诊断试剂盒

一、项目可行性报告

（一）立项的背景和意义。

结核病(tuberculosis, TB)是由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis, MTB)引起的以呼吸道传播为主的慢性传染病，是当今世界由单一致病菌感染引起的死亡率最高的疾病，严重威胁着人类的健康。特别是近10年来由于人口剧增、耐药性的产生、人类免疫缺陷病毒感染流行、免疫抑制剂的使用等原因，结核病日益严重，全球结核病疫情骤然回升。据资料报道，当前全球1/3的人感染了结核杆菌，每年有800万至1000万新发结核病患者，有300万人死于结核病[1-4]。我国的结核病流行情况十分严峻，结核病人数位居世界第二位，约占全球结核病人的四分之一，是全球22个结核病高负担国家之一，每年由结核病带来的直接经济损失超过40亿。2000年在我国31个省、直辖市、自治区组织进行第四次全国结核病流行病学抽样调查，结果显示全国人口结核感染率为45%，高于WHO估计的1/3水平，估计全国结核菌感染者5.5亿。农村结核患病率高于城市，西部地区患病率高于东部地区。全国现有活动性肺结核病人451万，菌阳肺结核病人196万，每年死亡人数约13万，在传染病中居第一位，是其它各种传染病和寄生虫病死亡人数总和的2倍，结核病的发病数和死亡数自2005年初以来居27种甲乙类传染病首位，结核病已经超过肝炎一跃成为我国危害最严重的传染病。因此在全国范围内采取有效遏制结核病的策略刻不容缓[5-8]。

（二）国内外研究现状和发展趋势。

由于结核主要通过飞沫传播，因此结核病的早期诊断非常重要，利用简单、快速、准确的实验室检查尽早对结核病做出诊断对控制结核病疫情至关重要。然而目前，结核病的诊断现状不尽人意，体外分枝杆菌分离培养是诊断结核病的金标准，其缺点是：培养周期长（约6周），假阳性率高[9]。近年来应用于临床的Bactec分枝杆菌培养/鉴定/药敏系统可将阳性标本检出时间缩短至平均9天，鉴定、药敏试验时间平均为4天，然而Bactec仪器价格昂贵，需进口厂家的专利液体培养基，费用较高，且方法仍然建立在以细菌培养的基础之上，不管是检测菌体还是检测代谢产物，都要通过分枝杆菌的自然生长以积累菌量方能检出，而分枝杆菌的生长相对缓慢，因而它们都难以突破“慢”的限制[10]。结核病诊断的免疫学检测，目前仍普遍基于感染免疫学的概念检测结核菌抗原及其特异性抗体，国内外研究者采用脂阿拉伯甘露聚糖(LAM) 、脂多糖(LPS) 、结核菌重组蛋白相对分子量38 000 等或其他纯化蛋白作为抗原，以胶体金标记，建立简便、快速免疫学诊断方法，如分子量

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38 000的金标渗滤试剂以及结核特异性抗原免疫印迹检测技术。但是，由于结核菌在属间和种间存有共同的抗原决定簇，加之其与体液免疫的相关性目前尚未得到充分的阐明，因而在综合提高实验的敏感性和特异性方面未能取得实质性的进展[11-13]。结核病免疫学检测，目前最常用的是PPD试验，以机体对注射的PPD 是否产生变态反应来判断机体曾否感染过结核菌而作为一项辅助诊断指标。但是，由于PPD中含有许多分支杆菌共同的抗原，如卡介苗接种者PPD 试验可呈现阳性结果，PPD皮试阳性并不能鉴别是因为结核分枝杆菌复合群感染还是接触环境中非结核分枝杆菌或卡介苗接种后造成的致敏。PPD皮试诊断的特异性差，用该方法进行结核病流行病学调查获得的结核分支杆菌感染率并不能真正反映人群中结核分支杆菌感染的实际状况。重症肺结核病人则往往因为机体免疫力低下而呈现阴性结果等情形，都大大降低了其临床价值[14]。另外，近年来发展起来的分子诊断技术如PCR、PCR-RFLP、real-time PCR以及基因芯片技术，大多数需要数小时才可以得到结果，且这些技术需要昂贵的仪器，存在假阳性和假阴性的问题，对实验室硬件和检测人员素质要求较高，故非常不适用于现场的快速检验、早期排查和诊断[4, 15, 16]。

