发根农杆菌R1000菌株对抗生素抗性反应及毛状根诱导影响研究

福建林业　ＦＵＪＩＡＮＬＩＮＹＥ　科学研究　⑩　发根农杆菌Ｒ１　０００菌株对抗生素抗性反应及毛状根诱导影响研究　黄淑燕　，郑郁善　（１．福建林业职业技术学院，福建南平３５３０００）　摘要：通过对发根农杆菌Ｒ１０００菌株对抗生素抗性反应的试验研究发现，其在适宜条件下培养，在培养的４８ｈ内　呈不断上升生长趋势；对抗生素头孢噻腭钠（Ｃｅｆ）进行抗性筛选发现，当菌液０Ｄ㈣值为０．９，抗生素浓度为１０００　ｍｇ・Ｌ一时，抑菌圈直径最大，抗生素作用效果最好，当菌液０Ｄ枷值一定时，抑菌圈大小与浓度成正比；对卡那霉　素（Ｋｍ）进行抗性筛选时发现，卡那霉素对发根农杆菌的抑菌效果差，不能很好地抑制菌体增殖生长；在抗性时间　试验中得出，菌落出现时间随抗生素浓度上升而延迟。　关键词：发根农杆菌；抗生素；抗性　中图分类号：￥６０３．２　文献标识码：Ａ　文章编号：１００３—４３８２（２０１４）０１—００２５—０３　Ｔｈｅ　ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ’ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｒ　１　０００　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｈａｉｒｙ　ｒｏｏｔ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　（ＨＵＡＮＧ　Ｓｈｕ－ｙａｎｌ。　ＺＨＥＮＧ　Ｙｕ－ｓｈａｎ　）　ｆ１．Ｆｕｊｉａｎ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｖｏｃａｔｉｏｎａｌ＆Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｎａｎｐｉｎｇ，Ｆｕｊｉａｎ　３５３０００，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｒｏｕｇｈ　ｔｈｅ　ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｒ１０００　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ，ｗｅ　ｆｏｕｎｄ　ｗｈｅｎ　ｔｈｅ　ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｉｓ　ｓｕｉｔａｂｌｅ，ｉｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ａ　ｒｉｓｉｎｇ　ｔｒｅｎｄ　ｉｎ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆｏｒ　４８ｈ’Ｓ　ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ；Ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｆｏｒ　Ｃｅｆ，ｉｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ，ｗｈｅｎ　ｔｈｅ　０Ｄ　ｖａｌｕｅ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｉｑｕｉｄ　ｗａｓ　０．