３ ｌ ８ 食品与药品 Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ ２０１ ５年第１７卷第５期 一种鉴别粗品肝素钠不同种属来源的简便方法 马志华，李志敏，姬胜利，杜旭召，白文举，崔洁 （河北常山生化药业股份有限公司，河北石家庄０５０８００） 摘要：目的采用ＳＡＸ—ＨＰＬＣ快速鉴别不同种属来源的粗品肝素钠。方法通过肝素酶酶解不同种属来源的粗 品肝素钠，以其酶解后的二糖组份为考察对象，通过ＳＡＸ ＨＰＬＣ法比较二糖的相对组成，鉴定种属来源。同 时在猪来源肝素中分别添加不同比例（５％，１０％，１５％，２０％，２５％）的牛来源肝素或羊来源肝素，经肝 素酶酶解后，通过ＳＡＸ ＨＰＬＣ法鉴别在猪来源肝素中是否能快速检出不同种属来源的其他肝素。结果对于不 同种属来源的粗品肝素钠，它们的二糖组成具有显著差异；若猪来源肝素混入５％羊来源肝素，即可通过其二 糖组成判断。结论此法操作简便，成本较低，可用于不同种属来源的粗品肝素钠的定性检测。 关键词：粗品肝素钠；二糖组成；ＳＡＸ．ＨＰＬＣ；种属 中图分类号：Ｑ５３８ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７２．９７９Ｘ（２０１５）０５．０３１８．０６ Ａ Ｓｉｍｐｌｅ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｉｄｅｎｔｉｉｃａｔｉｆｏｎ ｏｆ Ｃｒｕｄｅ Ｈｅｐａｒｉｎ Ｓｏｄｉｕｍ ｆｒｏｍ Ｖａｒｉｏｕｓ Ｓｐｅｃｉｅｓ ＭＡ Ｚｈｉ－ｈｕａ，ＬＩ Ｚｈｉ－ｍｉｎ，ＪＩ Ｓｈｅｎｇ—ｌｉ，ＤＵ Ｘｕ—ｚｈａｏ，ＢＡＩ Ｗｅｎ－ｊｕ，ＣＵＩ Ｊｉｅ （Ｈｅｂｅｉ Ｃｈａｎｇｓｈａｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｓｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ ０５０８００，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｃｒｕｄｅ ｈｅｐａｒｉｎ ｓｏｄｉｕｍ ｂｙ ＳＡＸ—ＨＰＬＣ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｄｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ａｓ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｂｊｅｃｔ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｇｏｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｈｅｐａｒｉｎａｓｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｒｕｄｅ ｈｅｐａｒｉｎ ｓｏｄｉｕｍ，ＳＡＸ—ＨＰＬＣ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆ３，ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｅｓ ｂｙ ｈｅ ｔｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｄｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ． Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ｂｏｖｉｎｅ—ｏｒ ｏｖｉｎｅ－ｓｏｕｒｃｅｄ ｈｅｐａｒｉｎ ｗａｓ ａｄｄｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｒｕｄｅ ｈｅｐａｒｉｎ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｓ （５％，１０％，１５％，２０％，２５％）．Ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｂｙ ｈｅｐａｒｉｎａｓｅ，ｉｔ ｗａｓ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｗｈｅｔｈｅｒ ｈｅｐａｒｉｎ ｆｒｏｍ ｆｏｒｅｉｇｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｑｕｉｃｋｌｙ ｗｉｔｈｉｎ ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｒｕｄｅ ｈｅｐａｒｉｎ ｂｙ ＳＡＸ—ＨＰＬＣ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｏｎ ｄｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｍｏｎｇ ｃｒｕｄｅ ｈｅｐａｒｉｎ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｉｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｒｕｄｅ ｈｅｐａｒｉｎ ｗａｓ ｍｉｘｅｄ ｗｉｔｈ ５％ｏｖｉｎｅ ｃｒｕｄｅ ｈｅｐａｒｉｎ．ｉｔ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｈｅ ｄｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｔｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｌｏｗ—ｃｏｓｔ，ａｎｄ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｈｅ ｑｕａｌｉｔａｔｉｔｖｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｒｕｄｅ ｈｅｐａｒｉｎ ｓｏｄｉｕｍ ｆｒｏｍ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ． Ｋｅｙ Ｗｏｒｄｓ：ｃｒｕｄｅ ｈｅｐａｒｉｎ ｓｏｄｉｕｍ；ｄｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ；ＳＡＸ—ＨＰＬＣ；ｓｐｅｃｉｅｓ 肝素钠原料来源多样化，可以从猪、牛、 和生物活性，其不良反应也不同。牛来源肝素钠 羊的小肠黏膜和牛肺等组织中提取，但由于疯牛 引起血小板减少的不良反应是猪来源肝素钠的约 病的出现，使牛来源的肝素应用受到了。研 ２倍，这引起了各国对原料来源的要求和， 究发现，不同来源的肝素钠具有不同的化学结构 使用猪来源的肝素钠更安全。在新开发的低分子 收稿日期：２０１５—０５．２８ 作者简介：马志华（１９７９一），男，河北石家庄人，硕士，高级工程师，主要从事药物质量研究Ｅ－ｍａｉｌ：ｍａｚｈｉｈｕａ３２５＠１６３．ｔｏｍ 食品与药品 Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ ２０１５年第１７卷第５期 ３１９ 肝素（ＬＭＷＨ）和超低分子肝素（ＵＬＭＷＨ） 产品中，大多数要求其肝素钠来源于猪肠黏膜。 葡萄糖胺（６［．Ｄ一葡萄糖胺，ＧｌｃＮ）组成的具有 不同链长的多糖链的混合物。本研究通过肝素酶 有研究表明，猪来源的肝素钠与人体内源性的肝 酶解不同种属来源的肝素钠，分析研究其酶解产 素钠结构相同，不产生蓄积毒性。肝素钠是我国 物；即通过酶解产物（二糖混合物）的组成比例 最重要的出口生化药物之一，产量占全世界产量 对本品的种属来源进行表征。 的５５％以上。对原料来源和质量的控制是决定 我国肝素钠在国际市场上经久不衰的关键［】］。 肝素酶是一类作用于肝素或者硫酸乙酰肝 素分子的多糖裂解酶；肝素酶有３ｋＯ，即肝素酶 目前国外厂商为了预防疯牛病和羊瘙痒病 Ｉ、肝素酶ＩＩ和肝素酶ＩＩＩ。