2010 DNA分子标记技术概述

doi:10.3969/j.issn.1004-6755.2010.07.020

DNA分子标记技术概述

姚红伟1,张立冬1,孙金阳1,刘霄霞2

(1.大连海洋大学生命科学与技术学院,辽宁大连116023;2.太原理工大学,山西太原030024)摘󰀁要:综述了DNA分子标记技术的类型及代表性分子标记技术的基本原理和优缺点,对常用分子标记技术进行了对比,并对其发展趋势进行了展望。关键词:DNA;分子标记;类型;原理;展望

󰀁󰀁1953年Watson和Crick提出DNA分子结构双螺旋模型,宣布了分子遗传学时代的到来。1974年,Grozdicker等人在鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时,利用性内切酶酶解后得到的DNA片段的差异,首创了DNA分子标记。所谓分子标记是根据基因组DNA存在丰富的多态性而发展起来的可直接反映生物个体在DNA水平上的差异的一类新型的遗传标记,它是继形态学标记、细胞学标记、生化标记之后最为可靠的遗传标记技术[1]。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质分子。通常所说的分子标记是指以DNA多态性为基础的遗传标记[2]。DNA分子标记不受环境和发育阶段的影响,标记数丰富,可大大提高杂交育种的有效性和可靠性,而且在对杂种机理的认识、杂种优势的预测、目的性状的选择等方面已显示出不可比拟的优越性。很多分子标记表现为共显性,能鉴别出纯合基因型和杂合基因型,能提供完整的遗传信息。同时,许多以前无法开展的研究如环境因素的影响、数量性状的多重效应等在分子标记的帮助下已经开展。

技术

(1)RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism)性内切酶片段长度多态性标记;

(2)CISH(ChromosomeInSituHybridiza-tion)染色体原位杂交。

1.2󰀁以重复序列为基础的分子标记技术(1)(SatelliteDNA)卫星DNA;

(2)(MinisatelliteDNA)小卫星DNA;(3)SSR(SimpleSequenceRepeat)简单序列重复,即微卫星DNA。

1.3󰀁以PCR为基础的分子标记技术

(1)RAPD(RandomlyAmplifiedPolymor-phicDNA)随机扩增多态性DNA;

(2)AFLP(AmplifiedFragmentLengthPo-lymorphism)扩增片段长度多态性;

(3)SSCP(SingleStrandConformationPoly-morphism)单链构象多态性;

(4)cDNA-AFLP(cDNA-AmplifiedFragmentLengthPolymorphism)cDNA-扩增片段长度多态性;

(5)TRAP(TargetRegionAmplifiedPoly-morphism)靶位区域扩增多态性;

(6)SCAR(SequenceCharacterizedAmpl-i

fiedRegion)序列特征化扩增区域;

(7)SRAP(Sequence-relatedAmplifiedPolymorphism)相关序列扩增多态性。1.4󰀁以mRNA为基础的分子标记技术

(1)ESTs(ExpressedSequenceTags)表达序

1󰀁DNA分子标记技术的类型

DNA分子标记从它诞生之日起,就引起了生物科学家极大的兴趣,在经历了短短几十年的迅猛发展后,分子标记技术日趋成熟,现已出现的DNA分子标记技术有几十种,部分分子标记技术所属类型如下。

1.1󰀁建立在Southern杂交基础上的分子标记

作者简介:姚红伟(1981-),男,硕士研究生,研究方向:水产生物繁育。E-mail:yao_317@163.com

󰀁42󰀁󰀁河北渔业󰀁2010年第7期(总第199期)󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁专论与综述列标签;

(2)DD(DifferentialDislay)差异显示;

(3)RT-PCR(ReverseTranscriptionPCR)逆转录PCR;

(4)DDRT-PCR(DifferentialDisplayRe-verseTranscriptionPCR)差异显示逆转录PCR;(5)RAD(RepresentativeDifferenceAnaly-sis)特征性差异分析;

