株茄 病镰刀菌，ｌ０株串珠镰刀菌、３株层生镰刀菌，１株 尖孢镰刀菌，１株半裸镰刀菌，白念珠菌、毛霉、弯 孢霉、烟曲霉、青霉、拟青霉、枝顶孢霉、链格孢霉、 絮状表皮癣菌、卡氏枝孢霉及红色毛癣菌等各１株 的ｒＤＮＡ ＩＴＳ，结果均为阳性（见图６）。用茄病镰 刀菌种特异性引物Ｓｏｌｌ、Ｓｏ１２扩增上述菌株的ｒＤ— ＮＡ ＩＴＳ，只有茄病镰刀菌为阳性，余者为阴性（见 图７）。 ３讨 论 近年来，由于广谱抗生素、糖皮质激素和免疫 抑制剂的广泛应用，使真菌性角膜炎的发病率明 显增高，而镰刀菌是人类真菌性角膜炎的主要致 病菌。镰刀菌的鉴定主要依靠形态学，此外也有 非传统的方法如血清学，电泳核型分析 Ｊ、 ＰＣＲ 、ＰＣＲ—ＲＦＬＰ Ｊ、ＤＮＡ序列测定ｌ１０ ３等，但很 少正式应用于临床菌种鉴定和诊断。本研究从分 子生物学角度研究了几种临床常见镰刀菌的鉴别 方法，对于进一步寻找快速鉴定镰刀菌的方法有 一定的积极意义。本实验最初通过形态学特征初 步鉴定的２株串珠镰刀菌经ＩＴＳ序列同源性搜索 的结果为层生镰刀菌，说明形态学鉴定有一定的 局限性，有条件应结合分子生物学方法使鉴定更 为精确。 茄病镰刀菌的大分生孢子较粗壮，小分生孢 子多呈假头状排列，虽然某些镰刀菌也有假头结 构，但是它们的产孢细胞较短，而茄病镰刀菌的产 孢细胞较长，一般都大于２５ ｍ。性内切酶 Ｄｒａ ＩＩ在茄病镰刀菌ｒＤＮＡ ＩＴＳ序列中有两个酶切 位点，分别位于１００ ｂｐ左右和３００ ｂｐ左右处，而 其他镰刀菌ｒＤＮＡ ＩＴＳ序列仅在１００ ｂｐ左右处有 一个酶切位点，所以茄病镰刀菌的Ｄｒａ ＩＩ酶切带 型不同于其他受试镰刀菌。串珠镰刀菌与层生镰 刀菌的菌落及镜下形态很相似，本实验用性 内切酶Ｃｆｒｌ３ Ｉ对其ＩＴＳ ＰＣＲ扩增产物进行了酶 切反应，可见其Ｃｆｒｌ３ Ｉ酶切带型不同，尖孢镰刀 菌与串珠镰刀菌的Ｃｆｒｌ３ Ｉ酶切带型相近，串珠、 层生及茄病镰刀菌三者的Ｃｆｒｌ３ Ｉ酶切带型各不 相同。Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ等国际核酸序列数 据库中有关镰刀菌属许多种的ＩＴＳ序列，所以可 通过测定镰刀菌ｒＤＮＡ基因ＩＴＳ序列来辅助鉴定 镰刀菌。ｒＤＮＡ ＩＴＳ的序列测定、Ｃｆｆｌ３ Ｉ和Ｄｒａ ＩＩ ＲＦＬＰ及种特异性引物用于临床镰刀菌的研究国 内缺乏，国外尚不多见。 本研究形态学鉴定的结果显示，茄病镰刀菌在 人类真菌性角膜炎中的最为常见，我们设计的茄病 镰刀菌种特异性引物对于快速诊断由茄病镰刀菌 引起的真菌性角膜炎具有一定的意义，但其特异 性、敏感性及其是否可直接用于临床标本的检测都 有待进一步验证。 2008年10月第3卷第5Octobel2008．Vol3．No．5279910II12l314M500200100500100o234567IoMl23456710516图7d7、1茄病镰刀菌菌落形态(PDA，25℃培养10d)：a．正面b背面，．图2，茄病镰刀菌的大分生孢子(箭头处)(PDA培养7d，，x400倍，250C培养，)图3茄病镰刀菌的假头(a)及厚壁孢子(b)(PDA、、、、，×400倍25％)、图44、DraII、酶切图谱：M泳道为、100bpladder、、13、、5、9r泳道分别为茄病串珠层生尖孢半裸镰刀菌DNAITSPCRrDNAITS的DraII酶切带型；l26，、8lO5泳道分别茄病串珠层生尖孢半裸镰刀菌、的r扩增产物图5，Cfrl3I4酶切图谱：M泳道为，100bpladder，为尖孢3和为串珠，7、9和11为层生，13为茄病镰刀菌的ITS．、DNAITSPCR2为尖孢扩增产物；100bpladder，，和6为串珠8、10、和11、为层生、14、为茄病镰刀菌的，Cfr131，酶切带型，图6，种间属间的、ITS。的扩增：M泳道为，，l～16泳道分别为茄病串珠层生尖孢半裸镰刀菌白念珠菌毛霉弯孢霉烟曲霉青霉拟青霉枝顶孢，，，霉链格孢霉絮状表皮癣菌卡氏枝孢霉红色毛癣菌的，、ITS，l、ITS4，的扩增结果，，图7，soll、sol2，的扩增结果：M泳道为，，100bpladder，1。16泳道分别为茄病串珠层生尖孢半裸镰刀菌白念珠菌毛霉弯孢霉烟曲霉青霉拟青霉枝顶孢霉链格孢霉絮状表皮癣菌卡氏枝、、、，，孢霉红色毛癣菌，Fig1．Fig3．ClonyofFusariuFaulseheadand：mcsolani(cu，lturedonPDA25℃，，10d)ltureFig2．