乳铁蛋白综述

乳铁蛋白是转铁蛋白家族的一员，一种可以结合铁的糖蛋白，分子量在80kDa左右，是近期研究较热门的蛋白之一。乳铁蛋白分子由一条肽链进行了折叠后形成两个对称的叶（N叶和C叶），两叶上都有铁结合位点。缺铁的乳铁蛋白和铁饱和的乳铁蛋白之间的构型有变化，可以相互转换。乳中的乳铁蛋白在脱脂和去酪蛋白后，可以用色谱、超滤、盐析等方法分离纯化，电泳法、HPLC、ELISA等方法可以用来检测乳铁蛋白的含量。

关键词：乳铁蛋白铁结合折叠纯化检测

Abstract

Lactoferrinisan80kDairon-bindingglycoproteinofthetransferrinproteinfamily.Itisasimplepolypeptidechainfoldedintotwosymmetricallobes(NandClobes)。Eachlobecanbindaironatom.TheconformationsofLFvarydependingonwhetheritisbindingFe3+.LFfromthemilkcanbeseparatedandpurifiedbychromatography,ultrafiltrationorsaltingafterdegreasingandremovethecasein.TheconcentrationofLFcanbemeasuredbyelectrophoresis,HPLC,ELISAandsoon.

KeyWords:lactoferriniron-bindingfoldpurificationmeasurement

乳铁蛋白（Lactoferrin，LF）是近期研究比较热门的蛋白，具有转运铁的功能，能够促进人体铁的蛋白。

一．乳铁蛋白的来源

乳铁蛋白于20世纪30年代，在牛奶中被发现，被称为红蛋白。乳铁蛋白是铁传递蛋白（transferrin）家族中的一员，是具有结合铁功能的糖蛋白。转铁蛋白还包括血清转铁蛋白（serumtransferrin）、卵转铁蛋白（ovotransferrin）、黑素转铁蛋白（melanotransferrin）和碳酸酐酶抑制剂（theinhibitorofcarbonicanhydrase）[1]。

这种糖蛋白还在粘膜分泌物中发现，如眼泪、唾液、阴道分泌物、精液、鼻和支气管分泌物、胆汁、胃和肠分泌物、尿液，其中常乳和初乳中的含量最高[2]。牛奶中的乳铁蛋白是由腺上皮细胞合成的。人乳和牛乳中乳铁蛋白含量随着哺乳期的延长而减少，但牛乳在非哺乳期LF保持较高的含量[3]。奶酪乳清中的乳铁蛋白浓度大约是100mg/L。

初乳

人乳牛乳

6~14mg/ml1~5mg/ml

常乳1.0~3.2mg/ml0.02~0.35mg/ml

表1人乳和牛乳中LF的含量[3]

二．理化性质

乳铁蛋白的分子量800kDa左右，内含（铁结合部位），铁半饱和到饱和的乳铁蛋白成红色，在475nm处有特殊的吸收峰。

（一）铁结合

乳铁蛋白结合Fe3+是可逆的，根据结合Fe3+的多寡，可将乳铁蛋白分为缺铁型乳铁蛋白（apo-LF）、铁半饱和型和铁饱和型（holo-LF）。抗巴氏杀菌变性能力依次为：holo-LF>铁半饱和型>apo-LF。天然状态的乳铁蛋白是部分饱和的。乳铁蛋白结合Fe3+的能力依赖于CO32-或者HCO3-，而与柠檬酸盐的浓度呈负关系[4]。

（二）等电点

乳铁蛋白是碱性蛋白，表面具有多个带正电碱性区域。牛乳中的乳铁蛋白的等电点为pH8.0±0.2，人乳铁蛋白的pI是5.6-6.1[4]。

（三）热稳定性

乳铁蛋白在碱性条件和中性条件下，容易失活。牛乳铁蛋白在pH6.6的条件下，65～69℃时就发生失活。酸性条件下脱铁LF（apo-LF）非常稳定，pH4.0、90℃处理5min，其铁结合能力、抗原活性以及抗菌活性与未处理前相同；在65～95