(6)SAGE(Serialanalysisofgeneexpres-sion)基因表达系列分析。

1.5󰀁以单个核甘酸的变异为核心的分子标记技术

SNP(SingleNucleotidePolymorphism)单核苷酸多态性标记。

1.6󰀁以特定序列为核心的分子标记技术

mtDNA(MitochondrialDNA)线粒体DNA分子标记。

RFLP标记技术需要酶切,对DNA质量要求高;由于编码基因具有相当高的保守性,RFLP的多态性程度偏低;分子杂交时会用到放射性同位素,对人体和环境都有害;探针的制备、保存和发放也很不方便。此外,分析程序复杂、技术难度大、费时、成本高。所以,RFLP标记技术的应用受到一定。目前RFLP标记技术已经在基因突变分析、基因定位、基因诊断、个体识别、亲缘鉴定、物种分类和进化关系研究,以及组建高密度的遗传图谱和育种操作等方面都有一定的应用和重要的实用价值。

2.2󰀁CISH(ChromosomeInSituHybridization)染色体原位杂交

原位杂交技术最早是由Gall和Pardue利用标记的rDNA探针与非洲爪蟾细胞核杂交建立起来的[5]。其中染色体原位杂交在原位杂交技术中应用最广泛,它是一种基于Southern杂交的分子标记技术。该技术利用特异性核酸片段作探针,直接同染色体DNA片段杂交,在染色体上显示特异DNA。可采用同位素标记探针,杂交后通过放射自显影显示杂交信号,也可以采用非放射性大分子如生物素、地高辛等标记特异核酸片段,杂交信号经酶联显色或荧光显色得以显示。原位杂交的优点是准确、直观,缺点是技术非常复杂[6]。

2.3󰀁SSR(SimpleSequenceRepeat)简单序列重复,即微卫星DNA

微卫星是指以少数几个核苷酸(1~6个)为单位多次串联重复的DNA序列,亦称简单序列重复(SSR)。这种序列存在于几乎所有真核生物的基因组中,含量丰富,且呈随机均匀分布。微卫星由核心序列和两侧的保守侧翼序列构成。保守的侧翼序列使微卫星特异地定位于染色体某一区域,核心序列重复数的差异则形成微卫星的高度多态性,这种多态性的信息量是比较丰富的。该技术即是基于基因组DNA重复序列的差异进行检测,不受组织,器官种类、环境条件等因素影响。近年来,微卫星作为一种分子标记,已成为种群研究和进化生物学最常用的分子标记之一,广泛地应用于生物杂交育种、遗传连锁图谱、种群遗传多

[7]

样性、系统发生等研究领域。

对于大多数物种,在第一次开展微卫星研究时首先需要分离微卫星序列,开发特异性扩增引

󰀁43󰀁

2󰀁代表性分子标记技术

2.1󰀁RFLP性片段长度多态性

RFLP(RestrictionFragmentLengthPoly-morphism)作为最早的分子标记技术由Grozdicker创立,并于1980年由Bostein再次提出[3]。其原理是性内切酶能识别并切割基因组DNA分子中特定的位点,如果因碱基的突变、插入或缺失,或者染色体结构的变化而导致生物个体或种群间该酶切位点的消失或新的酶切位点的产生。那么利用特定的性内切酶切割不同个体的基因组DNA,就可以得到长短、数量、种类不同的性DNA片段,通过电泳和Southern杂交转移到纤维素膜或尼龙膜上,选用一定的DNA标记探针与之杂交,放射自显影后就可得到反映个体特异性的DNA性片段多态性图谱。RFLP分析中所使用的探针通常是随机克隆的与被检测物具有一定同源性的单拷贝或低拷贝基因组片段或cDNA片段。其中cDNA探针保守性较强,许多同科物种cDNA探针都可以作为通用探针。