MaPDA，，croconidia，ofFusariumso．lani(cuhuredonPDA．x40025℃．．7d)．1der；4：F．sola：1ni，36：F：m．hlamydosporeofFusaoniliform5：Fprolifroriumsola，ni(c：uoxdonx40025。C，7dtumto)Fig4pondtoeratumorum：7：Fysposem，rum9：FsemiteccorresrRFLPprofilesofDraII(M：100bpladtheirRFLPproflesofDraII；2：Fsolanitst0，F．monilifoxorm，Fpl咖ra．tumoxonec，8：Fm，oxCfrl3Iuc(M2ts；o：F00bpladder；1：Frumso46m：F，yp、．ysporuiliformysp35，、、，10Formitec7、tum、corresponderatheir，Fmon：ilifro9ia11：：F．psorolifntumesDNAITSPCRpr(1duc13：Fsol0HicorrespondFigthe．5RFLPp‘roiles0ffproirrDNAITSPCR．d810、11F．plifera．tumso，14，F．laPitionfITs】、CandidaucorEider14：pmophyton∥occosumsolani2：Fmoniliform3：Fprol咖ratum4：Fiatu1rhms0Penicillinu1lPaecilomcs12：：／gyeTrichophytonrubrum)6：，ITS4forgenusalbicans，7：Mands，00bpladder1：Fp8：CurvuLaria9：Aspergillus15：Cladosporiumcarrionii16，，，ies(M：1lan2：F，mon：ilifkm／：，igtus10enFig6AmplicapondtotheirRFLPprofles0fCfrl3I3：FProzirer。tum4：FDx\"por“m5：F5emitec；umicillium11：Paecilomyces12：Ac阳monium13：4ffernⅡriⅡcorrorm，．．，，，，，，．，，．，．oxysporumonTrichophytonrubrum)5：Fsemitectum，6：Ca．Fig7．amplications，n0fsoll、s01，：(M：100bpladderL。riⅡD，iHm，1：F．ndidaoalbica7：MHcor，8已：15：M9：：A钟i，，，：Acremium，13：Alternaria，14：Epidermphyton肋c∞sHmC10dospcn，r赢gillu5ii16：r．参考文献KirkPM，Cannondie1Dictio，s．AmJOphthalm，ol2007，，143Y．(2)ta．3：56358．PF，DavidJCtem，eta．nary—ofTheFu．ngi[3]．HattoriNShiraiApro，Sugiu．rae1Onychomycosistocausedby．8…editionioA．Oxford：CABIInVanationaesel1995，，173174．FfkesusariumliferatumBrJDermal，2005，153(3)：7[2]Donn，NuoiDNto，CatanMeta1Outbreakenc9ra．otomycosisattributableFusariumsolaniintheFrhWetIn．(下转第284页)・２８４・ ２００８年ｌＯ Ｃｈｉｎ Ｊ Ｍｙｃｏ１．Ｏｃｔｏｂｅｒ ２００８．Ｖ０ｌ ３．Ｎｏ．５ 临床疗效。 ［５］ Ａｒｅｃｈａｖａｌａ ＡＩ，Ｂｉａｎｃｈｉ ＭＨ．Ｒｏｂｌｅｓ ＡＭ．ｅｔ ａ１．Ｉｄｅｎｔｉｉｃａｔｉｆｏｎ ａｎｄ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｆｌｕｃｏｎａｚｏｌｅ ａｎｄ ａｌｂａｃｏｎａｚｏｌｅ ｏｆ １００ ｙｅａｓｔｓ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｖａｇｉｎａｌ ｄｉｓｃｈａｒｇｅ．