由于每一种肝素酶有 传染，均不采购牛、山羊和绵羊来源的肝素钠， 只采购猪来源的肝素钠 。】。混有牛、山羊、绵 羊来源的肝素钠被作为不合格产品，因此区分不 同种属来源的肝素钠己作为重要的检测指标 】。 目前检测肝素钠不同种属来源的方法有很 多，如ＰＣＲ法（聚合酶链反应）、ＮＭＲ法（核 磁共振法）、ＥＳＩ—ＭＳ法（电喷雾质谱法），但 是这些方法通常都成本较高，同时检测步骤繁琐 复杂：基于此，本研究旨在寻找一种简便快捷的 区分肝素钠不同种属来源的方法，我们采用肝素 酶酶解不同种属来源的肝素钠，结合阴离子交换 高效液相色谱法（ＳＡＸ—ＨＰＬＣ）进行双糖组成分 析，研究结果表明，该法简便有效，能作为检测 不同种属来源肝素钠的方法。 １试药与仪器 １．１样品 粗品肝素钠样品（家猪、山羊、牛）由本 公司自制。 １．２主要试剂 肝素二糖对照品（Ａ Ｉ Ａ、△ＩＩＡ、ＡＩＩＩＡ、 △ⅣＡ、△Ｉ Ｓ、△ＩＩＳ、△ⅢＳ、△ⅣＳ；英国Ｄｅｘｔｒａ 公司）；高氯酸钠（５００ ｇ／瓶；上海凌峰化学试 剂有限公司）。 １．３主要仪器 Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００高效液相色谱仪（美国热 电）。 ２原理 肝素钠是一种糖胺聚糖，是由糖醛酸（Ｌ． 艾杜糖醛酸，ＩｄｏＡ；Ｄ一葡糖糖醛酸，ＧｌｃＡ）和 独特的基质特异性，因此它们切开肝素链中特定 的位点。肝素酶１分解ＧｌｃＮｓ（６Ｓ）和ＩｄｏＡ（２Ｓ）连 接的０ｃ（１—４）糖苷键，并能切断肝素分子中的抗凝 血酶ＩＩＩ结合五糖位点；肝素酶Ⅱ能分解二糖中含 ２个或者３个硫酸化基团的肝素，因此其特异性不 强；肝素酶ＩＩ１分解含６位未硫酸化的ＧＩｃＮＳ或Ⅳ． 乙酰氨基葡萄糖（ＧｌｃＮＡｃ）的肝素（见图１）。 ３种肝素酶的恰当混合使用，可使肝素完全降解 为不饱和的、在２３４ ｎｍ有紫外吸收的二糖混合 物。 砰素酶ｆ＆ｌＩ 静错睦 图１肝素酶Ｉ、ＩＩ、Ｉｌｌ酶解肝素的切割位点 肝素钠完全酶解产物中，包括了其糖链上８ 个基本二糖，其结构见图２。 ３方法 我们对本公司自制的３种不同种属来源 （猪、牛、羊）的粗品肝素钠样品，及在猪肝素 中分别添加不同比例的牛来源肝素或羊来源肝素 样品进行了二糖谱测定，分析了上述８种二糖的 组成比例。 分别取不同种属来源的粗品肝素钠适量， 精密称定，加水溶解并定量稀释成每１ ｍＬ中约 含２０ ｍｇ溶液；精密量取上述溶液２０ 与７０ ３２０ 食品与药品 Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ ２０１５年第１７卷第５期 ｑｏｏ，ｏ ＣＨ２ＯＨ 。表１流动相梯度洗脱表 洲 Ｉ ｌ 嗨洲 ＯＨ ＮＨＡｃ △ⅣＡ △ＩＶＳ ｃｏｏＮ． ｅＨ，Ｏ￣Ｎ． Ｇ．ＯＯＩ￣ ９ＨｚＯＨ 洲 洲 占Ｈ Ｉ！ＩＨ＾ｃ ＪＩＡ △ｌＩＩＡ ＣＯＯＮ＝ ｃ．２ｏ． 洲 ／／￣ －￣ｉ＂ ｉ２ｏ＂。Ｈ Ｈ Ｉ！ＩＨｏｓｃ）ａＩ蛔 ｏｓｏ．￣ ＮＩ４ＳＯ￣Ｎａ ＡＩＩＳ ｃｏｏ，， ＧＨ２ＯＳ￣Ｎａ 洲 ３婚。 ＿ Ｉ！ＩＨ＾ｃ △ＩＡ △ＩＳ 图２肝素酶解二糖 醋酸钙溶液（ｐＨ７．０），１００ ｇＬ肝素酶Ｉ，ＩＩ， ＩＩＩ的混合溶液混合；于２５℃水浴中放置酶解４８ ｈ，即为供试品溶液。另在猪肝素中分别添加５ ％，１０％，１５％，２０％，２５％牛肝素或羊肝素 同法制备供试品溶液。另取二糖△Ｉ Ａ，△ＩＩＡ， ＡＩＩＩＡ，△ＩＶＡ，△Ｉ Ｓ，Ａ ＩＩ Ｓ，ＡＩＩＩＳ，△ＩＶＳ适 量，精密称定，加水溶解并定量稀释成每１ ｍＬ 中约含０．２５ ｍｇ对照品溶液。照高效液相色谱法 （中国药典２０ｌＯ年版二部附录Ｖ Ｄ）测定，用 强阴离子交换柱（￣Ｔｈｅｒｍｏ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＳＡＸ，２５０ ａｒｉｎ×４．６ ｍｍ）；以０．０２８％磷酸二氢钠溶液（用 磷酸调节ｐＨ值至３．０）为流动相Ａ；以高氯酸钠． 磷酸盐溶液（取高氯酸钠１４０ ｇ，流动相Ａ溶解并 稀释至１０００ ｍＬ，用磷酸调节ｐＨ值至３．０）为流 动相Ｂ；流速０．４５ ｍＬ／ｍｉｎ，检测波长２３４ ｎｌｎ，柱 温５Ｏ℃，进样量ｌ０ 。