ＣＨＩＮＥＳＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＡＮＡＴＯＭＹ Ｖｏ１．３２ Ｎｏ．２ ２００９ 解剖学杂志２００９年第３２卷第２期 缺氧对小胶质细胞Ｎ９生物学功能的影响 柯荔宁王玮张更 （福建医科大学，１解剖学系，２神经生物学研究中心，福州 ３５０００４） 摘要 目的：通过观察缺氧环境中小胶质细胞Ｎ９生物学功能的变化，进一步探讨活化态小胶质细胞在缺血缺氧性脑病中 的作用机制。方法：通过建立Ｎ９细胞缺氧培养系，观察细胞形态学及其生长增殖活力的改变。利用ＲＴ－ＰＣＲ、还原ｗＳＴ＿１ 法及荧光探针ＤＡＦ－ＦＭ ＤＡ法检测胞内ＴＮＦ－ａ、ｉＮＯＳ、Ｏｉ－等因子的表达水平；通过ＪＣ－１荧光和ＥＬＩＳＡ检测细胞线粒体 膜电位和胞质及线粒体内细胞色素Ｃ的含量。结果：在缺氧早期，Ｎ９细胞增殖随缺氧时间延长而下降；细胞的形态在缺氧 １２ ｈ时变化最典型。在缺氧早期Ｎ９细胞内（ 、ＴＮＦ－ａ含量以及ｉＮＯＳ相对活性等多种神经毒性因子的表达水平增加。 缺氧可导致Ｎ９细胞线粒体结构与功能改变，线粒体膜电位呈时间依赖性下降；线粒体细胞色素ｃ的含量随缺氧时间延长 而增加。结论：缺氧可诱导Ｎ９细胞生物学功能改变，呈现应激活化状态，主要表现在细胞生长增殖活力先上调后下降，神 经毒性因子表达水平显著增高，细胞线粒体功能改变等方面。 关键词缺氧；小胶质细胞；分子生物学 Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｎ９ ｃｅｌｌ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔａｇｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ａｎｏｘｉａ Ｋｅ Ｌｉｎｉｎｇ，Ｗａｎｇ Ｗｅｉ，Ｚｈａｎｇ Ｇｅｎｇ （１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｎａｔｏｍｙ，２．Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ ｉａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｆｕｚｈｏｕ ３５０００５，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｎ９ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔａｇｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ａｎｏｘｉａ，ａｎｄ ｆｕｒｔｈｅｒ ｄｉｓｃｕｓｓ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｍｉｃｒｏｇｌｉａ ｃｅｉｌｓ ｉｎ ｈｙｐｏｘｉｃ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｐｒｏ— ｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎ９ ｃｅｌｌｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｈｙｐｏｘｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ．Ｔｈｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ＴＮＦ－￣，ｉＮＯＳ ａｎｄ ０ ｗｅｒｅ ａｓｓａｙｅｄ ｗｉｔｈ ＲＴ－ＰＣＲ ｏｒ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ＷＳＴ－１ ａｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｅ ＤＡＦ－ＦＭ ＤＡ．Ｔｈｅ ｍｉｔｏｃｈｏｎｏｄｒｉａ１ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｎｄ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ ｉｎ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ａｎｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｗｅｒｅ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ＪＣ一１ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ ＥＬＩＳＡ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ Ｎ９ ｃｅｌｌｓ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｉｔｓ ｐｒｏ— ｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔｌｙ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｐｒｏｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｙｐｏｘｉｃ ｔｉｍｅ，ｗｈｅｒｅａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ（ ａｎｄ ＴＮＦ－￣ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｉＮＯＳ．Ｔｈｅ ｔｙｐｉｃａｌ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｃｅｌｌ ｓｈａｐｅ ａｐｐｅａｒｅｄ ｗｈｅｎ ｏｘｙ— ｇｅｎ ｄｅｆｉｃｉｔ ｗａｓ ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ ｆｏｒ １ ２ ｈｏｕｒｓ．Ｈｙｐｏｘｉａ ｃａｕｓｅｄ ｃｈａｎｇｅｓ ｂｏｔｈ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ，ａｎｄ ｔｉｍｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｅｃｌｉｎｅ ｉｎ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｏｔｅｎｔｉａ１．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ ｃｏｎｔｅｎｔ ｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｔｈｅ ｈｙｐｏｘｉａ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ａｎｏｘｉａ ｃａｎ ｃｈａｎｇｅ Ｎ９ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｓｔｒｅｓｓ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｓｔａｔｅ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｉｎｉｔｉａｌ ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ ｄｅ— ｃｌｉｎｅ ｉｎ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ａ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ，ａｎｄ ａ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ａｎｏｘｉａ；ｍｉｃｒｏｇｌｉａ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ 近年来，大量研究揭示了小胶质细胞在中枢神经 用机制仍需进一步探索。 系统发育、重塑以及各种病理状态过程如炎症、缺血、 变形的重要作用［１ ，越来越多的研究表明当细胞外环 １材料和方法 境改变时，小胶质细胞迅速应激成为活化态，出现形态 １．１主要试剂和仪器 学上的改变，反应性增生，同时又能诱导细胞增殖、迁 兔多克隆抗体ＣＤ一１Ｉｂ及Ｒｈ标记二抗购自 移、释放可溶性的化学毒性因子和细胞因子，从而调节 Ｃｈｅｍｉｃｏｎ公司；ＧＡＰＤＨ多克隆抗体购自Ｓｉｇｍａ公司； 和影响脑内其他细胞生长发育的生理过程，参与了病 ＴＲＩｚｏｌ购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ 理过程的启动、进展以及最后结局¨１ ，介导并加重机体 （ＡＭＶ）试剂盒、ＤＮＡ Ｍａｒｋ（ＤＬ一２０００）购自大连宝生 组织的损害ｌ】 。总之，小胶质细胞活化在缺血缺氧性 物公司（ＴａＫａＲａ）；细胞线粒体提取试剂盒和细胞色素 脑病的病理过程中发挥着重要的作用，但其确切的作 Ｃ ＥＬＩＳＡ检测试剂盒购自Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ公司；线粒体 膜电位测定试剂盒购自Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ公司；一氧化 福建省科技厅资助省属高校研究项目２００６Ｆ５０４８ 氮合成酶检测试剂盒和超氧化物检测试剂盒购自浙江 作者Ｅ－ｍａｉｌ：ｋｅ－ｌｉｎｉｎｇ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｒｎ 碧云天生物技术研究所。 收稿日期：２００８—７一ｌ４；修回日期：２００８一１０—２８ Ｎ９细胞株取材于小鼠小胶质细胞，由美国国立癌 一步法ＲＴ－ＰＣＲ半定量检测ｍＲＮＡ含量：参考文 症研究所王吉民博士馈赠。 