９　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　ｗａｓ　１０００　ｍｇ・Ｌ～，Ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃ　ｒｉｎｇ　Ｓ　ｃｉｒｃｌｅ　ｗａｓ　ｔｈｅ　ｌａｒｇｅｓｔ　ａｎｄ　ｔｈｅ　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ　ｗａｓ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ．Ｗｈｅｎ　ｔｈｅ　０Ｄ６００　ｖａｌｕｅ　ｗａｓ　ｆｉｘｅｄ，ｔｈｅ　ｓｉｚｅ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃ　ｒｉｎｇ　ｗａｓ　ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；Ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｆｏｒ　Ｋｍ，ｉｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ　ｗａｓ　ｗｏｒｓｔ，Ｎｏｔ　ｗｅｌｌ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ；Ｔｈｏｕｇｈｔ　ｔｈｅ　ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔｉｍｅ，ｗｅ　ｆｏｕｎｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｃｏｌｏｎｉｅｓ　ａｐｐｅａｒｅｄ　ｗａｓ　ｄｅｌａｙ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃ０ｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ；Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ；Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　发根农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）是根瘤菌科　（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）农杆菌属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）的一种革兰氏　阴性土壤细菌，是一种寄主非常广泛的土壤细菌，能够　侵染几乎所有双子叶植物和少数单子叶植物，诱发植　物组织发生癌变，生成茎瘿ｃａｎｅ　ｇａｌ１），并在侵染部位　形成毛状根［１１。发根农杆菌Ｒｉ质粒的ＴＬ—ＤＮＡ上有　ｒｏｌＡ—Ｄ基因群，ＴＲ—ＤＮＡ有ｔｍｓ基因，被感染的寄主植　物伤口可产生大量的不定根，对插枝困难的某些木本　植物、裸子植物，如葡萄、桃子、杉树等有促进生根的作　用，提高成活率　。发根培养技术的发展历史虽然较　短，但Ｒｉ质粒作为植物基因工程载体已显示出其可行　性与方便性，随着研究的深入，它将会成为比ｒｒｉ质粒　更理想的基因转移系统，更多的次生代谢产物将会通　过发根培养系统来生产，并被用于难以插活植物的生　根和生产外源基因产品［４１。