业 ２０１３年第ｓ期 兽医实验室实用布鲁氏菌病检测方法 石琴 ，袁立岗 ，梁俊明 ，蒲敬伟 ，杨红卫。 （１．新疆生产建设兵团农十二师畜牧兽医工作站，新疆 乌鲁木齐８３０００９； ２．新疆生产建设兵团畜牧兽医工作总站，新疆 鸟鲁木齐８３０００９） 摘要：布鲁氏菌病是国家二类动物疫病，２００４年将布病纳入国家重大动物疫病监测计划，每年５月和１１月对乳用牛羊及 重点地区牛羊进行两次集中监测，布病检测工作主要在兽医实验室完成。本文对适合兽医实验室操作的布鲁氏茵检测方法 进行了总结。 关键词：布鲁氏茵；兽医实验室；检测方法 中图分类号：￥８５４．４ 文献标识码：Ｂ １．１细菌的分离培养 文章编号：１ ００３—４８８９（２０１ ３）０５－００１ ８－０３ 由于布鲁氏菌为二类动物病原微生物，是高 致病性动物病原微生物，需在取得国家生物安全 三级（ＡＢＳＬ一３）或者四级（ＡＢＳＬ一４）实验室认可 证书的实验室进行实验活动，而县市级兽医实验 室一般都是ＡＢＳＬ—ｌ或ＡＢＳＬ一２，因此不能进行布氏 杆菌的实验活动。 １．２ ＰＣＲ技术 布鲁氏菌病，又称布病、布氏杆菌病、布鲁 氏杆菌病，是由布鲁氏菌属细菌引起的多种家畜和 人的细菌ｆ生共患传染病，临床上以母畜流产、胎盘 不下，公畜睾丸炎、附睾炎，人波状热为特征，严 重危害畜牧业持续发展和人类健康。世界动物卫生 组织（ＯＩＥ）将其列为Ｂ类动物疫病，我国将其列 为二类动物疫病。为有效控制布鲁氏菌病在我国的 蔓延，２００４年以来，国家将布病纳入重大动物疫病 监测计划。每年５月和１ １月对乳用牛羊及重点地区 牛羊进行两次集中监测，监测工作主要是在县市级 在现行的兽医实验室体系中，市级兽医实验室 具备ＰＣＲ诊断所需的仪器设备，可以用ＰＣＲ技术进行 布鲁氏菌病病原的诊断。其原理是根据布鲁氏菌基因 组内的特异保守序列设计引物，对病料提取物、血 清、乳汁以及其他分泌物进行扩增，通过对扩增产 物的大小分析可作出诊断。优点是灵敏度高、特异 性好、操作简单、一次可以检测大量的样品，可以应 兽医实验室完成，作为县市级兽医实验室，选择布 鲁氏菌病诊断方法的重要依据就是要求结果准确、 简便快捷、特异性高、所需仪器设备简单，因此， 本文对兽医实验室常用和实用的布鲁氏菌病监测方 法的原理及优缺点进行了总结。 用于布鲁氏菌种属的区分鉴别还可以区ｆｆＪ－Ａ１９疫苗株 和野毒株。缺点是所需仪器设备较多而且贵，专业性 强，ＰＣＲ试剂盒价格高，检测成本高。 １。３凝集试验 １ 布鲁氏菌病常规检测方法 检测样品一般为病料提取物、血清、乳汁及 目前兽医实验室最常用的布鲁氏菌病血清学 检测方法，包括虎红平板凝集试验（ＲＢＰＴ）、试 管凝集试验（ＳＡＴ）和全乳环状试验（ＭＲＴ），原 其他分泌物。 收稿日期：２０１３－０２－０４ 基金项目：国家星火计划项目“牛羊布鲁氏菌病防控技术 应用与示范”（２０１１ＧＡ８９１００７）。 理是细菌抗原与相应的抗体（血清）混合后，在电 解质参与下，抗原和抗体凝集成肉眼可见的凝集 小块。ＲＢＴ具有敏感、价廉、操作简便的特点，是 牛、羊、猪种布鲁氏菌病的指定试验；缺点是特异 作者简介：石琴（１９８１一），女，汉族，硕士，从事动物疫病的 实验室诊断与研究工作。 通讯作者：蒲敬伟（１９６８一），男，汉族，高级兽医师，从事动 物疾病防控与兽医卫生保健工作。 性不高，无法区分野毒感染抗体和弱毒疫苗感染抗 ２０１ ３年第５期 体，但可以作为筛检方法检测感染畜群，或保证无 抗体。因此，在检测免疫接种过的牛或受假阳性 布病畜群确实没有感染。ＳＡＴ是我国法定的检测方 问题影响的牛群时更应将ｉＥＬＩＳＡ当作一种筛选方法 法，用于牛、羊等一般性动物布鲁氏菌病的诊断， 而不是确认方法。ｃＥＬＩＳＡ￣ＬｉＥＬＩＳＡ特异性更高， 但不适合绵羊种布鲁氏菌病的诊断，缺点是所需时 可以消除部分由细菌交叉反应引起的非特异性反 间较长。