三气培养箱（ＵＳＡ Ｆｏｒｍａ ３１３１）购自Ｆｏｒｍａ Ｓｃｉｅｎ 献设计引物，（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司），ＴＮＦ—ｏ【上游引物５ｆ＿ ＴＡＣ ＴＧＡ ＡＣＴ ＴＣＧ ＧＧＧ ＴＧＡ ＴＴＧ ＧＴＣＣ－３ ；下 ｔｉｆｉｃ公司；相差倒置显微镜购自Ｎｉｋｏｎ公司；酶标仪购 自ＡＷＡＲＥＮＳ公司；激光共聚焦扫描显微镜购自Ｌｅｉ— ｃａ公司；紫外分光光度计（ＤＵ６４０型）购自Ｂｅｃｋｍａｎ公 游引物５ ｒｌ＿ＣＡＧ ＣＣＴ ＴＧＴ ＣＣＣ ＴＴＧ ＡＡＧ ＡＧＡ ＡＣＣ一３ ；ＧＡＰＤＨ上游引物５ ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴ— ＧＣＣＡＴＣＡＣ一３ ；下游引物５ ｒ＿ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴ— 司；ＰＣＲ仪购自ＰＥ公司；凝胶成像分析系统（Ｇｅｌ Ｄｏｃ １０００型）购自Ｂｉｏ—Ｒａｄ公司。 ＧＣ ＴＧＴＡ一３ 。配制５０／，１／Ｓａｍｐｌｅ ＲＴ－ＰＣＲ反应体系， 进行ＲＴ－ＰＣＲ反应，ＧＡＰＤＨ作为内参照，在另一管按 与目的基因相同体系、相同参数同时扩增。反应结束 后，取ＰＣＲ产物８ ｌ进行２ 琼脂糖凝胶电泳。ＰＣＲ 扩增片段长度分别为：ＴＮＦ－ｄ １９７ ｂｐ，ＧＡＰＤＨ ４５２ １．２建立正常Ｎ９细胞培养体系 以液氮冻存复苏后的Ｎ９细胞株作为第２代，以约 ４×１０ ／ｍｌ的密度接种在细胞培养瓶内，３７℃、５ ＣＯ２条件下常规传代培养于８９ 高糖ＤＭＥＭ＋１０ Ａ ０ｂｐ。紫外凝胶摄像分析仪拍照后，用ＧＥＮＥＳＮＡＰ 胎牛血清＋１ 青链霉素的培养基中，至第３天贴壁细 胞约占培养瓶底面积５０ ～６０ ，以含０．０２ ＥＤＴＡ 的胰酶消化贴壁细胞，１：３传代至另一培养瓶继续常 规培养，选择第３～８代Ｎ９细胞进行实验。 １．３小胶质细胞Ｎ９的鉴定 利用单核细胞膜黏附分子、Ⅲ型补体受体ＣＤ１ｌｂ 作为小胶质细胞的特异性识别标志，采用免疫荧光细 胞化学技术鉴定培养细胞。具体步骤如下：弃去培养 液；０．０１ ｍｏｌ／Ｉ ＰＢＳ（ｐＨ ７．４）冲洗；冷４ 多聚甲醛，室 温下固定３０ ｍｉｎ；０．３ Ｔｒｉｔｏｎ １００ ２０ ｍｉｎ；ＰＢＳ冲 洗，３ Ｈ Ｏ 孵育１０ ｍｉｎ；封闭（含５ ＢＳＡ＋０．１ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ＿１００的ＰＢＳ）孵育３Ｏ ｍｉｎ；加ＣＤ１ｌｂ抗体 （１：１ ０００），３７℃，１ ｈ后转入ＣＣ过夜；ＰＢＳ冲洗，加 山羊抗ＩｇＧ－Ｒｈ（１：２００），３７℃孵育１ ｈ；ＰＢＳ冲洗，磷 酸甘油封片，荧光显微镜观察拍摄；对照组用 ０．０１ ｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ代替一抗进行，其他步骤不变。 阳性率计数方法：在相差显微镜下随机选取，计数３０ 个高倍视野，计算阳性细胞的百分率，用图像分析系统进 行分析，小胶质细胞比例占９５ 以上者为符合要求。 １．４建立Ｎ９细胞缺氧培养体系及实验分组 取符合鉴定结果的培养体系，重悬、调整细胞密度 种植，设置３７℃、９４ Ｎ２、１ Ｏ２、５ ＣＯ 的缺氧培 养环境，将培养体系分成对照组和缺氧３、６、１２、２４、 ４８ ｈ ５个缺氧组。 １．５ Ｎ９细胞生长增殖活力的观察 应用倒置相差显微镜观察Ｎ９细胞的生长分布状况 及形态，应用ＭＴＴ法检测Ｎ９细胞增殖活力，每组各设６ 个复孔，以不加细胞悬液和药物的孔为空白对照孔。 １．６ Ｎ９细胞神经毒性因子表达水平的检测 １．６．１ Ｎ９细胞ＴＮＦ—ａ ｍＲＮＡ表达水平 按ＴＲＩｚｏｌ 试剂说明书抽提细胞总ＲＮＡ，将所提取的ＲＮＡ溶于 ２０肚ｌ去核酸酶的水中，一８Ｏ℃冻存备用；所提取的总 ＲＮＡ用紫外分光光度计检测ＡＢ６０／Ａ２８０值，分析 ＲＮＡ含量和纯度，所有标本比值均为１．８～２．０；取所 提取的总ＲＮＡ用１ 琼脂糖凝胶电泳，显示出清晰的 ２８ ｓ和１８ Ｓ ２条ｒＲＮＡ。 １ ９６ ＴＯＯＬ软件进行吸光度容积定量分析，以ＴＮＦ＿ａ与 ＧＡＰＤＨ扩增条带平均密度的比值表示ＴＮＦ一０【ｍＲＮＡ 的相对表达量。 １．６．２ Ｎ９细胞超氧化物Ｏ 含量的检测 应用还原 ＷＳＴ １产生可溶性橙色的Ｆｏｒｍａｎｚａｎ为基础来检测 Ｏ 。吸去培养液，用ＤＰＢＳ洗涤１次；每孔加人２００ ｐ．１ 检测工作液（每２１２／，１检测工作液由检测缓冲液 ２００ ｌ，ＷＳＴ １溶液１Ｏ ｒ＊ｌ，Ｃａｔａｌａｓｅ溶液２ ｌ构成）， ３７￣Ｃ￣育５ ｍｉｎ；任选２个缺氧模型组每孑Ｌ加入２ １ ＳＯＤ以验证整个检测体系；每组各设６个复孔，４５０ ｎｍ 测定吸光度。 表１还原ＷＳＴ－１法检测超氧化物０２－含量 Ｔａｂ １ Ｄｅｔｅｃｔ ０ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ、】￣ ．ｒ－１ １．６．