时间分辨荧光分析法（time resolved fluoroimmunoassay, TRFIA）是近十年发展起来的一种微量分析方法，是目前最灵敏的微量分析技术，灵敏度完全可与放射免疫分析技术相媲美，甚至超过放射免疫分析的水平。时间分辨荧光分析法实际上是在荧光免疫分析（fluorescent immunoassay, FIA）的基础上发展起来的一种特殊的荧光分析。在通常的荧光分析中，由于测试样品中含有多种荧光成分，背景荧光（来自胶体颗粒和溶剂分子引起的散射光、血清蛋白质和其他化合物发出的非特异性荧光）强度大，干扰强，成为荧光分析法大范围推广使用的瓶颈。时间分辨荧光免疫分析法可以有效的解决这一难题。它的基本原理用镧系金属离子（如Eu3+、Sm3+、Tb3+、Dy3+）作为示踪物标记蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞，镧系元素作为示踪剂有以下特点：①荧光物质激发光谱曲线的最大吸收波长和发射光谱的最大发射波长之间的差，称为Stokes位移。普通荧光物质荧光光谱的Stokes位移只有几十纳米，激发光谱和发射光谱通常有部分重叠，互相干扰严重。镧系元素Stokes位移达200nm，很容易分辨激发光和发射光，从而排除激发光干扰；②镧系元素与普通的荧光团比较，镧系元素离子螯合物荧光的衰变时间长，为传统荧光的103～106倍，镧系元素的荧光半衰期介于10～1 000μs之间。这样，用时间分辨荧光仪测量镧系元素的荧光时，在脉冲光源激发之后，可以适当的延迟一段时间，待血清、容器、样品管和其他成分的短半衰期荧光衰变后再测量，这时就只存镧系元素标记物的特异性荧光。通过时间延迟和波长分辨，极大地降低了本底荧光。待反应 (如抗原抗体免疫反应、

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生物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应细胞的杀伤反应等)发生反应后，用时间分辨荧光仪测定最后产物中的荧光强度，即可推测反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的。TRFIA具有以下优点：①灵敏度高，检测下限为1pmol，达到或超过放射免疫分析水平；②线性范围宽，可达6个数量级，远远宽于ELISA的线性范围，也超过化学的线性范围；③不受样品中自然荧光干扰，背景低；④可多重标记（如两种不同的抗原可分别用Eu3+、Sm3+标记），一个试剂盒能够同时检测出两种或两种以上的项目；⑤操作简便、易自动化，标记物制备简便且稳定，无放射性污染。由于TRFIA技术集酶标记、同位素标记技术的优点于一身，同时又克服了它们的局限。因此，TRFIA是一种公认的继RIA、EIA之后最有发展前途、值得推广的非放射免疫标记技术，目前已经成为基础医学研究和临床治疗监测等方面的重要手段[17-19]。

近年来，人们对结核分枝杆菌培养的滤液进行了深入的研究，分离出了多种分泌蛋白，如MPT64、PT70、MPT63、MPT53、Ag85、CPF10和ESAT6[20]。其中，结核杆菌培养滤液蛋白10(culture filtrate protein 10, CFP10) 和早期分泌性抗原靶6(early secretory antigenic target-6, ESAT6)为结核分枝杆菌和牛结核分枝杆菌所特有，卡介苗（BCG）及非致病分枝杆菌缺乏。CFP10与ESAT6同属于ESAT6家族，且由同一操纵子调控，产生的蛋白能诱导机体产生强烈的免疫应答[21-24]。ESAT6分子量很小，仅6KD，难于用双抗夹心法进行检测。本研究采用时间分辨荧光免疫分析双抗夹心技术，建立了定量检测CFP10的方法，初步临床试验结果表明，CFP10用于结核患者血清检测敏感性较低，但用于结核性胸腔积液的诊断敏感性在80%以上，特异性达100%，是一个非常有开发潜力的结核病新型诊断试剂盒，可以有效地鉴别诊断结核性、癌性和其他感染性胸腔积液。

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（三）项目主要研究开发内容、技术关键及主要创新点。 开发内容：