RFLP标记技术的优点是:(1)标记广泛存在于生物体内,不受组织、环境和发育阶段的影响。(2)RFLP标记的等位基因是共显性的,不受杂交的影响,可区分纯合基因与杂合基因。(3)可产生的标记数目很多,可覆盖整个基因组。但是

[4]

󰀁河北渔业󰀁2010年第7期(总第199期)󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁专论与综述物。目前,关于微卫星分离方法的研究报道很多,概括起来基本上分为经典法、富集法、省略筛库法、ISSR片段扩增法和数据库检索法5种。微卫星具有分布广泛、多态性丰富、杂合度高、通用性好以及扩增反应所需模板量少、重复性好的优点,而且呈共显性遗传、检测方便、结果稳定。但是,微卫星标记的诸多优点同时也增大了基因型错误判别的可能性。无效等位基因(nullallele)、󰀁结巴󰀁带(stutterbands)、短等位基因显性(shorta-lleledominance)和等位基因的󰀁扩增丢失󰀁(allelicdropout)现象的发生都可能导致微卫星基因型的鉴定错误。

2.4󰀁RAPD随机扩增多态性DNA

RAPD(RandomlyAmplifiedPolymorphicDNA)是由Williams[8]和Welsh[9]两个研究小组于1990年分别研究提出的一种分子标记,是建立在PCR基础上的一种可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的DNA分子标记技术。基本原理是利用一个随机引物(一般为10个碱基)通过PCR反应非定点地扩增DNA片段,然后扩增片段经琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺电泳分离后配合溴化乙锭染色或银染等专一性染色技术即可记录RAPD指纹,进行DNA多态性分析。RAPD所用的一系列随机引物其序列各不相同,但对于每个特定的引物来讲,它同目标基因组的DNA序列都有其特定的结合位点、扩增DNA特定的区域片断,如果基因组的这些区域发生DNA片断或碱基的插入、缺失等突变,就可能导致这些特定结合位点、扩增片断发生相应的变化,而使RAPD扩增产物在电泳图谱中DNA带数增加、减少或片断长度发生相应变化,从而可以检测出基因组DNA在这些区域的多态性。

与RFLP相比,RAPD技术优点有:(1)技术简单,实验周期短,信息量大,检测速度快;(2)DNA用量少;(3)实验设备简单,不需DNA探针,设计引物也不需要预先克隆标记或进行序列分析;(4)不依赖于种属特异性和基因组的结构,合成一套引物可以用于不同生物基因组分析;(5)用一个引物就可扩增出许多片段,几乎覆盖整个基因组,而且不需要同位素,安全性好。因此,RAPD技术广泛应用于天然居群内及居群间的遗传变异、种质资源搜集、品种鉴定、种间或属间遗传关系、遗传图谱构建、基因定位与分离等方面󰀁44󰀁的研究。但是,RAPD技术受许多因素影响,实验的稳定性和重复性差。首先是显性遗传,不能

识别杂合子位点,这使得遗传分析相对复杂,在基因定位、作连锁遗传图时,会因显性遮盖作用而使计算位点间遗传距离的准确性下降;其次,RAPD对反应条件相当敏感,包括模板浓度、Mg浓度,所以实验的重复性差。

2.5󰀁SRAP相关序列扩增多态性

SRAP(Sequence-relatedAmplifiedPoly-morphism)标记是基于PCR技术的新型分子标记技术,由美国加州大学蔬菜作物系Li与Quiros博士于2001年提出[10],主要检测基因的开放读码框(ORFs)区域,其原理是利用基因外显子里G、C含量丰富,而启动子和内含子里A、T含量丰富的特点设计两套引物,对开放读码框架进行扩增。此技术具有简便、稳定、容易得到选择条带序列的优点。并且在基因组中分布均匀,适合于不同作物的基因定位、基因克隆和遗传图谱构建。但一套SRAP标记引物并不能够对所有的生物都通用,仍需不断开发出适合不同生物的引物。此外,SRAP标记是对开放读码框进行扩增,所以对基因相对较少的着丝粒附近以及端粒的扩增会较少。