３ Ｎ９细胞ｉＮ（）Ｓ相对活性的检测 应用荧光探针 ＤＡＦ－ＦＭ ＤＡ检测ｉＮ（ 的相对活性。吸弃培养基后，留 ２个孔作为空白对照，每孔加入１００ ｌ ＮＯＳ检测缓冲液； 每孔再加入１００ ｌ检测反应液，轻轻混匀，在细胞培养箱 内孵育１ ｈ；激光共聚焦扫描显微镜下检测，以没有细胞 的孔为空白对照，激发波长４９５ ｎＩｎ，发射波长５１５ ｎｍ。 一氧化氮合成酶的相对活力计算：以常规培养的 Ｎ９细胞中ｉＮＯＳ的活力为１，那么缺氧刺激后：样品中 ｉＮＯＳ相对活力一（ＲＦＵ已刺激一ＲＦＵ空白）／（ＲＦＵ 未刺激一ＲＦＵ空白）。 １．７ Ｎ９细胞线粒体结构功能（膜电位和细胞色素Ｃ 含量）的检测 １．７．１ Ｎ９细胞线粒体膜电位提取细胞内线粒体 ＤＰＢＳ洗涤，收集细胞，４℃６００ ｒ／ｍｉｎ ５ ｍｉｎ弃上清，重 复２次；加入１ ｍｌ胞质缓冲液，轻重悬，置于冰上 １５ ｍｉｎ；手动匀浆后，４℃条件下８００ ｒ／ｒａｉｎ ２０ ｍｉｎ，弃沉 淀；上清液于４℃条件下８００ ｒ／ｍｉｎ １０ ｍｉｎ弃沉淀，重 复２次；４℃１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ ２０ ｒａｉｎ，弃上清；用胞质缓冲 液重悬沉淀，４℃１０ ０００ ｒ／ｒａｉｎ ２０ ｍｉｎ弃上清，加入线 粒体缓冲液，冰上裂解１５ ｍｉｎ后充分混匀；上清４℃条 件下１６ ０００ ｒ／ｍｉｎ ３０ ｍｉｎ，弃沉淀；用线粒体膜电位检 测试剂盒测定蛋白浓度，分装后置于－－８０℃保存。 测定线粒体膜电位：取相同浓度体积的纯化线粒 体（Ｏ．１ ｍｌ总蛋白量为１０￣１００ ｕｇ），直接加入１×ＪＣ－１ 在３７℃培养箱孵育１５ ｍｉｎ；ＤＰＢＳ洗涤，加入等体积分 析缓冲液轻轻混匀；上机检测荧光强度。所得的荧光 强度比值反映线粒体内外膜电位差：红色荧光强度 （ｅｘＸ５８５ ｎｍ，ｅｍＸ５９０ ｎｍ）／绿色荧光强度（ｅｘＸ５１４ ｎｍ， ｅｍｋ５２９ ｎｍ）。 １．７．２ 细胞色素Ｃ含量的检测应用ＥＬＩＳＡ试剂盒检 测Ｎ９细胞胞质和线粒体内细胞色素Ｃ的含量。用已 知浓度的细胞色素Ｃ按照梯度用封闭缓冲液从 ５０ ｎｇ／ｍｌ￣０．７８１ ｎｇ／ｍｌ依次稀释。含细胞色素Ｃ的 样品用封闭缓冲液稀释到２０ ｎｇ／ｍｌ￣１００ ｎｇ／ｍｌ浓度， 每孔加入１００／１１体积，制备细胞色素Ｃ标准曲线；在室 温下１００ ｒ／ｍｉｎ孵育２ ｈ后，用２５０ ｕｌ洗液洗；按照说 明书要求配合所需的细胞色素Ｃ抗体，室温下 １００ ｒ／ｍｉｎ孵育１ ｈ，再用２５０ ｆｆｌ洗液洗，ＨＲＰ耦联的 ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ与细胞色素Ｃ检测抗体结合，室温下 １００ ｒ／ｍｉｎ孵育１ ｈ后，再用２５０ ｆｆｌ洗液洗；用ｄｅｖｅｌｐ— ｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ室温下孵育２～１０ ｍｉｎ显色后，加入ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，在４５０ ｎｍ分光光度计读数。 １．８统计学处理 实验结果以 ±Ｓ表示，采用ＳＰＳＳ １３．０软件包分 析，组间比较用单因素方差分析，ＬＳＤ检验，Ｐ＜０．０５ 为差异有统计学意义。 ２结果 ２．１ Ｎ９细胞的鉴定 单克隆抗体ＣＤｌｌｂ（ＯＸ－４２）是能结合ＣＲ３补体受体 的单核细胞膜黏附分子，是小胶质细胞特征性标记物，所 以选用ＣＤｌｌｂ抗体来鉴定小胶质细胞，从而确定该细胞株 的种类和纯度（图１）。经阳性细胞计数，培养的Ｎ９细胞 ９５ 以上为（ＩＤ１１ｂ抗体阳性细胞，符合本研究要求。 ２．２缺氧对Ｎ９细胞生长增殖活力的影响 为了确定缺氧对Ｎ９细胞生长增殖活力是否有影 响，将培养的Ｎ９细胞分别缺氧３、６、１２、２４和４８ ｈ 后，应用倒置相差显微镜观察其形态学变化，用ＭＴＴ 法检测其增殖活力，结果（图２，表２）如下。 对照组细胞排列密集，分布均匀；绝大多数细胞胞 体近似圆形，大小一致，轮廓清晰，胞质均匀，鲜见突 起；绝大多数细胞轮廓完整，清晰，胞间联系少（图 ２Ａ）。 缺氧３ ｈ组细胞排列密集，分布均匀；大多数细胞 外形较均一，有少量胞体变形并有单一突起；有部分胞 问联系，少量细胞突起伸长（图２Ｂ）。 缺氧６ ｈ组细胞排列较密集，分布不均；胞体外 形多态，相当数量的细胞有突起，少数细胞呈现多分 枝状；胞间联系较多，部分细胞突起相互靠近（图 ２Ｃ）。 缺氧１２ ｈ组细胞排列较稀疏，分布不均；多数细胞 变形，聚集，呈现分枝状粗糙突起，少数细胞胞质出现 空泡；胞间联系紧密，群集的细胞突起相互深入（图 ２Ｄ）。 缺氧２４ ｈ组细胞排列较稀疏，分布不均，少量重 叠；细胞外形多态，大小不均，形态各异，多数细胞胞质 空洞，突起断裂，轮廓不完整；胞间联系紧密，细胞突起 相互深入（图２Ｅ）。 缺氧４８ ｈ组细胞排列稀疏，成群聚集，重叠分 布；细胞外形多态，大小不均，形态各异，可见部分细 胞残骸，部分细胞多突起分枝状；群内细胞联系紧 密，突起相互深入（图２Ｆ）。