①结核杆菌CFP10的原核表达。

②以纯化的CFP10作为抗原，通过杂交瘤细胞技术得到CFP10的单克隆抗体。 ③建立基于时间分辨荧光免疫分析的结核病新型诊断技术：采用双抗夹心法检测CFP10。

④临床应用及评价。 技术关键：

建立时间分辨荧光免疫分析检测CFP10的新方法：采用双抗夹心法。经筛选得到最佳配对的两株单克隆抗体，一株单克隆抗体包被固相载体，另一株单克隆抗体用Eu3+标记，

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经过免疫反应形成免疫复合物后，用增强液将Eu3+从复合物上完全解离下来，与另一种螯合剂结合，检测荧光信号。荧光信号强弱与CFP10含量成正比。由于时间分辨荧光免疫技术检测线性范围宽，因此我们可以精确地对CFP10进行定量分析。

主要创新点：

目前结核病的诊断主要采用分离培养、微生物学、免疫学和分子生物学方法，存在的主要问题是检测时间长，或者容易出现假阳性、假阴性问题，或者需要昂贵的仪器和试剂。CFP10为结核分枝杆菌和牛结核分枝杆菌特有，卡介苗及非致病分枝杆菌缺乏这两种蛋白，因此检测CFP10可以避免因非致病分枝杆菌感染或接种卡介苗而出现假阳性问题。国内外已建立ELISA等方法来检测CFP10，但ELISA灵敏度较低，容易出现假阴性，线性范围也很窄，难于定量分析。

我们建立基于时间分辨荧光免疫技术检测CFP10的方法，可以大大提高检测的灵敏度，同时还可较对精确地进行定量分析。目前国内外还没有这方面的文献报道。由于时间分辨荧光免疫技术可以精确地对CFP10进行定量检测，我们就可以探讨CFP10含量与结核病临床分期（结核菌潜伏感染期、结核病非活动期、活动不排菌期、耐药结核病和肺外结核病之间）的关系，为结核病的早期诊断、病程监测及其治疗提供技术支持。

单抗的活性、特异性和匹配性对免疫试剂盒至关重要。由于CFP10分子量不大，10KD，如果以CFP10完整肽链免疫小鼠制备抗体，由于抗体针对的抗原决定簇不明，抗体两两配对往往是盲目的，只要两株抗体存在结合的抗原表位存在几个氨基酸的重复，则配对肯定不成功。本研究采用CFP10多肽（肽段）制备单克隆抗体制备：根据抗原性、亲水性、表露性、柔韧性等原则设计针对CFP10不同部位的多肽片段，将这些片段与载体蛋白——血蓝蛋白(KLH)偶联，免疫小鼠，用基因工程表达的CFP10重组蛋白筛选杂交瘤细胞，以避免产生血蓝蛋白抗体克隆的干扰。这样就可以得到一系列针对CFP10明确抗原决定簇的单克隆抗体，然后将这些抗体两两配对进行筛选，以得到检测CFP10的最佳配对抗体。这样操作制备的多肽抗体比用CFP10整个多肽链免疫小鼠制备单克隆抗体更容易配对成功且效果更佳。

（四）项目预期目标（主要技术经济指标、社会效益、技术应用和产业化前景以及获取自主知识产权的情况）。

（1）建立-时间分辨荧光免疫分析检测CFP10的新方法，该方法具有高灵敏度、高特异性、定量精确的特点，主要技术指标达到国际先进水平或国内领先水平。利用建立的方法为临床诊断和治疗结核病提供技术上的支持，开发成产品应用于临床，市场前景广阔，

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完全可以创造出良好的社会效益和经济效益。

（2）开发具有自主知识产权的结核病诊断试剂盒，为申报医疗器械三类体外诊断试剂注册证书创造条件，申报国家发明专利1项，撰写科研论文1-2篇。

（3）建立时间分辨荧光免疫分析技术平台，为研制其它疾病标志物的诊断试剂盒提供技术支撑。

（五）项目实施方案、技术路线、组织方式与课题分解。 （1）研究方案

①重组抗原的原核表达：以结核分枝杆菌标准株 H37Rv 基因组DNA为模板，分别设计针对CFP10的特异性引物，进行PCR扩增，PCR产物纯化后与表达质粒pET32a(+)构建成重组质粒pET-cfp10。在大肠杆菌BL21(DE3)中表达带组氨酸标签的蛋白，经亲和层析得到纯化CFP10蛋白。