但采用发根农杆菌侵染植物　后，会导致菌体在培养基中大量繁殖，严重影响毛状根　培养效果，因而本试验通过对抗生素头孢噻腭钠（Ｃｅｆ）　及卡那霉素（Ｋｍ）对发根农杆菌的菌体生长抑制情况　的试验研究，得出菌液浓度（ＯＤ６００值）对应的合适的抗　生素使用种类及浓度，以及发根农杆菌浸染植物的时　间。本次试验将对发根农杆菌诱导毛状根起到一定的　基础作用。　系李玲教授）；发根农杆菌活化培养基即ＹＥＢ培养　基：蛋白胨５ｇ・　十牛肉浸膏５ｇ・Ｌ　＋酵母浸膏１ｇ・Ｌ。＋　蔗糖５ｇ・　＋硫酸镁０．５　ｇ・　（固体培养基加１５ｇ・ＩＪ＿　琼　脂条，ＰＨ＝７．０左右）；卡那霉素（Ｋｍ）、头孢噻腭钠（Ｃｅｆ）　抗生素均购自北京东胜泰博科技有限公司。　备注：发根农杆菌的长期保存方法是将农杆菌溶　于甘油中，于一７０℃条件下保存，这种方法可保存菌种　几年。短期保存方法是将发根农杆菌接种于固体平板　培养基上培养，当长出ｌｃｍ左右的菌斑后，于４℃冰箱　中保存，此种方法可以保存菌种数月。　１．２仪器设备　锥形瓶（５００ｍＬ、１０００ｍＬ若干）、移液枪（２０—　２００￣Ｌ、１０００￣Ｌ）、恒温振荡器、超净工作台、高压蒸汽　灭菌锅、电炉、分光光度计、恒温光照培养箱、量筒、接　种刀、镊子、微孔滤膜过滤器、玻璃注射器、接种器械灭　菌器、电子天平、低温冰箱、离心管、组培沙酱瓶、培养　皿、烘干箱等。　１．３试验方法　１．３．１茵液生长曲线测定　将发根农杆菌ＲＩＯ００培养在含５０ｍｇ・Ｌ　Ｋｍ的　ＹＥＢ液体培养基上，置于恒温振荡器上，温度为２８℃，黑　暗培养４８ｈ，每隔４ｈ测定菌液０Ｄ鲫值并观察生长情况。　１．３．２头孢噻腭钠（Ｃｅｆ）抗性筛选　１材料与方法　１．１材料及试剂　发根农杆菌菌株：Ｒ１０００（购自华南师范大学生物　六收稿日期：２０１３—１１－２９　修回日期：２０１４－０２－１０　将ＯＤ６００值为０．６、０．９、１．２、１．５的菌液混于温度为　４５℃左右的ＹＥＢ培养基中，待其凝固后，用切去尖部　喜蓄界　菠囊　翥幕　蒹　莩；　，　与观赏园艺研究。　通讯作者：郑郁善（　一６二；）：，畜：男，藉莛　：福建永泰人，曩鏊：教授，铃妻早蓐鼐　博士生导师，从事森林培育学　究。究。　１９６　０ＦＵＪＩＡＮ　ＵＮＹＥ　＠　⑩　科学研究　值为１．５的处理号为Ｙｃ　ｚ。　表２培养４８ｈ抑菌效果　ＯＩ）Ⅲ值（Ａｂｓ）　址套号　抗生蠢潦度（ｍｌ－Ｌ　）　０．６　Ｙｃｌ　０　福ＦＵＪ建ＩＡＮ林ＬＩＮ业ＹＥ　押曹■大小（ｃｍ）　平均值　０　的灭菌的枪头均匀打出６个小孔，分别向内滴加５　Ｌ　不同浓度的头孢噻腭钠（Ｏ、５０、１００、２００、４００、６００、８００、　ｌＯ００ｍｇ・Ｌ　），置于培养箱中２８℃、黑暗条件下，恒温培　养３６ｈ以上，观察抑菌圈的大小。　１．３．３卡那霉素（Ｋｍ）抗性筛选　将ＯＤ６００值为０．６、０．９、１．２、１．５的菌液混于温度为　４０℃左右的ＹＥＢ培养基中，待其凝固后，用切去尖部　的灭菌的枪头均匀打出６个小孔，分别向内滴加５　Ｌ　不同浓度的卡那霉素（０、２０、４０、６０ｍｇ？Ｌ一１），置于培养　箱中２８℃、黑暗条件下，恒温培养３６ｈ以上，观察抑菌　物的根茎叶等部位的浸染，进行植物毛状根诱导。　２．２头孢噻腭钠（Ｃｅｆ）对发根农杆菌抑制效果研究　０Ｄ６００值为０．６的处理号为Ｙｃ　＿８，０Ｄ６００值为０．９的　处理号为Ｙｃ　，ＯＤ６００值为１．２的处理号为Ｙ　１７－２４，０Ｄ６００　Ｙｑ　Ｙ日　５０　１００　０　Ｏ　圈直径大小。　１．３．