Ｎ９细胞的形态分布于 缺氧３ ｈ时开始有变化，６ ｈ时，变化明显，至缺氧 １２ ｈ时达到高峰：细胞排列稀疏，分布不均，大小不 一，形态各异，突起数目增多，出现屈曲、粗糙、中断 不完整，呈现典型的分枝状“活化态小胶质细胞”外 观Ｌ２］，胞问联系紧密，突起相互深入。缺氧４８ ｈ时 细胞数量明显减少，可见部分细胞残骸。提示随着 缺氧时间的延长，细胞的形态分布特点已从初期的 应激性增殖向损害演变。 与对照组相比，Ｎ９细胞的增殖活力于缺氧３ ｈ时 最高，６ ｈ时开始有显著下降，其后随着缺氧时间的延 长而降低，各缺氧组与对照组相比，差异均有统计学意 义（Ｐ＜０．０５），且各缺氧组间差异均有显著性（Ｐ＜ ０．０５，），在缺氧１２ ｈ时改变最明显。 ２．３缺氧对Ｎ９细胞神经毒性因子表达水平的影响 为了深入探讨缺氧对Ｎ９细胞神经毒性因子表达 的影响，Ｎ９细胞在缺氧３、６、１２、２４和４８ ｈ后分别用 ＲＴ－ＰＣＲ法、还原ＷＳＴ－１法、荧光探针ＤＡＦ－ＦＭ ＤＡ 法检测各组细胞ＴＮＦ—ａ、ｏ 的表达水平和ｉＮＯＳ的相 对活性（表２）。 ＴＮＦ＿ａ ｍＲＮＡ的表达水平随缺氧时间增加逐渐 升高，各缺氧组与对照组相比，差异均有统计学意义 （Ｐｄ０．０５），在缺氧１２ ｈ达到最高峰，然后缓慢下降 （缺氧１２ ｈ、２４ ｈ、４８ ｈ组间相比，Ｐ＞Ｏ．０５）。 Ｎ９细胞内Ｏ 的含量在缺氧后迅速上升，各缺氧 组与对照组相比，差异均有统计学意义（Ｐ＜０．０５），在 缺氧６～１２ ｈ内达到最高峰，２４ ｈ后快速下降。 Ｎ９细胞的ｉＮＯＳ相对活性在缺氧后迅速上升，各 缺氧组与对照组相比，差异均有统计学意义（Ｐ＜ ０．０５），在６ ｈ时达到最大值，１２ ｈ后快速下降。 ２．４缺氧对Ｎ９细胞线粒体膜电位和细胞内细胞色素 Ｃ分布的影响 为了探讨缺氧对Ｎ９细胞线粒体结构功能的影响， ］９７— 表2不同缺氧时间对N9细胞增殖活力TNF、ct2表达水平0、含量、iNOSlla相对活性的影响rTab2Cellactivity，TNFct，02andiNOSexpressioninN9ceftehypoxia分别应用JC和48hN91法和化学荧光法测定缺氧3)3、6、12、24细胞线粒体膜电位和细胞内细胞色素C含，量(表2)：缺氧能降低线粒体膜电位(表，并且呈时间“依赖性各缺氧组与对照组相比差异均有统计学意义(P
胞色素图1Fig1Imm05)对照组中胞质的细胞色素CC含量很少大部分细，位于细胞线粒体中C。随着缺氧时间的延长，，CDIlbunoc免疫荧光细胞化学鉴定sN9细胞×400，胞质内的细胞色素×400含量逐渐增高线粒体内的细胞，ytochemicaltainingforCDllbjnN9cells，色素C的含量不断相应减少各缺氧组与对照组相比图Fig22c不同缺氧时间对N9细胞形态分布的影响X400，，示细胞突起十naoxMorphologicalcharatenristicstroofN9p；cells：cultu，redindiffe，，rentstagesdaurringia，十showectedprocessesofthecellA：ColgrouBF3h6h12h24h，48hfteanoxiarespively198—差异均有统计学意义（Ｐ＜Ｏ．０５），缺氧１２ ｈ后，胞质内 细胞质内的细胞色素Ｃ含量超过线粒体内的细胞色素 的细胞色素Ｃ含量与线粒体内的相近，缺氧２４、４８ ｈ Ｃ含量（表３）。 表３不同缺氧时间对Ｎ９细胞线粒体膜电位和细胞色素Ｃ含量的影响 Ｔａｂ ３ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｎｄ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ Ｎ９ ｃｅｌｌ ａｆｔｅｒ ｈｙｐｏｘｉａ ３讨论 化后早、中期分泌的主要神经炎性分子。 ３．３缺氧导致Ｎ９细胞线粒体结构功能改变 ３．１缺氧早期可诱导Ｎ９细胞增殖 正常细胞的线粒体膜内外侧面存在电位差，是线 小胶质细胞位于脑免疫防御的前沿，对细胞外微环 粒体维持电子传导过程所需要的。如果线粒体膜上的 境的变化一直处于警觉状态，不断地监督其微环境，对病 电位差减弱了，该线粒体功能将受到。因此，线粒 理失衡迅速做出反应，首先表现为细胞增生 一。本研究 体膜电位的改变可反映整个线粒体的功能状态，测定 结果表明Ｎ９细胞在缺氧３ ｈ时增殖活力已达最高，随着 线粒体膜电位有助于了解线粒体的功能状态ｌ＿】 。 缺氧时间延长而下降，并且细胞形态分布有明显变化，缺 细胞色素Ｃ主要存在于线粒体内，是线粒体电子传 氧１２ ｈ时呈现典型的分枝状“活化态小胶质细胞”外 递链重要物质，参与线粒体的氧化磷酸化和ＡＴＰ的产 观 一，这些结果提示缺氧早期可诱导Ｎ９细胞增殖。 生。当线粒体受到损害、线粒体的双膜结构通透性增加 ３．２缺氧诱导Ｎ９细胞神经毒性因子分泌 或膜完整性被破坏，线粒体的细胞色素Ｃ就释放到胞质 在缺血缺氧损伤中，氧自由基等毒性因子大量生 中，从而激活Ｃａｓｐａｓｅ级联反应，诱导细胞凋亡ｌ１ 。 成，包括０ 、ＮＯ、ｉ （）Ｓ等因子在体内发生连锁反应， 本实验关于线粒体应激损害的研究，通过线粒体 产生多种具有高活性的氧化还原中问代谢产物 膜电位来间接反映线粒体结构情况；通过细胞质和线 （ＲＯＳ）。