②单克隆抗体制备：选用6～10周龄、健康、发育良好的雄性BALB/c小鼠，人工合成的CFP10多肽与血蓝蛋白偶联后作为抗原，与等量完全福氏佐剂(CFA)充分乳化后对小鼠腹腔或皮下多点注射，以后每间隔2周以同样剂量抗原加等量不完全福氏佐剂腹腔或皮下注射，共3～5次。末次免疫后3～4天，分离脾细胞与骨髓瘤细胞株Sp2/0用PEG进行融合。用HAT培养基进行筛选，融合细胞呈克隆生长，细胞培养至覆盖20%孔底时，吸取培养上清用ELISA检测抗体含量。首先依抗体的分泌情况筛选出高抗体分泌孔，将孔中细胞再行克隆化，尔后进行抗原特异的ELISA测定，选高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存于液氮。单克隆抗体的制备采用小鼠腹腔接种法。选用BALB/c小鼠，先用液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将5×105杂交瘤细胞/鼠接种到腹腔中。接种一周后收集腹水。单克隆抗体纯化采用亲和层析法，用抗小鼠球蛋白抗体与载体（Sepharose）交联，制备亲和层析柱，将抗体结合后洗脱，回收后得到CFP10的单克隆抗体。

③建立基于时间分辨荧光免疫分析的结核病新型诊断技术。

结核杆菌培养滤液蛋白10（CFP10）：双抗点夹心分析法。针对CFP10上不同抗原决定簇的两个单克隆抗体，一个包被固相载体，另一个用Eu3+标记，经过免疫反应形成免疫复合物后，用增强液将Eu3+从复合物上完全解离下来，与另一种螯合剂结合，检测荧光信号。荧光信号强弱与CFP10含量成正比。

④临床应用及评价：将我们建立的时间分辨荧光免疫技术检测CFP10的方法应用于临床，并与国产和进口的检测结核杆菌的试剂进行对比，评价CFP10时间分辨荧光免疫法的临床应用价值。

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（2）技术路线：

基因工程技术

CFP10的原核表达 参考标准品 合成一系列CFP10多肽片段并与血蓝蛋白偶联

杂交瘤技术

一系列抗CFP10单克隆抗体 Eu3+标记、纯化和鉴定

未标记抗体（捕获）与标记抗体（检测）配对， 筛选最佳配对组合的单克隆抗体 双抗夹心检测CFP10方法的建立与优化

灵敏度、稳定性、精密度和特异性的评价 临床验证 （3）组织方式与课题分解：该项目系本校课题组先建立基于时间分辨荧光免疫分析检测CFP10的方法，并从结核病医院收集临床标本进行验证，进而与生物技术公司合作开发成产品加以推广应用。

（六）计划进度安排。

2012.01-2012.12：临床应用与评价。大量收集结核患者的胸腔积液（或关节积液、脑脊液等）样本，将建立的方法应用于临床，并与结核分枝杆菌的其他检测结果进行对比，评价该方法的临床应用价值。

2013.01-2013.12：分析数据，撰写科研论文1-3篇，申报国家发明专利1项，为申报医疗器械三类体外诊断试剂盒注册证创造条件。

（七）现有工作基础和条件。 （1）本项目已开展的前期研究工作 一、CFP10的表达

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M 1 2

M：DNA marker(2000、1000、750、500、250、100bp)；

1：PCR扩增产物；

2：以pET24b-CFP10为模板的PCR扩增产物

图1 CFP10 PCR扩增产物

M 1 2

M：DNA marker(2000、1000、750、500、250、100bp)；

1：pET24b-CFP10重组质粒；

2：Nde I和Hind III双酶切pET24b-CFP10重组质粒

图2 pET24b-CFP10重组质粒酶切鉴定

M 1 2 3 4

M：蛋白Marker（97.2、66.4、 44.3、29.0、20.1、14.3KD）；

1：IPTG诱导前；2：IPTG诱导后；3：表达CFP10菌液超声后离心上清；

4：纯化的CFP10蛋白

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图3 pET24b-CFP10在大肠杆菌中表达及纯化

二、 建立TRFIA检测CFP10的方法

CFP10其中一个单克隆抗体用Eu3+标记：取出待标记单抗250mg，加入millipore柱中→9000rpm，8min，弃滤液→加200ul标记缓冲液，9000rpm,8min，弃滤液，重复该步骤5次→加入50 µL标记缓冲液，倒扣离心柱装入另一新离心管， 8000rpm，6min ，收集滤液→按待标记物：EuNa=5:1(质量比)加入铕标配体，置摇床上过夜。

