冷冻切片+HE染色操作步骤-20160622

(1) 1%盐酸酒精： 99份无水酒精加上1份浓盐酸 (2) 70%、80%、90%、100%乙醇、二甲苯 操作步骤： 一、切片：

将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。在制成冻块后，即可置入恒冷箱切片机冰冻切片。若需要保存，应快速以铝箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱贮存备用。

3．固定：

样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，4℃冰箱预冷5-10min让OCT胶浸透组织。 取下组织置于锡箔或者玻片上，样品托速冻。 组织置于样品托上，其上再添一层OCT胶，以完全覆盖为宜，速冻架（PE）上30min。 4.切片：

恒温冰冻切片机为较理想的冰冻切片机，其基本结构是将切片机置于低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至5-10μm。切片时，低温室内温度以-15℃～-20℃为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组织切片，切勿上下移动。切好室温放置30min后，入4℃丙酮固定5~10min，烘箱干燥20min。PBS洗5min×3。进行抗原热修复，微波热修复也可，室温自然冷却。可用3%H2O2孵育5~10min，消除内源性过氧化物酶的活性。

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二、染色：

1. 苏木素染色：玻片浸没于苏木素的染色缸中3min，用自来水冲洗至其表面干净即可； 2. 显微镜观察：细胞核着色呈深紫色，细胞核呈浅蓝色即可；若着色浅，此过程可反复。 3. 玻片浸没于1%的盐酸酒精染色缸内2s，快速取出，用自来水冲洗干净。 4. 显微镜观察： 细胞核呈紫蓝色，细胞浆呈无色即可。 5. 返蓝: 自来水返蓝或者1%氨水返蓝，返蓝至细胞核呈蓝色；

6. 伊红染色：将玻片浸没于伊红的染色缸中1min，用自来水冲洗至其表面干净即可。 7. 显微镜观察：细胞核呈现蓝色，细胞浆呈现红色即可。

8. 透明（可选做）利用梯度酒精和二甲苯对染色完的切片进行透明处理，可以延长玻片的保存时间。70%乙醇(10s)—80%乙醇(10s)—90%乙醇(30s)—无水乙醇(1min)—二甲苯I(1min)—二甲苯II(1min) 9. 中性树胶封片，择日拍照。

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