这些毒性因子不仅是线粒体电子传递链和线 粒体内细胞色素Ｃ含量变化反映线粒体功能完整性。 粒体膜通透性的关键环节，而且本身还能直接对细胞 上述这些指标从线粒体功能的不同角度来全面反映缺 产生毒性作用，介导并参与到细胞的缺氧活化反应中， 氧对Ｎ９细胞线粒体结构和功能所造成的影响。 属于较早期的神经毒性因子 一。 本研究结果表明缺氧可降低Ｎ９细胞线粒体膜电 肿瘤坏死因子一ａ（ＴＮＦ—ａ）又称恶液质素（ｃａｃｈｅｃ— 位，并呈时问依赖性。在缺氧６ ｈ时开始下降，于１２ ｈ时 ｔｉｎ），是一种主要由单核一吞噬细胞产生的单核因子，不 下降最明显；线粒体细胞色素Ｃ释放增多，并随缺氧时间 仅选择性地杀伤某些肿瘤细胞，而且有多种免疫调节 的延长而增加，缺氧１２ ｈ时胞质内的含量与线粒体内的 作用，是一类常见的致炎冈子。在机体组织受到各种因 相近，提示缺氧可导致Ｎ９细胞线粒体功能异常，引发的 素导致的病理损害时，ＴＮＦ—ａ的分泌水平明显上升，参 氧化应激损害参与构成小胶质细胞活化后释放的神经毒 与到多种炎性反应当中ｌ３’６ ７＿。 性，在缺血缺氧性脑病发病过程中起重要的作用。 本实验结果表明，缺氧环境可诱导Ｎ９细胞内（） 、 ｉＮＯＳ、ＴＮＦ—ａ等多种炎性因子的高表达。在缺氧３ ｈ 参考文献 时０ 的含量和ｉＮ０Ｓ的相对活性就迅速上升，６～ １２ ｈ达高峰，这个结果与已有研究结论相符一。 ，表明 Ｏ 、ｉＮＯＳ都属于较早期的应激因子。ＴＮＦ—ａ的分泌 水平在缺氧的环境中升高，并呈时间依赖性，于缺氧 １２ ｈ时达最高峰，此后有一个平台期，２４ ｈ后开始下 降，这提示ＴＮＦ—Ｃｔ参与缺氧诱发的相关炎性应激反应， 这个结果与Ａｌｏｉｓｉ等 ］，ＰｏｄｅｒｏｓｏＥ 等的实验结论一 致。因而，可以认为ＴＮＦ—ａ作为小胶质细胞在缺氧活 ３讨论 减轻缺血再灌注对大鼠脑神经细胞的损伤。而复方丹参 下调ＮＯＳ的表达是否与改善微循环，抗脂质过氧化，清 ＮＯ是 精氨酸在ＮＯＳ作用下氧化生成的一种 除自由基，阻止钙超载等有关尚待进一步研究。此外，在 极不稳定的、可扩散的具有高度化学活性的气体分子， 复方丹参的有效成分（丹参酮工、丹参酮Ⅱ一Ａ、丹参酮ＩＩ－Ｂ 参与中枢神经系统的多种生理功能。生理量的ＮＯ对 等脂溶性成分和丹参酚、丹参素等水溶性成分）中，何种 脑具有保护作用，而过量的ＮＯ有神经毒性作用Ｌ６］。 成分起关键的保护作用亦有待深入研究。 Ｎｏ引起的神经毒性作用主要是Ｎ０与氧自由基反应 参考文献 生成过氧化硝基阴离子（ＯＮＯ（）Ｉ），以及继发链式反应 生成毒性更强的二氧化氮自由基（ＮＯ ・）和羟自由基 ［１］ Ｌｉ Ｙ。Ｃｈｏｐｐ Ｍ，Ｊｉａｎｇ Ｎ，ｅｔ ａ１．Ｔｅｍｐｏｒａｌ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｉｎ ｓｉｔｕ ＤＮＡ （ＯＨ・）所致ｌ７］。有研究表明ｌ８ｊ ＮＯ参与多种组织和细 ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｍｉｄｄｌｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｒｔｅｒｙ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ ｉｎ ｒａｔ ｒＪ］．Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ，１９９５，１５（３）：３８９—３９７． 胞凋亡过程。观察生成ＮＯ的专一合成酶ＮＯＳ可间 ［２］ Ｋｏｇｕｒｅ Ｔ，Ｋｏｇｕｒｅ Ｋ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｖｅｎｔｓ ｗｉｔｈｉｎ 接了解ＮＯ在组织中的分布。ＮＯＳ在体内有３种亚 ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ｓｕ ｅｃｔｅｄ ｔｏ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ［ｊ］．ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ， 型：神经元型（ｎＮＯＳ）、内皮细胞型（ｅＮＯＳ）和诱导型 １９９７，４（４）：１７９—１８３． （ｉＮ０Ｓ）。本实验结果显示缺血再灌注早期缺血侧大脑 ［３］ 季风清，岳旭，孙海梅，等．一氧化氮合酶与缺氧复氧所致神经细 皮层缺血边缘区神经细胞ｉＮＯＳ、ｎＮＯＳ表达增强，以 胞凋亡及银杏叶提取物的保护作用［Ｊ］．解剖学报，２００２，３３（３）： ２３５—２４０． ｎＮＯＳ表达增强更为明显，而缺血再灌注晚期缺血侧大 ［４］ 刘军，匡培根，吴卫平，等．脑缺血再灌注细胞外液兴奋性氨基酸 脑皮层缺血边缘区神经细胞ｎＮＯＳ的表达并未见明显增 与一氧化氮的变化及丹参的影响＿Ｊ］．中华老年心老血管病杂志， 强，但ｉＮＯＳ的表达则随着缺血再灌注时间的延长显著 ２００３，５（４）：１２３－１２６． 