纯化：用G-50凝胶层析柱纯化。装柱→洗脱缓冲平衡→加样→洗脱缓冲液洗脱，流速1 mL/min。加样后即开始收集， 1 mL/管，共30管。→洗杂液冲洗→洗脱液平衡→20%乙醇保存凝胶柱。→从30管收集管中各取出5µL，加入200µL增强液，振荡5min。→时间分辨荧光免疫仪检测，收集第一峰。

包被抗体深度优化：分别取3、6、12µg/mL的抗体进行包被，加入CFP10和Eu3+标记抗体，结果荧光值无明显变化，因此包被抗体浓度确定为3µg/ml。

Eu3+标记抗体浓度优化：以3µg/mL抗体进行包被，加入CFP10，洗涤后，分别加入0.4、0.8、1.6、3.2µg/mL Eu3+标记抗体，结果荧光值（3复孔取平均值）分别为：25876、47865、48764、49752，因此标记抗体浓度确定为0.8µg/mL。

标准曲线：将CFP10标准品进行系列稀释，浓度分别为0.2、1、5、25、125ng/ml，三个复孔取平均值，制做标准曲线，Y＝1.03X+4.03，R=1.000。

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线性范围：将将CFP10标准品进行系列稀释，浓度分别为0.0016、0.008、0.04、0.2、1、5、25、125、625、3125ng/ml，结果检测下限为0.04ng/ml，在0.04-3125ng/ml范围内线性良好，R=0.958。

检测精密度：批内CV=0.057，批间CV=0.093。 （2）工作基础和条件：

本申请人所在的研究所系浙江省高校重点学科，拥有浙江省某学科重点实验室，面积2000多M2，装备了一批先进的仪器设备，包括全自动时间分辨荧光免疫分析系统、MS-12 型磁分离器、荧光定量PCR仪（MJ Opticon2）、基因分析系统（Beckman Coulter CEQ8800）、流式细胞分析仪（BD FACS Aria）、透射式电子显微镜（日立H-7500）、激光共聚焦显微镜（Olympus FV1000 + SIMS ）、核苷酸片段分析系统（Transgenomic WAVE2100 ）、蛋白质组学工作站（Bio-Rad）、AKTA Purifier蛋白纯化系统（GE healthcare）等等。建立的实验技术平台主要有：核酸扩增、测序分析研究平台，遗传与生物信息分析平台，细胞与基因工程技术平台等。

本研究课题组第二负责人已成功建立TRFIA技术平台：研制了近50余种TRFIA试剂盒，如乙肝五项、HIV、HCV梅毒螺旋体等，获国家新药证书三项，33种医疗器械三类体外诊断试剂获中华人民共和国医疗器械注册证和生产批文。已按照临床免疫学诊断试剂盒生产的国家和国际规范，建立了符合SFDA要求的TRFIA免疫诊断试剂盒的生产和检定标准，达到年生产1000万人份TRFIA免疫诊断试剂盒的规模。

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二、经费概算： 附表：

省级科技计划项目经费概算表

项目名称：结核性胸腔积液特异诊断试剂盒研制 金额单位： 15万元

概算科目名称 （1） 合计 （2） 省财政拨款 经费 （3） 自筹经费 （4） 一、经费支出（合计） （一）直接费用 1、设备费 （1）购置设备费 （2）试制设备费 （3）设备租赁费 2、材料费 3、测试化验加工费 4、燃料动力费 5、差旅费 6、会议费 7、合作协作研究与交流费 8、出版/文献/信息传播/知识产权事务费 9、劳务费 10、专家咨询费 20 19.0 0 0 0 0 11.0 3.0 0 1.0 0.5 0.5 0.5 2.0 0.5 1.0 1.0 0 0 20 19.0 0 0 0 0 11.0 3.0 0 1.0 0.5 0.5 0.5 2.0 0.5 1.0 1.0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 （二）间接费用 11、管理费 12、激励费 （三）其他 13、其他费用明细说明 二、经费来源（合计） 1、申请省财政经费 2、自筹经费 （1）单位自有货币资金 （2）地方、部门配套拨款 （3）其他资金 15 15 0 0 0 0 15 15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 12