４抗生素抑茵时间研究　（１）头孢噻腭钠Ｃｅｆ抑菌时间研究　用接种环蘸取对数生长期的菌液在含有不同浓度头　孢噻腭钠（０、５０、１００、２００、４Ｏ０、６００、８００、ｌＯ００ｍｇ・Ｌ　）的　ＹＥＢ培养基（琼脂ｌＯｇ・　）上划平板。置于恒温培养箱中　２８℃、黑暗条件下培养，每隔５ｒａｉｎ观察菌落生长情况。　（２）卡那霉素Ｋｍ抑菌时间研究　用接种环蘸取对数生长期的菌液在含有不同浓度　卡那霉素（Ｋｍ）（０、２０、４０、６０　ｍｇ・Ｌ　）的ＹＥＢ培养基　（琼脂１０ｇ・Ｌ　）上划平板。置于恒温培养箱中２８℃、黑　暗条件下培养，每隔５ｒａｉｎ观察菌落生长情况。　２结果与分析　２．１发根农杆菌Ｒ１０００生长曲线绘制　表１发根农杆菌Ｒ１０００培养４８ｈ生长情况表　图１发根农杆菌Ｒ１０００生长曲线图　据上述图表得出，发根农杆菌ＲＩＯ００生长速度在　２４ｈ－２８ｈ之间达到最高峰，这一期间，发根农杆菌的感　染诱导能力最佳；在培养５３ｈ之后虽又是发根农杆菌　生长的另一高峰，但因培养时间延长，其活性、感染诱　变能力随之下降；同时还考虑发根农杆菌培养时间一　经延长，菌液生长旺盛，在毛状根培养的除菌阶段很难　彻底地清除农杆菌，影响毛状根的生长；因而待发根农　杆菌培养至２４ｈ－２８ｈ的时间区间，便可采用其进行植　Ｙｑ　２００　０　Ｙｈ　●００　０．５８（０．５　．‘）　Ｙ　‘ＯＯ　０．７５（０．‘　．３）　Ｙ　８ＯＯ　０．９７（０，９－１．Ｏ）　Ｙｑ　ＩｏｏＯ　１．　（１．２一１．４）　０．９　Ｙ　０　０　Ｙｔｕ　５Ｏ　０　Ｙｅｌｌ　１０ｔｌ　０　Ｙ　２００　０．ｔ６（０　ｌ　０）　Ｙ　ｌ，４００　０－５５（Ｏ－５　６）　Ｙ　ｌ４　６０Ｏ　０．７７（Ｏ・７　・８）　Ｙ。ｌ５　８００　０．　（０．，－ｌ－Ｏ）　Ｙ　“　ＩＩＩＯ０　ｌ＿４６（１．４－ｌ・５）　１，２　Ｙ　ｃｌＴ　０　０　Ｙｃｌ●　５０　０　Ｙ　ｃｌ－　ＩＯＯ　０　Ｙ　●　ｌ００　０　ＹｑＩ　４００　Ｏ．４５（０・３　－５）　Ｙｑ２　６００　Ｏ．６＃（Ｏ．●　．８）　Ｙｑ，　８００　Ｏ．静（０．Ｓ—ｌ－０）　Ｙｅｌ‘　１０００　１．３７（１．２－１．４）　１，５　Ｙｑ５　０　Ｏ　Ｙ　２‘　靳　０　Ｙ　ｃ２１　ｌＯ０　０　Ｙｃ２●　２００　０　Ｙｑ，４００　Ｏ　Ｙ咖　６００　０　Ｙｑｌ　Ｓ００　０　ｖｈ．　１０００　Ｏ　图２头孢噻腭钠抑菌效果图　据上述图表可得，抗生素头孢噻腭钠的使用浓度浓　度低于２００ｍｇ・　，不论菌液ＯＤ值多少，均没有抑菌圈　的产生，当抗生素浓度为４００—１０００　ｍｇ・Ｌ－１之间时，抑菌　圈大小与抗生素浓度成正比，但随着菌液ＯＤ值上升，抑　菌圈直径减小。当菌液ＯＤ值为１－５时，所有的抗生素浓　度处理均没有抑菌圈产生，所以，抗生素头孢噻腭钠对高　浓度的菌液不起到抑菌作用。当菌液ＯＤ值为０．９，抗生　素浓度为１０００ｍｇ・Ｌ－１时，抗生素头孢噻腭钠作用效果最　好，菌液浓度一定时，抗生素使用浓度与抑菌圈成正比。　但在利用发根农杆菌诱导植物毛状根培养时，需通过大　量试验，将外植体对菌液的浓度要求做筛选。　２。３卡那霉素（Ｋｍ）对发根农杆菌抑制效果研究　ＯＤ６００值为０．６的处理号为Ｙｋ　，ＯＤ６０ｏ值为０．９的　处理号为Ｙｋｓ—ｓ，ＯＤ６００值为１．２的处理号为Ｙｋ９＿ｌ２，ＯＤ６００　值为１．５的处理号为Ｙｋ　６。　ＦＵＪＩＡＮ　ＬＩＮＹＥ　福建林业　黄淑燕等：发根农杆菌Ｒ１　０００菌株对抗生素抗性反应及毛状根诱导影响研究　表３培养４８ｈ抑菌效果　处理号抗生素浓度（ｍｇ・Ｌ－　）　抑菌朋划、（∞）　平均值　０　０　ｍ　０　０　Ｏ　Ｏ　０　０　０　０　０　０　０　０　ｎ４６（ｎ札５）　ｎ７３（Ｑ　ｌ８）　图３卡那霉素抑菌效果图　据上述图表可得，当发根农杆菌的菌液ＯＤ值为　０．