ＭＲＴ适用于泌乳母牛布鲁氏菌病的初筛试 应，并可以排除绝大多数牛种布鲁氏菌１９株免疫 验，该方法简便快速，缺点是敏感性低，不适用于 接种产生的残留抗体的反应。 小牛场（１００头以下泌乳牛）。 ２．２荧光偏振分析技术（ＦＰＡ） １．４补体结合试验 荧光偏振分析技术是一种简单的用于检测 常被用来对试管凝集试验和虎红平板凝集试 抗原抗体相互作用的检测技术，是国际贸易中指 验检测为阳性或可疑的病例进行定性检测。其原理 定的检测方法之一。原理是溶液中分子的随机旋 是当抗原与相应的抗体结合形成抗原抗体复合物 转，分子大小是影响旋转速率的关键因素。用荧 时，抗体的分子发生构象变化，于Ｆｃ片段上的补体 光素作为分子标记，经过６８．５。的转动时间可通过 结合位点暴露，补体与之结合后不再处于游离状 在垂直和水平方向的偏振光强度确定，大分子在 态，加入溶血素和红细胞后，补体不能与溶血素和 单位面积的反射光强度比小分子的反光强度高， 红细胞形成的复合物相结合，因此就不会导致溶血 将分子质量小于５０ｋｕ的布鲁氏菌抗原用荧光素标 现象的发生，反之，如果待检血清中没有特异的抗 记，然后加到待检血清或全血中，若抗体存在， 体存在，则补体就以游离的形式存在，加入红细胞 则抗体与标记抗原结合从而会降低标记抗原的转 和溶血素后，补体与之结合即会导致溶血现象。因 动速度，用荧光偏振检测仪可测定出转动速率的 此可以根据溶血现象的发生与否来判断受检血清中 变化，从而测出结果。优点是分析物不需要进行 是否存在布鲁氏菌的特异性抗体。 分离，因而简便快捷，血清中抗体的检测大约需 补体结合试验是目前最有效应用最广泛的诊 要２ｍｉｎ，全血或其他组织液仅需要４５ｓ，可以区分 断方法，至今尚没有一种诊断方法能取代补体结 Ａ１９疫苗免疫株产生的抗体和野毒株产生的抗体， 合试验在血清学诊断中的地位。该方法是国际贸 用于布病监控对于有效控制布鲁氏菌病有重要意 易指定用于牛、羊附睾布病诊断的确诊试验，但 义。缺点是需要荧光偏振检测仪和相应的检测抗 是不适合作为猪的个体诊断，因为猪的补体会干 原，在我国还未普及。 扰豚鼠补体而使得补体结合试验的敏感性降低３５％ ２．３环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ） 和４９％。由于补体结合试验所需要的溶血素的制备 环介导等温扩增法（１ｏｏｐ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ 困难，需有良好的实验设施和训练有素的人员作 ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＬＡＭＰ）是２０００年开发的一种新颖 准确的滴定和保持试剂，试验操作繁琐，难以在 的恒温核酸扩增方法，和ＰＣＲ技术一样也是通过 兽医实验室进行推广。 扩增布鲁氏菌的特异的序列对检测的病原作出诊 ２新型布鲁氏菌检测方法 断鉴定。优点是简单、快速、特异性强、灵敏度 ２．１ 酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ） 高，所需仪器简单，可视化ＬＡＭＰ方法用于布鲁 ＥＬＩＳＡ是一种与ＣＦＴ效果相当的诊断方法，该 氏菌病的检测无需特定的仪器设备和相关专业人 方法操作方便，灵敏度高，特异性较好，一次可 员，该方法的灵敏性和特异性均比较高，阳性结 以完成大量样品的检测，既可以作为筛选试验应 果会直接产生颜色变化，检测结果无需开盖分析 用于动物群体检疫，也可以作为确诊试验，ＥＬＩＳＡ 即可用肉眼观察获得，一步即可完成ＬＡＭＰ扩增及 不仅可以应用于血清抗体的检测，还可应用于乳 结果的判定，降低了布鲁氏菌造成的生物安全威 样中抗体的检测。目前用于布鲁氏菌病检测的 胁，适合在基层广泛推广应用。