增强，神经细胞凋亡数明显增多，这提示缺血再灌注早期 ［５］ Ｌｏｎｇａ Ｅ Ｚ，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｐ Ｒ，Ｃａｒｌｓｏｎ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｍｉｄｄｌｅ 缺血侧大脑皮层缺血边缘区神经细胞凋亡可能主要是 ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｒｔｅｒｙ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ ｗｉｔｈｏｕｔ ｃｒａｎｉｅｃｔｏｍｙ ｉｎ ｒａｔｓ¨Ｊ］．Ｓｔｒｏｋｅ， １９８９，２０：８４—９１． ｎＮＯＳ催化产生的ＮＯ所介导，随着缺血再灌注时问的 ［６］ Ｔｏｋｉｍｅ Ｔ，Ｎｏｚａｋｉ Ｋ，Ｓｕｇｉｎｏ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｏｌｙ（ＡＤＰ 延长，在多种诱导因子的诱导下，ｉＮＯＳ表达逐渐增强，持 ｒｉｅｏｓｙ１）ａｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｆｏｃａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｉｎ ｒａｔ ｂｒａｉｎ ＥＪ］．Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ 续大量产生毒性作用的ＮＯ，可能主要介导缺血再灌注 Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ，１９９８，１８（９）：９９１—９９７． 晚期缺血侧大脑皮层缺血边缘区神经细胞大量凋亡。 ［７］ Ｙｉｎｇ Ｈ Ｓ，Ｗａｎｇ Ｘ Ｉ ，Ｄａｖｉｄ Ｅ Ｌ．Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｓ 丹参为唇形科多年生草本植物，以根人药，具有活 ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐａｔｈｗａｙｓ［Ｊ］．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，１９９８，４３３ （１）：１２ｊ一１３ｌ＿ 血化淤、宁心安神等功效。其有效成分有丹参酮工、丹 ［８］ Ｍｉｃｈｉｏ Ｔ，Ｓａｔｏｓｈｉ Ｏ，Ｙｏｕｉｃｈｉｒｏｕ Ｎ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｂｃｌ一２ 参酮Ⅱ一Ａ、丹参酮Ⅱ一Ｂ等脂溶性成分和丹参酚、丹参素 ｆａｍｉｌｙ ａｎｄ ｃａｓｐａｓｅ ３－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅａｓｅｉｎ ｎｏ——ｍｅｄｉａｔｅｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｐｏｐｔｏ—— 等水溶性成分。许多研究显示复方丹参具有改善微循 ｓｉｓ＿Ｊ］．Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，１９９８，７１（４）：１５８８ １５９６． 环，抗脂质过氧化，清除自由基，阻止钙超载，抑制神经 ［９］ 莫志贤，郑有顺．潘志强，等．丹参注射液对实验性脑缺血冉灌注 细胞凋亡等作用Ｉｇ。 。本实验显示复方丹参保护组大鼠 损伤的作用机理ｌ＿Ｊ］．中药药理与临床，１９９８，１４（４）：２４． Ｅｌｏ］ 李莉华，冯志强，董文斌，等．丹参对窒息后脑组织中过氧化脂质 缺血侧大脑皮层缺血边缘区神经细胞ｎＮＯＳ、ｉＮＯＳ表达 和钙含量的影响＿Ｊ］．泸州医学院学报，１９９７，２０（１）：３５． 明显下降，神经细胞凋亡数显著减少，说明复方丹参对脑 ［１１］ 王建社，董大翠，袁显忠，等．复方丹参对脑缺血再灌注后大鼠海 缺血再灌注后缺血侧大脑皮层缺血边缘区神经细胞 马和齿状回神经细胞凋亡及Ｂｃｌ一２ ｍＲＮＡ表达的影响＿Ｊ］．解剖 ｎＮＯＳ、ｉＮ（）Ｓ的表达均有抑制作用。复方丹参可能通过 学杂志，２００６ ２９（３）：３０６—３０９． 下调ＮＯＳ的表达，减少Ｎｏ生成，抑制神经细胞凋亡， （编辑：张志英） （上接ｌ９９页） ［４］Ａｌｏｉｓｉ Ｆ，Ｄｅ Ｓ Ｒ，Ｃｏｌｕｍｂａｂ ｃ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｏｐｐｏｓｉｔｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｔｅｒ ［８］ Ｋａｔｏ Ｈ，Ｋｏｇｕｒｅ Ｋ，Ａｒａｋｉ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｇｒａｄｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕ— ｆｅｒｅｏｎ－ｇａｍｍａ ａｎｄ ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ一２ ｏｎ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｎｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｍｉｃｒｏｇｌｉａ ｉｎ ｔｈｅ ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １０ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｒｏｇｌｉａ：Ａ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｌｏｏｐ ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｉｎ ａ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ［Ｊ］．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ， ｌｉｎｇ ｍｉｃｒｏｇｌｉａ ｐｒｏ—ａｎｄ ａｎｔｉ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｌＪ ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １９９５，６９４（１—２）：８５—９３． Ｒｅｓ，１９９９，５６（６）：５７１ ５８０． ［９］ Ｄｏｎｎｅｌｌ Ｓ Ｌ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｔ Ｊ，Ｋｒａｄｙ Ｊ Ｋ，ｅｔ ａ１．ＩＧＦ－Ｉａｎｄｍｉｃｒｏｇｌｉａ／ ［５］Ｍｕｎ—Ｂｒｙｃｅ Ｓ，Ｌｕｋｅｓ Ａ，Ｗａｌｌａｃｅ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ一１ ａｎｄ ｇｅｌａ— ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｍｏｕｓｅ ｂｒａｉｎ［Ｊ］．Ｇｌｉａ， ｔｉｎａｓｅ Ａ ａｒｅ ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｅｆｏｒｅ ＴＮＦ—ａｌｐｈａ ｉｎ ＬＰ＆ｓｔｉｍｎｌａｔｅｄ ２００２，３８（１）：８５ ９７． ｎｅｕｒｏｎｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ＩＪ］．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．２００２，９３３（１）：４２ ４９． ［１０］ Ｎｕｎｏｍｕｒａ Ａ，Ｃｈｉｂａ Ｓ，Ｌｉｐｐａ Ｃ Ｆ，ｅｔ ａ１．Ｎｅｕｒｏｎａｌ ＲＮＡ ｏｘｉｄａ ［６］ Ｐｏｄｅｒｏｓｏ Ｊ Ｊ，Ｃａｒｒｅｒａｓ Ｍ Ｃ，Ｓｈｏｐｆｅｒ Ｆ，ｅｔ ａ１．Ｕｂｉｑｕｉｎｏｌ一２ ｒｅａｃｔｓ ｔｉｏｎ ｉｓ ａ ｐｒｏｍｉｎｅｎｔ ｆｅａｔｕｒｅ ｏｆ ｆａｍｉｌｉａｌ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］． ｗｉｔｈ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ．Ｓｅｃｏｎｄ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ ｔｈｅ ｂｉｏｃｈｅｍ— Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ，２００４，１７（１）：１０８ ｌ１３． ｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ［ｃ］．Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ， ［１１］ Ｐａｒｋｅｒ Ｗ Ｄ，Ｐａｒｋｓ Ｊ，Ｆｉｌｌｅｙ Ｃ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｃｈａｉｎ ｌ９９６：９４． ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｂｒａｉｎ［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，１９９４，４４ ［７］ Ｎｕｎｏｍｕｒａ Ａ，Ｐｅｒｒｙ Ｇ，Ａｌｉｅｖ Ｇ，ｅｔ ａ１．Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｄａｍａｇｅ ｉｓ ｔｈｅ （６）：１０９０ １０９６． ｅａｒｌｉｅｓｔ ｅｖｅｎｔ ｉｎ Ａｈｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕ— （编辑：王栋） ｒｏ１，２００１，６Ｏ（８）：７５９－７６７． ２０３－・——