６、０．９及１．２时，抗生素卡那霉素（Ｋｍ）的使用并未对　发根农杆菌菌体的生长起到抑制作用，但当ＯＤ值为　１．５，卡那霉素使用浓度为４０ｍｇ・Ｌ　及６０ｍｇ・Ｌ　时，培　养基中出现了抑菌圈，平均直径大小为０．４６及　０．７３ｃｍ，因而对于抗生素卡那霉素来说，其对高浓度的　菌液可以起到一定的抑菌作用，在植物进行毛状根培　养时，若有些植物需要高浓度的菌液进行浸染，建议采　用卡那霉素作为除菌剂。　２．４抗生素抑菌时间效果研究　２．４．１头孢噻腭钠（Ｃｅｆ）抑茵时间效果研究　抗生素浓度为０、５０、１００、２００、４００、６００、８００、　１０００ｍｇ・Ｌ　的处理号为Ｓｃ１—８　表４头孢噻腭钠对菌落生长影响　培养基上布漕蕾落，蕾体密度高，稠密　培莽基ｔ基本布满蕾落，蕾体密度高　培葬基　基本布满曹落，曹体密度高　培养基ｔ基本布满■薄，菌体密度相对较高　培养基Ｅ基车布满■落，蕾体密度相对较低　培葬基上出现曹藩，蕾体啬宦低，稀少　培养基上出现曹落，曹体密度低　培养基　基本布｛薷蕾落，曹体密度相对较高　据表４试验结果得出，未使用抗生素头孢噻腭钠　的培养基上出现菌落的时间明显早于添加抗生素的培　养基上菌落出现的时间。在培养２ｈ后观察发现，菌落　密度与抗生素浓度有关，在处理Ｓｃ：一Ｓｃ　之间，抗生素　头孢噻腭钠使用浓度与菌落密度成反比；但处理Ｓｃｓ　的菌落密度反而高于处理Ｓｃ　及Ｓｃ，，因而高浓度的头　孢噻腭钠抗生素的使用并不一定能使菌落长势延缓甚　至受抑制，原因在于高浓度的抗生素浓度使得菌体生　ＦＵＪＩＡＮ　ＬＩＮＹＥ　⑩　理状况发生改变，其抗性作用更容易被激发。因而在利　号一删一　用头孢噻腭钠作为毛状根诱导除菌阶段的抗生素时，　应将外植体对抗生素反映情况及抗生素作用效果两者　结合考虑，筛选最佳使用浓度。　２．４＿２卡那霉素（Ｋｉｎ）抑茵时间效果研究　抗生素浓度为０、２Ｏ、４０、６０　ｍｇ・Ｌ－１的处理号为Ｓｋｌ－４　表５卡那霉素对菌落生长影响　苗藩出现时问（ｎ吐ｎ）　２ｌＩ后苗幕长势情况　３０　培养基上布蔫菌落。茸体密度高。稠密　４５　培养基上基本布满苗落。茸体密度高　４５　墙养基上基本布蔫茁落．苗体密度高　６５　培养基上出现茁蒂．曾体密度相对较低　据表４试验结果得出，菌落出现时间随抗生素浓　度上升而延迟，在培养２ｈ后观察发现，菌落密度在添　加与未添加抗生素上来说，添加抗生素的菌落密度低。　但在利用发根农杆菌诱导植物体毛状根生长时，高浓　度抗生素不利于外植体后期生长，因而在利用卡那霉　素作为毛状根诱导除菌阶段的抗生素时，应将外植体　对抗生素反映情况及抗生素作用效果两者结合考虑，　筛选最佳使用浓度。　３结论与讨论　３．１结论　（１）通过本次试验可得，发根农杆菌Ｒ１０００菌株　在适宜条件下培养，在培养的４８ｈ内其生长呈上升趋　势，但在培养的２４—２８ｈ区间，其呈对数生长，因而此时　最适合应用于外植体的毛状根诱导。　（２）头孢噻腭钠抗性筛选试验时可得，不管菌液　ＯＤ值为多少，抗生素使用浓度与抑菌圈成正比，但菌　液浓度的大小影响着抑菌圈的大小，一般情况来看，随　着菌液浓度的增大，抗生素浓度不变，抑菌圈随之减　小，但菌液浓度达到１．５时，基本上没有抑菌圈的出　现，所以在使用发根农杆菌作为菌液感染外植体进行　毛状根诱导时，感染菌液的浓度应低于１．