℃的范围内，LF的热变性程度随温度升高而逐渐增加。另外人们发现，LF的热稳定性随铁饱和度的增加而增加，而且含铁LF的两叶（lobes）也具有不同的热稳定性。这可能是由于含铁LF的结构更紧密因而更难以失活。此外，脱铁LF在pH2.0～3.0，100～200℃处理5min时明显发生降解，而其抗菌活性却有所增强。这表明降解以后的小分子仍具有抗菌活性，LF的活性部位是很稳定的，能耐受酸性降解[5]。

牛乳铁蛋白的热稳定性取决于环境因素，如pH、盐和乳清蛋白。牛奶中的apo-bLF和holo-bLF比在磷酸缓冲液中对热更敏感。而在磷酸缓冲液中，apo-bLF比holo-bLF变性得更快[6]。

图1：乳铁蛋白的分子结构

三．分子结构

（一）氨基酸序列

现在确定的乳铁蛋白氨基酸序列，包括了从人、鼠、牛、马、猪、山羊、绵羊、水牛和骆驼中得出的数据。一个乳铁蛋白分子含有大约690个氨基酸残基[7]，这9个生物体的乳铁蛋白具有高度的同源性，其中有两个显著的共同特征：（1）内部序列的两倍重叠；（2）高pH的碱性特征[8]。

（二）分子结构

乳铁蛋白分子立体结构主要呈“二枚银杏叶型”，由一条简易的多肽链折叠成两个对称的叶（N叶和C叶）形成，两叶都成环状结构，由一条部分α螺旋的铰链连接。人LF中，α螺旋区（铰链）由第333-343氨基酸残基组成，N叶是第1-332的氨基酸残基，C端是344-703氨基酸残基[9]。

LF多肽链由α螺旋和β折叠构成，N叶和C叶都折叠成相似的结构，大约有40%的相似性，不同之处在于环状叶结构。每叶都有2个相似的α/β结构域（N叶：N1和N2；C叶：C1和C2），其中一叶基于6束β层状结构，另一叶基于5束β层状结构。每个结构域能够协同一个CO32-，结合一个金属离子。结合的金属离子主要是Fe2+和Fe3+，但发现Cu2+、Zn2+和Mn2+也可以结合[2]。结构域中的铁结合位点是一个深深的裂缝。目前X衍射的最大分辨率（2.8A）尚不能分辨此2个铁位点的不同[10]。

乳铁蛋白的一级结构中的半胱氨酸（Cys）的数量和位置决定着分子内二硫键的形成，而N端和C端的天门酰胺则是几个潜在的N-糖基化位点。分子中非共价的链接，大多数是疏水的，给两叶提供了一个缓冲部位，而C末端的螺旋（第678-691氨基酸残基，hLF）可以相互的作用。螺旋的N末端对着域间的裂缝，使得裂缝处带正电荷，另一个螺旋，N2（或C2）是CO32-的结合部位[11]。

图2乳铁蛋白的多肽链折叠[7]

a.铁饱和乳铁蛋白（holo-LF）。N叶在左边，C叶在右边（即多肽链的C末端和N末端）。标识着N1、N2、C1、C2的结构域（N1、C1黄色，N2、C2绿色）。连接两叶的螺旋结构

H和C端螺旋显示为蓝色。两个铁结合部位为红色。

b.脱铁乳铁蛋白（apo-LF），两个晶体结构之一。N叶（左边）是开放的，在铁结合位点后有一个°旋转的铰链。，而C叶是关闭的，即使在没有铁结合的状态下。另一种脱铁乳铁

蛋白的晶体结构被发现，N叶和C叶同时关闭或开放。

这两个个状态之间的转变，正是转运铁的过程。

（三）乳铁蛋白的铁结合

乳铁蛋白结合Fe3+是可逆的，根据Fe3+的存在，可以分为脱铁LF（apo-LF）和铁饱和LF（holo-LF），并且这个不同状态的乳铁蛋白有不同的三维结构。apo-LF有一个开放的构型，而holo-LF有一个关闭的分子结构，并可以避免水解[12]。

1.铁结合和关闭的holo-lF结构[7]