按表１进行线性梯度洗 脱。以对照品溶液中各二糖的保留时间定位，检 测样品中的二糖组成。 ４结果 二糖对照品图谱及不同种属来源粗品肝素 钠二糖图谱见图３～图６。 ｔ／ａｒｉｎ １一△ⅣＡ；２．△ⅣＳ；３－ＡＩＩＡ；４一ＡＩＩＩＡ．５－ＡＩＩＳ；６．ＡＩＩＩＳ； ７．△Ｉ Ａ：８－Ａ Ｉ Ｓ 图３二糖对照品图谱 ５ｔ２０—●盯 １．－２１期 ｒ．ｆ ．ｉ．Ｉ ｒ ９ 口 ’ 尊 ＇曩口 ２０．０ ２５Ｏ ３Ｏ０ ｔ／ｍｉｎ １一△ⅣＡ；２一△ⅣＳ；３一△ＩＩ Ａ；４，ＡＩＩＩＡ；５－Ａ ＩＩ Ｓ；６一ＡＩＩＩＳ； ７．△Ｉ Ａ：８．△Ｉ Ｓ 图４猪来源粗品肝素二糖图谱 食品与药品 Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ ２０１５年第ｌ７卷第５期 ３２１ ｒ 。ＩｊｉＳ－ｊ０￣ｌ．ＩＭＯ ｌ口 §．９ ＇ １５．０ ２嗔９硝 Ｏ ．Ｏ ａ ｔ／ｍｉｎ １一△ⅣＡ；２．△ⅣＳ；３．△ＩＩＡ；４．ＡＩＩＩＡ；５一△ＩＩＳ；６－ＡＩＩＩＳ； ７．△Ｉ Ａ：８－Ａ Ｉ Ｓ 图５牛来源粗品肝素二糖图谱 。 ｍ １． ｏ＝０ ｔ０．０ １ ｔ／ｍｉｎ ｌ一△ⅣＡ；２一Ａ１ＶＳ；３－ＡｌＩＡ；４．ＡＩＩＩＡ；５－ＡＩＩＳ：６．ＡＩＩＩＳ： ７一△Ｉ Ａ：８一△Ｉ Ｓ 图６羊来源粗品肝素二糖图谱 不同种属来源的粗品肝素钠二糖检测结果 见表２。 表２不同种属来源粗品肝素钠二糖组成检查结果 二糖组成／％ 样品—— △ⅣＡ△ⅣＳ△ＩＩＡ△ＩＩＩＡ△ＩＩ Ｓ ＡＩＩＩＳ Ａ Ｉ Ａ△Ｉ Ｓ ■耕蠢一楮 岔肝素一牛 一肝素一革 Ｊ Ｉ｜｜．一ｈ ｎ一 △Ｉ、ｆ＾△ＩｖＳ△Ｉ｜Ａ△ⅡＩ＾ＡｌＩＳ ＡＤＩＳ △Ｉ＾△ｌ Ｓ 图７不同种属来源粗品肝素钠二糖组成差异示意 图 由图７可见，不同种属来源的粗品肝素钠 二糖组成差异十分显著。猪肝素和牛肝素中 △ⅣＡ、△Ⅳｓ、△ＩＩ Ａ￣ＩＡＩＩＩＳ ４种二糖相对组成均 低于羊肝素；猪肝素中ＡＩＩＩＡ、Ａ ＩＩ Ｓ和△Ｉ Ａ ３种 二糖相对组成均高于牛肝素和羊肝素；猪肝素 和牛肝素中△Ｉ Ｓ二糖相对组成均显著高于羊肝 素。 由以上不同种属来源的粗品肝素钠二糖组 成差异可见，若猪肝素样品中混入牛肝素或羊肝 素，即可鉴别出来。所以我们在猪肝素中分别加 入不同比例的牛肝素或羊肝素，通过检测二糖组 成，验证上述推论是否成立。 表３猪来源粗品肝素钠中混入不同比例的牛来源 肝素二糖组成检查结果 二糖组成％ 样品—— △ⅣＡ△ⅣＳ△ＩＩＡ△ＩＩ △ＩＩＳ△ＩＩＩｓ△Ｉ Ａ△Ｉ Ｓ ３２２ 食品与药品 Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ ２０１５年第１７卷第５期 由图９可见，猪来源的粗品肝素钠中混入羊 来源肝素的二糖组成差异十分显著。随着混入羊 来源粗品肝素钠的增多，△ⅣＡ、△１Ｖｓ＊Ｈ对组成 ■肝蠢一措 ０肝案一５‘牛 ●肝素－Ｉ 牛 显著高于猪来源的粗品肝素钠，△ＩＩＡ＊Ｎ对组成 略微增加，同时△Ｉ ｓ＊Ｈ对组成显著降低。由此 日肝素一１５ｘ牛 ■肝蠹一２ ０，ｌ牛 ■ 素一２５僻 瞄肝囊一牛 △Ⅳ＾ △ＩｖＳ ＡＩＩＡ △Ⅱｌ＾ △ＩｌＳ ＡⅡＩｓ △Ｉ＾ △ｌ Ｓ 图８猪来源粗品肝素钠中混入不同比例的牛来源 肝素二糖组成差异示意图 由图８可见，猪来源的粗品肝素钠中混入牛 来源肝素的二糖组成差异不很显著。随着混入牛 来源粗品肝素钠的增多，二糖组成和未加入牛来 源肝素的猪来源肝素基本保持一致，由此可见， 若猪来源肝素中混入了牛来源肝素，该鉴别方法 不能很好地鉴别。 表４猪来源粗品肝素钠中混入不同比例的羊来源 肝素二糖组成检查结果 二糖组成／０／０ 批号—— △ⅣＡ△ⅣＳ△ＩＩＡ△ＩＩＩＡ△ＩＩＳ ＡＩＩＩＳ△Ｉ Ａ△Ｉ Ｓ ■肝素一猪 ０肝焉一５‘莘 ●鼾蠢一１ ０薯革 目肝鬻一ｆ５薯革 ■秆素一２ 荜 ■肝鬻一２５ｔ羊 日肝嚣一羊 △Ⅳ＾ △ＩＶＳ △ＩＩ＾ △ＩＩｌ＾ △ｌＩＳ △ＩＩＩ＃ △Ｉ＾ △Ｉ Ｓ 图９猪来源粗品肝素钠中混入不同比例的羊来源 肝素二糖组成差异示意图 可见，该方法能鉴别猪来源粗品肝素中混入的羊 来源来源的粗品肝素。 ５讨论 目前，关于肝素种属来源的检测主要是通 过定量ＰＣＲ检测鉴别不同种属来源的肝素钠，但 这种方法成本较高。本文从另一角度阐述鉴别不 同种属来源的粗品肝素的方法，该法能有效地鉴 别出混入羊来源粗品肝素的肝素样品，同时简便 快捷；但是肝素酶在酶解肝素的过程中会丢失糖 醛酸差向异构体的信息，不能区分葡糖醛酸和艾 杜糖醛酸。另外近年也有利用毛细管电泳分离各 种双糖的方法［６－７］。利用反相离子对色谱法也可 分离肝素双糖，并结合质谱检测进行定量分析［８－９］。 参考文献 ［１］姬胜利，桑青，张天民．肝素的来源控制、结构分析以及结 构与生物活性关系的研究进展［Ｊ１ｌ中国药学杂志，２Ｏ１２，４７ （９）：６６０—６６３． ［２】Ｂｅｎｉ Ｓ，Ｌｉｍｔｉａｃｏ Ｊ Ｌａｒｉｖｅ Ｃ Ｋ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｒｉｎｉｍｐｔｔｒｉｔｉｅｓ ．ＡｎａｌＢｉｏａｎａｌＣｈｅｍ，２０１１，３９９（２）：５２７—５３９． ［３］Ｂｅｙｅｒ Ｔ，Ｍａｔｚ Ｍ，Ｂｒｉｎｚ Ｄ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ＯＳＣＳ— ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄ ｈｅｐａｒｉｎ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｉｎ ２００８ ｉｎ ｂａｔｃｈｅｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｇｅｒｍａｎ ｍａｒｋｅｔ ．ＥｕｒＪＰｈａｒｍ Ｓｅｉ，２０１０，４０（４）：２９７－３０４． ［４］Ｈｏｕｉｓｔｅ Ｃ，Ａｕｇｕｓｔｅ Ｃ，Ｍａｃｒｅｚ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｎｄ ｄｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｔｏ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ ｔｈｅ ａｎｉｍａｌ ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｌｏｗ— ｍｏｌｅｃｕｌａｒ－ｗｅｉｇｈｔ ｈｅｐａｒｉｎｓ［ＪＪ．Ｃｈｉｎ Ａｐｐｌ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈｅｍｏｓｔ，２００９， １５（１）：５０—５８． ［５］Ａｕｇｕｓｔｅ Ｃ，Ｄｅｒｅｕｘ Ｓ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｎｅｗ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆｈｅｐａｒｉｎｓ［Ｊ］ｌ ＡｎａｌＢｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ，２０１１，３９９（２）：７４７—７５５． 【６】Ｓｋｉｄｍｏｒｅ Ｍ Ａ，Ｇｕｉｍｏｎｄ Ｓ Ｅ，Ｄｕｍａｘ—Ｖｏｒｚｅｔ Ａ Ｆ，ｅｔ ａ１． Ｄｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｅｐａｒｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ ａｎｄ ｈｅｐａｉｆｎ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｕｓｉｎｇ ＵＶ ｏｒ ｈｉｇｈ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（ＢＯＤＩＰＹ） ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．