５，这样在除　菌阶段，才能有效地抑制农杆菌生长，以至于不影响外　植体生长，进而提高转化效率诱导毛状根产生。　（３）卡那霉素抗性筛选试验时可得，卡那霉素的存　在，其抑菌圈仅只有０Ｄ　值为１．５时才出现，但高浓　度的菌液浓度不利于大部分外植体的毛状根诱导及生　长，因而其在植物的毛状根诱导的除菌阶段并不建议　采用，除了少部分植物的毛状根培养需要高浓度的菌　液浸染之外。　（４）在抗生素抗性时间观察试验中得出，随着抗　生素浓度上升，菌落出现时间推迟，而高浓度的抗生素　浓度（头孢噻腭钠）亦会使得其本身抗性下降，菌落继　续增殖生长。　３．２讨论　探讨菌株生活力及抗生素抗性研究在微生物和分　子生物学中有重要意义，同时筛选适宜抗生素使用浓度　对植物体的毛状根诱导具有重要意义，每种菌株具有其　特定的活力及感染特性，因而鉴别及测定菌株活力及对　抗生素抗性反应是进行植物体遗传转化的第一步骤，也　是一项重要的研究工作圈。快速除去植物体上受感染后　所增殖的发根农杆菌且不致外植体发病死亡，是利用发　根农杆菌转导发根基因，提高毛状根转化率的一个瓶颈网。　不同植物对抗生素的敏感和耐受范围不同，同时菌株所　合适的抗生素浓度种类也是不同的，（下转第３０页）　⑨　表３慎重选择树种　种类数量慎熏选舞树种　科学研究　４小结和讨论　福ＦＵＪ建ＩＡＮ林ＬＩＮ业ＹＥ　常绿乔木落叶乔木　８种７种加拿利ｉ孽枣、华棕、铁树、棕橱、布迪讳子、天竺佳、黄金宝时、五钟揆等。　杨树、秩帆、美国红弧、美国竹柳、四照花、毛纽　桉树等。　常斟－木，ｔ种　落叶谌木藤术　４种１种黄花榜【、红　垂丝ｊ卑棠、地中海荚蓬等。　金红久忍冬等。　案　、　（１）加拿利海枣、华棕、铁树、天竺桂、桉树、ｓｇ－Ｃｒ￣ｔ、鹅掌柴、金桔、细叶萼Ｉ尉　马　樱丹、黄花槐等耐低　能力有限；（２）杨忖、爪子黄杨、金叶女贞、红瞬　龟酬　较差，其　一明　竹柳、四熙花、毛红薷、美花红千层、美洲铁翱ｆ、紫叶小檗、垂丝海棠、地中海荚蓬、金红　久忍冬等，引种时阉皎短，其性状尚未稳定。　在组织实施城乡绿化工程和编制园林绿　化建设项目设计方案过程中，宜大量选用上　述“优先选择树种”，广泛选用“适宜选择树　种”，少量选用“慎重选择树种”和“扩展选择　树种”，避免选用“不宜选择树种”，并在绿化　实践中深入探讨总结和补充调整树种选择技　术方案，积极促进城乡绿化建设可持续发展。　但是，选择和应用绿化树种是一项综合　性很强的工作，在绿化实践中必须坚持辩证　方法正确对待此项工作。真正做到适地适树，　具体情况具体分析，有针对性地选择应用最　适宜的绿化树种。譬如，在“适宜选择树种”名　录中，常见城市绿化应用的杜英、乐昌含笑等　长期处于生长不良状态，主要原因是有关方　面对该树种特性认识不足，未能做到适地适　树。再比如，在“慎重选择树种”名录中，马樱　丹和细叶萼距花在本地区虽然表现为越冬时　地上部分或枝叶枯萎，但该树种来年春季长　势旺盛，可用于花坛、盆栽等。　参考文献　［１］陈进勇，朱莹，张佐双．园林树木选择与栽植【Ｍ】．北京：　化学工业出版社，２０１１．　【２］陈有民．中国园林绿化树种区域规划［Ｍ］．北京：中国　３．５扩展选择树种　２００６．　对与园林绿化树种区域［２１及中国植物耐寒区［３１相同或相近且　建筑工业出版社，【３】张雯婷，杨学军，唐东芹．中国植物极限温度分区的探　经济发达的浙沪地区新优树和调查中未见当地绿化应用的优良　索研究［Ｊ］．中国园林，２０１　１（４）：６３－６４．　乡土植物，可在适当的情况下分别进行试种驯化和开发利用，不　责任编辑／黄梓良　断增强绿化树种多样性。