铁结合到乳铁蛋白上后，N叶和C叶的两个结构域都关闭，与铁螯合。四个蛋白配体，再加上结合的CO32-，共价结合金属离子，每个金属离子都交联N

叶或C叶上的两个结构域。这样的结构比较稳定。铁结合部位有四个蛋白配体构成（2个酪氨酸Tyr，1个天冬氨酸Asp，1个组氨酸His），这个四个配体提供了三个负电荷用来平衡Fe3+，同时，带正电的N末端的螺旋结构和精氨酸侧链用来平衡CO32-。

2.铁的释放和开放的apo-LF结构[13]

生物物理学上的分析，缺铁的乳铁蛋白结构没有结合铁的稳定和紧密。晶体学分析，铁释放时，N叶和C叶上都发生了刚体结构域的移动，每个结构域都与另一个分离，并进行折叠，开放铁结合的裂缝。这样的移动可能是由两个结构域间的铰链的快速移动造成的。

图3铁结合位点[6]

hLF的N叶上，四个蛋白配体（2个酪氨酸Tyr，1个天冬氨酸Asp，1个组氨酸His），精氨酸残基和螺旋5（Helix5）的N末端用来结合CO32-。在所有的LF中，铁结合位点都位于N叶和C叶中。在铁结合位点后的两个碱性的残基（Arg210和Lys301）用来调节铁的

释放。

（四）乳铁蛋白的糖基化[11]

所有的乳铁蛋白都有两个突出的N-乙酰氨基乳糖型的糖苷，位于N-乙酰葡糖胺残基上，是α,1-6岩藻糖化。N-乙酰葡糖胺残基与多肽链连接。此外，人乳铁蛋白还有多-N-乙酰氨基乳糖性的糖苷，位于N-乙酰葡糖胺残疾上，是α,1-3岩藻糖化；而其他物种的乳铁蛋白则是高度甘露糖型的糖苷。不同物种的糖基化的数量和位点不同。糖基化和乳铁蛋白的抗细菌和抗病毒功能用关。

四．乳中乳铁蛋白的纯化和检测

乳铁蛋白具有调节胃肠道铁的吸收、广谱抗菌作用、抗病毒作用、抗氧化作用、抗癌作用、调节机体免疫反应等功能[14]。运用到工业生产上，具有巨大的商

业价值和社会价值。但是由于乳铁蛋白在生物体中含量很少，因此LF从乳中的纯化分离一直是研究的热点。LF从乳中分离前，需进行乳的脱脂（脂肪会导致溶液粘稠性很高，影响分离过程）和除去酪蛋白（牛奶蛋白的80%是酪蛋白，大量的酪蛋白会干扰乳铁蛋白的分离）。纯化分离现在主要有盐析法、有机溶剂沉淀法、色谱法和超滤法。分离纯化的目标是提高乳铁蛋白的回收率和纯度以及降低工艺成本。纯化的乳铁蛋白可以用电泳法、高效液相色谱法检测。脱脂和除去酪蛋白的乳清，还可以直接用毛细管电泳法、酶联免疫法直接测定。

（一）预处理

1.脱脂

一般方法是在4℃条件下，转速为4000r/min离心30min，除去上层的脂肪固体。杨安叔等人先把牛奶加热到40℃，用奶油机分离[15]。

2.除去酪蛋白

一般方法是将脱脂乳用浓盐酸调节pH到4.6（酪蛋白等电点），室温静置30min，酪蛋白聚沉。再在4℃条件下，转速为4000r/min，离心30min，取上清液，即乳清。

马闯等人将脱脂乳15s，72℃杀菌后，打入酶解罐，迅速冷却至37℃，然后加入凝乳酶酶解（加入量控制在使脱脂乳在10-15min凝固），保温20min，离心分离出乳清[16]。

（二）分离纯化方法

1.色谱法

a.吸附色谱法

该方法使用的固定相基质是颗粒状的吸附剂，在吸附剂的表面存在着许多随机分布的吸附位点，这些位点通过范德瓦尔引力和静电引力与蛋白质分子结合，其结合力的大小与各种生物分子的结构和吸附剂的性质有密切关系。他一般以Toyopearl为基质，在硫酸铵溶液中达到吸附平衡后装柱，用去离子水、0.25mol/LHAc和0.2mo1/LNaOH洗脱，得到纯度为80%的LF。S.Yoshida等人成功地运用此方法从牛初乳中分离出LF-a和LF-b。该方法的缺点是吸附容量小、效率低[3]。b.离子交换色谱法