2.6󰀁TRAP靶位区域扩增多态性

TRAP(TargetRegionAmplifiedPolymor-phism)是由Hu和Vick于2003年建立起来的一种新型DNA分子标记技术[11]。该技术是利用生物信息工具和表达序列标签数据库信息,产生目标候选基因区域的多态性标记。它是以基因组DNA为模板,采用两个人工合成的长度为16~20bp的核苷酸的固定引物与随机引物。固定引物的设计步骤为:从EST数据库中鉴别所需序列,再采用有关引物设计软件设定核苷酸序列合理长度(18bp)与最适、最大和最小Tm值(53、55、50󰀁),然后从软件自动生成的引物中,挑选比较合适的引物;随机引物设计主要是针对外显子或内含子的特点,设计为分别富含GC或AT核心区的任意序列。利用设计好的引物,通过PCR方法对基因组DNA进行扩增,PCR产物利用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法进行检测,然后通过放射自显影或银染技术观察不同的带型(即多态性),通过扩增产物的多态性来反映基因组相应区域(DNA)的多态性,从而形成围绕侯选目标基

󰀁河北渔业󰀁2010年第7期(总第199期)󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁专论与综述因序列的多态性标记。与其他方法相比较,TRAP分子标记技术具有操作简单;重复性好;效率高的优点。

2.7󰀁ESTs表达序列标签

ESTs(ExpressedSequenceTags)是在人类基因组计划实施过程中,由美国国立卫生研究院生物学家VenterJ提出的发现基因的新战略。ESTs是指从cDNA文库中随机挑取克隆并对其3󰀁或5󰀁端进行单轮测序所获得的短cDNA序列,一般长度为300~500bp。由于ESTs是短的核苷酸序列,而且根据构建文库时所采用引物的差异,所测定的序列可以是cDNA的各个区段,包括5󰀁末端和3󰀁末端,以及5󰀁上游非翻译区(UTR)和3󰀁UTR,也可以是cDNA的任何内部序列。因为cDNA来源于mRNA,所以每一个EST均代表了文库构建原组织的基因组DNA中一个表达基因的部分转录片段。目前常用的含有ESTs子数据库的有:NCBI的GenBank,欧洲分子生物实验室的EMBL以及日本国家数据库DDBJ。

随着EST研究的不断深入,EST技术已经应用于构建遗传学图谱、分离与鉴定新基因、基因差异表达的研究、基因的定位克隆以及用于制备cDNA芯片等。但是EST标记所获得的基因组信息不全,如序列、内含子等在基因表达中起重要作用的信息不能体现出来。另外,EST技术所需费用高;高表达丰度和中表达丰度基因的EST存在冗余性,增加了测序成本;EST标记对DNA质量和cDNA文库要求高;获得EST需要大量测序,故该技术不适用于中小型实验室的操作。

2.8󰀁SNP单核苷酸多态性标记

SNP(SingleNucleotidePolymorphism)主要是指在基因组水平上由于单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。也即SNP是同一物种不同个体间染色体上遗传密码单个碱基的变化,主要表现为基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性,包括单碱基的转换或颠换、以及单碱基的插入或缺失等。它是继RFLP、SSR之后的又一种新的分子标记。

SNP具有数量多且分布广泛和检测快速、易于实现自动化等优点,而且具有更高的遗传稳定性,尤其是处于编码区的SNP。但是,SNP作为遗传标记存在有缺点:它改变了基因原来的结构

和连锁率,表现为生物对外界反应的不适应,随着SNP的增加,相应会导致致命性疾病的增加。此外,在制作SNP图理论上需要约500个有代表性的个体,以开发一套密度至少在100000左右的SNP。即使多重PCR和SNP芯片取得了很大进展,仍需要大量单个扩增反应对每个SNP进行靶扩增。但由于成本太高,一般实验室难以开展该工作。统计学上的准确性需要增加SNP的密度,但是大批量扩增和检测反应所产生的错误信号也随之增加[12]。