据查阅相关资料及实地考察调研，初步　确定２４种为扩展（引进试种）选择树种（见表５），２２种为扩展　（上接第２７页）既能抑制菌液大量增殖同时　（开发应用）选择树种（见表６）。　又不致外植体大量死亡的菌液浓度需要在一　定范围内进行筛选。　表５扩展（引进试种）选择树种　参考文献：　种类常　鞠懈　数薰３种６种３种　３种３种撮门　阖　选　７　实　红壬　多　防昏、常蘩鄯嘴冬阻七　　北　墨　钰彤案　杜鹃纽Ｉ荣　七叶林构陈榔　北　紫　溺５陈　常　懈藤术　竹子　凌胃、相啪　稿陈　６种斑　桂你黄睛　菲白你佣扯ｆ　罗汉ｌ慷　说明本匍　佛师　参考舅ｆ　【１］李用芳，周延清．发根农杆菌及其应用［Ｊ］．生物学杂　志，２０００，１７（６）：２９—３１．　【２】陶均，李玲．发根农杆菌菌株的综合鉴定及活力比　较［Ｊ］．亚热带植物科学，２００５，３４（２）：１　１－１４．　【３】胡亚忱，曲德业．发根农杆菌诱导植物毛状根的发　生及次生代谢物生产的研究进展ＩＪ】．吉林师范大学学　报，２００５（１）．　［４］刘琴，吴震，翁忙玲，等．发根农杆菌Ｒｉ质粒及其在　植物科学中的应用［Ｊ］．生物技术通报，２００２（５）．　【５】胡亚忱，曲德业．发根农杆菌诱导植物毛状根的发　生及生代谢物生产的研究进展［Ｊ］．吉林师范大学学报，　２００５，１：３１－３２．　［６】邱德有，宋经元，马小军，等．丹参毛状根生物反应器　大规模培养的研究［Ｊ］．分子植物育种，２００４，２（５）：６９９．　［７］于树宏，赵丽丽，王伟，等．影响虎杖毛状根高频诱导　的因素探讨［Ｊ］．西北植物学报，２００５，２５（９）：１７４０—１７４６．　【８】Ｋｒｉｅｇ　Ｎ　Ｒ，ｅｔ　ａ１．Ｂｅｒｇｅｙ’Ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ［Ｍ】．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ：Ｗｉｌｌｉａｍｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｋｉｎｓ，ＭＤ，　１９８４．２４４—２５４．　［９】Ｂｅｒｉｎｇｅｒ　Ｊ　Ｅ．Ｒ—ｆａｃｔｏｒ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｉｎ　Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ［Ｊ］．Ｊ　Ｇｅｎ　Ｍｉｅｒｏｂｉｏ１．，１９７４，８４：１８８—１９８．　［１Ｏ］Ｈｏｏｙｋａａｓ　Ｐ　Ｊ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｇｒｏｂａｅｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｅｉｅｎｓ　Ｔｉ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｔｏ　ａｖｉｒｕｌｅｎｔ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ　ａｎｄ　ｔｏ　Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｅｘ　ｐｌａｎｔａ［Ｊ］Ｊ　Ｇｅｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１．，１９７７，９８：４７７－４８４．　责任编辑／黄梓良　ＦＵＪｌＡＮ　Ｉ．ＩＮＹＥ