注：支出概算按照经费开支范围确定的支出科目和不同经费来源编列，同一支出科目一般不同时在财政拨款经费和自筹经费中概算。

省级科技计划项目经费概算说明

一、对承担单位和相关部门承诺提供的支撑条件进行说明

本课题的依托单位系大型综合性医疗、科研单位，系浙江省重中之重学科，完全具备课题研究中的仪器设备、场地、人员以及产品开发条件。单位承诺在资金上给予1:0.7的配套支持，并在人力和物力给予相应的配套支持，以确保所承担课题高质量的完成。

本课题组人员结构合理，主要成员在相关研究领域都有很好的工作基础。

二、各科目支出的主要用途、与项目研究的相关性、概算方法、概算依据详细分析说明 （1）设备费：无 （2）材料费：11.0万元  分子生物学实验0.5万元

逆转录酶、高保真DNA聚合酶、限制性内切酶、连接酶和其它工具酶 0.25万元； 质粒抽提试剂盒、凝胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒等0.25万元。  实验耗材3万元

15 ml离心管、50ml离心管 、10 ml移液管 、5 ml移液管、1 ml移液管 、48孔培养板、96孔培养板、24孔培养板、酶标板、培养瓶25CM、培养瓶75CM、冻存管、一次性吸头、一次性帽子、一次性口罩、一次性鞋套、一次性手套。每年1.5万元，两年共计3万元。

 基因工程表达CFP10：1万元

①分子克隆0.5万元

用于购买IPTG、蛋白胨、酵母提取物、氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素等，测序。 ② 表达及纯化：

NI-NTA agarose、尿素、咪唑、谷胱甘肽（氧化型、还原型）等试剂0.5万元  杂交瘤技术制备抗CFP10的单克隆抗体：3万元

BALB/c小鼠：50元/只×100只＝0.5万元 骨髓瘤细胞株Sp2/0：0.5万元 胎牛血清：0.5万元

完全福氏佐剂、不完全福氏佐剂、PEG：0.5万元 抗体纯化亲和层析柱：1万元

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 抗CFP10单克隆抗体的铕标记：1.5万元

DTTA-NaEu：1.0万元 G50层析柱:0.5万元

 建立TRFIA检测CFP10的方法：2万元

包被液、封闭液、分析缓冲液、增强液、洗液、微孔板等：1万元 自己制备的CFP10多个单克隆抗体两两配对筛选：1万元 （3）测试化验加工费： 3万元

结核患者标本收集500例以上：2.0万元；

与检测结核分枝杆菌的其他方法进行比较：1.0万元。 （4）燃料动力费 无

燃料动力费由重点实验室支付，本项目不支付此费用。 （5）差旅费：1.0万元

在研究过程中开展科学实验（试验）、科学考察、业务调研、学术交流等所发生的外埠差旅费、市内交通费用等费用。差旅费的开支标准严格按照国家有关规定执行。

外埠（如北京等地）差旅费：以1000元/人次计算，共需8人次，预算支出0.8万元 市内交通费：以50元/人次计算，共需40人次，预算支出0.2万元 （6）会议费：0.5万元

参加专业学术研讨会2次，每次0.25万元，共计0.5万元。 （7）合作、协作研究与交流费：0.5万元

业务骨干参加会议2次，每次1人，每人次费用（差旅交通费1000元/人次，住宿、餐费与工杂250元/人天，每次平均2天）=0.5万 （8）出版/文献/信息传播/知识产权事务费：0.5万元

专利委托申请0.2万元/个×1个=0.2万 论文发表 1500元/篇×2=0.3万 （9）劳务费：2.0万元

课题组研究生津贴，每人每月500元（共2人），每年度预计投入时间各10个月，合计500×2×10×2=2.00万元。

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（10）专家咨询费：0.5万元

主要用于支付给临时聘请的咨询专家的费用，课题需要咨询以会议形式组织的咨询：高级专业技术职称人员约3人（800元/人天）、其他专业技术人员约4人（400元/人天）。通讯形式组织的咨询：高级专业技术职称人员约5人次（200元/人次），共计0.5万元。 （11）管理费：1.0万元

本项目的管理费按5%收起，用于依托单位管理和使用项目研究过程中对现有仪器设备及房屋，日常水、电、气、暖消耗，以及其他有关管理费用的补助支出。 三、其他费用：无。

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