2.9󰀁AFLP扩增片段长度多态性

AFLP(AmplifiedFragmentLengthPoly-morphism)是1992年由荷兰Keygene公司的科学家Zabeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的分子标记方法。其基本原理是基因组DNA经性内切酶双酶切后,形成分子量大小不等的随机性片段,将特定的双链接头连接在这些DNA片段的两端,形成一个带接头的特异片段。通过接头序列和PCR引物3󰀁末端的选择性碱基的识别,扩增那些两端序列能与选择性碱基配对的性酶切片段。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳,将特异的性片段分离开来,然后利用成像系统和分析软件检测凝胶上DNA指纹的多态性[13]。

该方法是继RFLP、SSR和RAPD之后发展最快的DNA指纹技术,它结合了RFLP的可靠性和严格的PCR退火条件,有高度特异性,既克服了RFLP技术中Southern杂交的烦琐和耗时的缺点,又解决了RAPD等技术中非特异PCR扩增引起的可信度问题。但是由于AFLP技术过程复杂,涉及到DNA性内切酶的酶切、接头的连接、PCR扩增及变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析等诸多步骤,试验过程中不论哪个环节出现问题,都不会得到理想的结果。此外,AFLP技术实验成本较高、且受专利保护,一开始时其应用仅局限于少数发达国家的科研单位和高等学府从事非盈利性的研究。但是,由于AFLP技术快速、有效,因而在医学、农业、林业、畜牧业、渔业等领域中得到了广泛的应用。近年来人们不断地将这一技术完善和发展,使得AFLP成为迄今为止最有效的分子标记。

3󰀁常用分子标记技术比较

利用分子标记技术进行科学研究时,应该根

󰀁45󰀁

󰀁河北渔业󰀁2010年第7期(总第199期)󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁专论与综述据自己所要解决的问题和所研究生物类群的遗传背景选择理想的分子标记。不同的分子标记具备

表1󰀁DNA标记特征比较

标记类型RFLPSSRRAPDESTsSNPAFLP

DNA质量要求

高中高低高高高

DNA检测范围低拷贝区重复序列区整个基因组功能基因组整个基因组整个基因组

遗传特点共显性共显性显性共显性共显性显性

多态性中等高较高高高较高

技术难度

高低低高高中等

重复性高高中等高高高

费用高中等低高高高

的特点见表1。

4󰀁展望

各种DNA分子标记技术从诞生到至今都有其自身的优缺点,在各自特定的领域中均具有不可替代的作用,还没有一种分子标记技术能够达到十分理想的遗传标记要求。目前,DNA分子标记技术和基因组作图研究一直处于飞速发展中,随着分子生物学理论与技术的快速发展,必将不断开发出分析速度更快、信息量更大、准确度更高、成本更低的分子标记技术。相信随着生物信息学、基因芯片等新技术的不断发展及其与分子标记技术的相互融合和相互渗透,DNA分子标记技术必将具有更广阔的发展空间[14]。参考文献:

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农业科学,2009,37(26):12420-12422

SummaryofDNAMolecularMarkerTechnology

YaoHongwei,ZhangLidong,SunJinyang,LiuXiaoxia

2.TaiYuanUniversityofTechnology,TaiYuanShanXi030024)

1

1

1

2

(1.CollegeofLifeScienceandTechnology,DalianOceanUniversity,Dalian116023;

Abstract:Inthisarticle,thetypeofDNAmolecularmarkertechnologyandthebasicprinciplesand

meritsanddrawbacksofrepresentativemolecularmarkertechnologywerediscussed.Wecomparewiththefrequently-usedmolecularmarkertechnologyandillustratetheoutlookfordevelopment.Keywords:DNA;molecularmarker;type;principle;tolookahead

(收稿日期:2010-05-10)

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