ＮａｔＰｒｏｔｏｃ，２０１０，５（１２）：】９８３—１９９２． ［７】Ｅｌｄｒｉｄｇｅ Ｓ Ｌ，Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｌ Ａ，Ｄｉｃｋｅｙ Ｂ Ｊ，ｅｌ ａ１．Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｒｉｎ ｄｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ，ｐＫａ，ａｎｄ ｅ１ｅｃｔｒ０ｐｈｏｒｅｔｉｃ ｍｏｂｉｌｉｔｙ 食品与药品 Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ ２０１５年第１７卷第５期 ３２３ ２７０９碱性蛋白酶酶活测定的影响因素研究 王贞 ，张英超 ，徐鹏。，王艳芳 （１．漯河双汇肉业有限公司技术中心，河南漯河４６２００３；２．华懋双汇实业（集团）有限公司生物化学制药 厂，河南漯河４６２００３） 摘要：目的研究福林法测定蛋白酶酶活时的影响因素。方法测定２７０９碱性蛋白酶酶活，对比分析了各种常 见差异造成的影响。结果酪蛋白、滤纸的选择及样品稀释液配制时间对酶活测定影响较大，福林试剂、样品 溶解方式等影响不明显，而酶活计算方法的不同也会带来差异。结论检测人员在检测前应明确采用的方法、 试剂及计算方法。 关键词：碱性蛋白酶；酶活；福林试剂 中图分类号：Ｑ５５ 文献标识码： 文章编号：１６７２．９７９Ｘ（２０１５）０４．０３２３．０５ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ｆＮＯ．２７０９） ＷＡＮＧ Ｚｈｅｎ ，ＺＨＡＮＧ Ｙｉｎｇ－ｃｈａｏ ，ＸＵ Ｐｅｎｇ ，ＷＡＮＧ Ｙａｎ－ｆａｎｇ２ （１．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｌｕｏｈｅ Ｓｈｕａｎｇｈｕｉ Ｍｅａｔ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｌｕｏｈｅ ４６２００３，Ｃｈｉｎａ；２．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｃｈｉｎａｃｈｅｍ Ｓｈｕａｎｇｈｕｉ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｌｕｏｈｅ ４６２００３，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｂｙ Ｆｏｌｉｎ ｍｅｔｈｏｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎ＠ｒｍｉｓ（ＮＯ．２７０９）ｗａｓ ｔａｋｅｎ ａｓ ｓａｍｐｌｅ．Ｓｅｖｅｒａｌ ｆｒｅｑｕｅｎｔ ｄｉｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｗａｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ ｇｒｅａｔｌｙ ｂｙ ｔｈｅ ｃａｓｅｉｎ，ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ ａｎｄ ｂｌｅｎｄｉｎｇ ｔｉｍｅ ｏｆ ｓａｍｐｌｅ ｄｉｌｕｅｎｔ，ｍｅａｎｗｈｉｌｅ ｉｎｓｉｇｎｉｉｃａｎｔｌｆｙ ｂｙ Ｆｏｌｉｎ－Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ’Ｓ ｐｈｅｎｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ ａｎｄ ｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｓａｍｐｌｅｓ．Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ ｔｏ ｌｅａｄ ｔｏ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｒｅｓｕｌｔｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｄｅｔａｉｌｓ， ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ，ｒｅａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ，ｍｕｓｔ ｂｅ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｂｅｆｏｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ． Ｋｅｙ Ｗｏｒｄｓ：ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ；ａｃｔｉｖｉｙ ｔｏｆｐｒｏｔｅａｓｅ；Ｆｏｌｉｎ—Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ’Ｓ ｐｈｅｎｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ ２７０９碱性蛋白酶是地衣芽胞杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ 高、价格低，被广泛应用于肝素钠、硫酸软骨素 ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ，Ｎｏ．２７０９）的代谢产物，因其酶活 等生化产品的提取工艺中。 收稿日期：２０１５．０６．１０ 作者简介：王贞（１９８４－１，女，助理工程师，硕士研究生，研究方向为生物技术Ｅ．ｍａｉｌ：２４５６８１５４８４＠ｑｑ．ｃｏｍ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ［Ｊ］．Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ，２００９，８１（１７）：７４０６・７４１５． ［８］Ｈｉｔｃｈｏｃｋ Ａ Ｍ，Ｂｏｗｍａｎ Ｍ Ｊ，Ｓｔａｐｌｅｓ Ｇ ０，ｅｔ ａ１．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｗｏｒｋｕｐ ｆｏｒ ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ ｄｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ＣＥ ｗｉｔｈ ＬＩＦ ｉｏｎ・－ｐａｉｒ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｃｏｕｐｌｅｄ ｔｏ ｅｌｅｃｔｒｏｓ－－ｐｒａｙ Ｔｉｍｅ－－ ｏｆ—ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｆｏｒ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇａｎｄ ｑｕａｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆｈｅｐａｒｉｎ ａｎｄ ｈｅｐａｒｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ［Ｊ】．Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ，２００８， ８０（４）：１２９７—１３０６． ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２００８，２９（２２）：４５３８—４５４８． ［９］Ｋｏｒｉｒ Ａ Ｋ，Ｌｉｍｔｉａｃｏ Ｆ Ｋ，Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ Ｓ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｕｌｔｒａ ｐｅｒｆｏｒｍａｃｅ