Ｒｅｖ Ｉｂｅｒｏａｍ Ｍｉ． 综上所述，本地区的男性念珠菌性尿道炎和包 皮龟头炎的致病真菌以白念珠菌为主，（８５．２％）， **滑念珠菌与光滑念珠菌列第二、第三位。临床 ｃｏｌ，２００７，２４（４）：３０５－３０８． ［６］ 黄进波，李森真，林欢儿，等．生殖道念珠菌病病原真菌的调 查及药敏试验．中国真菌学杂志，２００６，８（４）：２１５．２１８． 治疗可考虑口服氟康唑与伊曲康唑。由于不同念 珠菌对不同的抗真菌药物的耐药性有一定的差异， ［７］ ［８］ Ｒｙｄｅｒ ＮＳ．Ｆａｖｒｅ Ｂ．Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅｒｂｉｎａｆｉｎｅ．Ｒｅｖ Ｃｏｎｔｅｍｐ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ，１９９７，８：２７５．２８７． Ｓｃｈａｕｄｅ Ｍ．Ａｃｋｅｒｂａｕｅｒ Ｈ．Ｍｉｅｔｈ Ｈ．Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｎｔｉｆｕｎ． ｇａｌ ａｇｅｎｔｓ ｏｎ ｇｅｒｍ ｔｕｂｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ．Ｍｙｋｏｓ． 临床治疗时应充分考虑各药敏感性的差异，以便取 得最佳疗效。 参考文献 ［１］ 李军，郑和义，孙秋宁，等．男性非淋菌性尿道炎患者尿道 中念珠菌的分离及药敏分析．中华皮肤科杂志，２００４，３７ （１２）：７３２－７３３． ｅｎ，１９８７．３０：２８１－２８７． ［９］ Ｐｅｔｒａｎｙｉ Ｇ，Ｍｅｉｎｇａｓｓｎｅｒ ＪＧ，Ｍｉｅｔｈ Ｈ，Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ａｌｌｙｌａｍｉｎｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｔｅｒｂｉｎａｆｉｎｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ ［２］ 廖元兴，杨庆永，梁洁．男性ＳＴＤ患者念珠菌性尿道炎２１３ 例Ｉｌ缶床研究．中国麻风皮肤病杂志，２００５，２１（３）：１７８．１８０． Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，１９８７，３１（９）：１３６５．１３６８． ［１０］ Ｓｔ—Ｇｅｒｍａｉｎ Ｇ．Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｅｎｄｐｏｉｎｔ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｏｕｔｃｏｍｅ ｏｆ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔｓ ｗｉｔｈ Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｅｃｉｅｓ：２４一ｖｅｒｓｕｓ ４８－ｈ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ａｎｄ ５０ ｖｅｒｓｕｓ ８Ｏ％ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｇｒｏｗｔｈ．Ｍｙｃｏ ［３］ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ．Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｂｒｏｔｈ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ ｙｅａｓｔｓ；ａｐｐｒｏｖｅｄ ｓｔａｎｄａｒｄ・ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｏｎ Ｍ２７一Ａ２．Ｐｅｎｎｓｙｌｖａ－ ｓｅｓ，２００１，４４（１－２）：３７４５． ｎｉａ；ＮＣＣＬＡ ２００２；２２（１５）． ［收稿日期］ ２００８－０８．１２ ［４］ 李军，郑和义，孙秋宁，等．念珠菌性龟头炎及其致病菌种、 药敏分析．临床皮肤科杂志，２００４．