缺点是还在试验 ＥＬＩＳＡ有ｉＥＬＩＳＡ和ｃＥＬＩＳＡ两种。ｉＥＬＩＳＡ高度敏感， 阶段，尚未普及，但是是今后的发展方向。 但不能鉴别牛种布鲁氏菌１９９免疫接种产生的抗 ２．４胶体金免疫层析技术 体或其它假阳性问题和自然病原菌株诱导产生的 朱明东等研制的一种快速诊断布鲁氏菌病的 。 牧业 ２０１３年第５期 七个诊断牛群营养性问题的有效工具 Ｄｏｎｎａ Ｍ．Ａｍａｒ￣一ｐｈｉｌｉｐｓ著，韩松，乌日金摘译 ０１１５００） （内蒙古天和荷斯坦牧业有限公司，内蒙古 呼和浩特中图分类号：￥８５１．４ １ 文献标识码：Ｂ 定一种饲养管理体系是否运行理想时，奶缸的总 奶量是第一处需要检查评估的地方，在良好的饲 养管理条件下，相邻两次奶缸总奶量之间的差异 很小。如果某一次测得的奶缸总奶量比上次减少 ３％～５％，则需密切检查所饲喂日粮中粗料的数量 和质量。 文章编号：１ ００３—４８８９（２０１ ３）０５－００２０—０４ 奶牛养殖技术／管理人员能利用一些诊断工具 来发现可疑营养性问题的病因，更重要的是可以 将其作为日粮配方调整的参考，以使牛群发挥最 佳生产性能。牧场通过综合运用这些工具来确定 某个营养／管理方面的问题，这个问题可能导致了 牛群产奶量不高、繁殖率低或者代谢病的发生。 一虽然奶缸中的生奶数量对牧场运营所需的 现金流转非常重要，但它并不能反映出目前的饲 养管理体系运行有多好。挤奶牛数量和各泌乳阶 段内的牛头数变化可以极大地影响牛群平均产奶 量，因此，要精确评估和调整饲喂体系，应每月 统计每头个体牛的产奶量，这些数据可以通过ＤＨＩ 进行总结，或者牧场主使用购买的电脑程序自己 对数据进行分析处理。 般情况下，奶牛有３个日粮配方：营养／畜牧师在 纸上或电脑里做的配方；牧场人员混合并饲喂给 奶牛的配方；奶牛实际采食的配方。本文列举的 诊断工具能够及时发现在日粮配合和发放过程中 存在的可能引起营养不平衡的问题。 １检查产奶记录 花些时间去检查产奶量和繁殖记录，可以 对于参加ＤＨＩ测试的牧场来说，牛群ＤＨＩ报告 不但分析归纳了所有参测牛的产奶量，而且也对 牛群繁殖和乳腺炎情况进行了评估总结。如果牧 场产奶量比较低，则需要检查牛群的乳腺炎发病 试验操作简单且比较稳定，因此可优先应用。由 于各种诊断方法都有不同的优缺点，没有一种血 应用中应根据实际需要选择相应的诊断方法。 查明与之相关的问题是何时发生的，以及确定引 起该问题的原因，并找到一些解决的方法。在确 新方法，以硝酸纤维素膜为载体，胶体金标记ＳＰＡ 为显示剂的胶体金免疫渗滤法快速诊断布鲁氏菌 分别为９１．３％和９７－３％，具有灵敏、特异、血清用 病。检测牛布鲁氏菌病，检测的敏感性和特异性 清学方法适合每一种或所有的流行病学情况，在 量少、操作简便、快速，对操作人员专业素质要 求不高的优点，适合于布鲁氏菌病的临床诊断、 流行病学调查、以及现场检测，同时也可以应用 参考文献： 【１】世界动物卫生组织著．ｏＩＥ陆生动物诊断试验和疫苗手 于人布鲁氏菌病的监测，在布鲁氏菌病的不同流 行地区具有较好的应用前景。缺点是不能区分感 册（第５版）【Ｍ】．２００４．３６３—３８７． ［２】王秀丽，蒋玉文，毛开荣，等＿布鲁氏茵病实验室诊断 染抗体和免疫抗体。 目前我国兽医实验室对布鲁氏菌病的检测方 法主要还是虎红平板凝集试验、试管凝集试验， 由于特异性较差因此通常认为不适合国际贸易检 测。现在国际普遍认为ＥＬＩＳＡ试验和荧光偏振试验 方法的研究进畏Ⅱ】冲国兽药杂 ２０１１，（１１）：３７—４２． ［３１赵丽布鲁氏茵病实验室诊断研究进展Ｕ】冲外健康文 摘，２０１２，３４：４５—４８． 【４】许邹亮，南文，周洁龙．布鲁氏茵环介导等温扩增 （ＬＡＭＰ）可视化检测方法的建立 中国动物检疫， 在诊断操作特性上与ＣＦＴ相当甚至更好，又因这些 ２０１１，２８（８）：３７—４０． ｏ