３３（７）：３９８４００． ［本文编辑］ 卫凤莲 （上接第２７９页） ［４］ Ｈｏ ＤＹ，Ｌｅｅ ＪＯ，Ｒｏｓｓｏ Ｆ，ｅｔ ａ１．Ｔｒｅａｔｉｎｇ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ ｆｕｓａｒｉｏ— ｓｉｓ：ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ，ｖｏｒｉｃｏｎａｚｏｌｅ ｏｒ ｂｏｔｈ？Ｍｙｃｏｓｅｓ，２００７，５０ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＩＴＳ２ ｒＤＮＡ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ （３）：２２７－２３ｌ Ｌｅｔｔ，２００４．２３９（１）：１８１－１８６． ［５］ Ｈｅｎｇ Ｚｈｕ，Ｆｅｎｇ Ｑｕ，Ｌｉ－Ｈｕａｎｇ Ｚｈｕ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡｓ ｆｒｏｍ ｐｌａｎｔｓ，ｆｕｎｇｉ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｕｓｉｎｇ ｂｅｎｚｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ［９］ Ｌｌｏｒｅｎｓ Ａ，Ｈｉｎｏｊｏ ＭＪ，Ｍａｔｅｏ Ｒ，ｅｔ ａ１．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕ－ ｓａｒｉｕｍ ｓｐｐ．ｉｓｏｌａｔｅｓ ｂｙ ＰＣＲ—ＲＦＬＰ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９９３，２１（２２）：５２７９—５２８０． ｓｐａｃｅｒ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ（ｒＤＮＡ）．Ｉｎｔ Ｊ Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ２００６．１０６（３）：２９７－３０６． ［６］ Ｓｕｇｉｔａ Ｔ，Ｎｉｓｈｉｋａｗａ Ａ，Ｓｈｉｎｏｄａ Ｔ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｓａｈｉｉ ｂｙ ＰＣＲ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｈｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ［１０］ Ｈｅｎｎｅｑｕｉｎ Ｃ，Ａｂａｃｈｉｎ Ｅ，Ｓｙｍｏｅｎｓ Ｆ，ｅｔ ａ１．Ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕ－ ｓａｒｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｂｙ ２８Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ｓｐａｃｅｒ ｒｅｇｉｏｎｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９８，３６（９）：２７４２—２７４４． ［７］ Ｓｕｇａ Ｈ，Ｉｋｅｄａ Ｓ，Ｔａｇａ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｋａｒｙｏｔｙｐｉｎｇ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｓｅｖｅｎ ｆｎｒｍａｅ ｓｐｅｃｉａｌｅｓ ｉｎ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ．ＣＵｌＴ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９９，３７（１１）：３５８６－３５８９． Ｇｅｎｅｔ，２００２，４１（４）：２５４－２６０ ０８－０７ ［收稿日期］ ２００８－［８］ Ｋｕｌｉｋ Ｔ，Ｆｏｒｄｏｆｉｓｋｉ Ｇ，Ｐｓｚｃｚ６ ｏｗｓｋａ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ［本文编辑］ 王飞