该方法原理是根据离子交换剂对不同的离子或离子化合物的结合力不同而实现目标物质的分离，其结合力的大小是由离子交换剂的选择性决定的。

叶震敏使用2×33cm的CM-Sephadex-C50离子交换柱，分别以pH8.0含0、0.3、0.5、0.7mol/LNaCl的0.05mol/L磷酸钾缓冲液(PBS)以60ml/h流速分段洗脱，得出纯度为76.98%的乳铁蛋白液[17]。

徐丽萍使用SephadexC-100(1.0×39cm)柱，分别用7.0，7.2，7.4和7.6的PBS缓冲液（含有0.65mol/L的NaCl），洗脱流速为2mL/min，得出的纯度为

92%[18]。

吕立获等人使用CM-SepharoseFastFlow阳离子交换柱。先用去离子水以1BV的流速洗柱，约10h待基线走平，再用1.6%的NaCl以1BV的流速洗脱，约需5h，期间杂蛋白被洗脱下来；待基线走平，使用5.0%的NaCl以1BV的流速洗脱。出峰时间为1h左右，得出的纯度为95%[19]。

吕立获等人同时还对CM-SephadexC-50和CM-SepharoseFastFlow这两种阳离子交换柱进行了比较。得出结果：洗脱得到的LF的量和纯度都相差不大CM-SephadexC-50得到的洗脱液呈较深粉红色；CM-SepharoseFastFlow洗脱得到的洗脱液颜色略浅一些；使用相同的装柱方法时，CM-SepharoseFastFlow比CM-SephadexC-50更容易操作，且在实验过程中体积不会发生变化，有利于实现工业放大[19]。

c.亲和色谱法

亲和色谱是一种新兴的分离技术，他用来生产高纯度的LF，他的一般结构为：不溶基质-连接物-隔离臂-连接物-配体，基质多用琼脂糖，隔离臂多为有一定长度且可连接基质的有机物如NH2-(CH2)n-NH2。

林成招等人使用肝素琼脂糖色谱柱（BIO-RAD公司，60mm×12mm，填料为肝素与琼脂糖交联的产物）。取透析后的乳清加入平衡过的肝素亲和柱，在25℃下作用1h后，先用PBS洗脱至吸光值基线平稳后，分别用含0.1，0.3，0.5和1mol/LNaCl的PBS洗柱。每次待洗脱液吸光值回到基线水平后更换下一种缓冲液。用紫外分光光度计测OD280值。得出的纯度为90.02%[20]。

色谱法虽然得出蛋白纯度比较高，适用于HPLC的检测。但是整个实验过程耗时长，操作繁琐，并且蛋白的回收率很低。

2.超滤

超滤(Ultrafiltration)是一种基本的膜分离技术，其原理是根据膜孔径不同可以实现不同分子质量和分子形状的大分子物质的分离。由于超滤法提供了不加热或不发生相变进行大分子质量组分的浓缩、分离的机会，非常适合热敏性的功能性组分的分离。日本学者岛崎敬一于19年提出了超滤法分离LF的新方法，他选用孔径或截留分子量不同的一系列超滤膜，可以以干酪乳清为原料生产LF基料。先用截留分子量小于50kDa的300PS膜除去小分子，再用截留分子量大于100kDa的1000PS膜除去大分子，可得蛋白质分子量介于50kDa~100kDa之间，LF的回收率为69%。超滤法操作简便，费用相对低，易于形成工业化规模，其缺点是LF纯度较低，膜需经常清洗。超滤法是生产食品用LF最具实现工业化潜力的方法之一[3]。

4.盐析法、有机溶剂沉淀

叶震敏等人使用42%的饱和(NH4)2SO4盐析，再通过离心2,000r/min分离乳铁蛋白[17]。

曲练达等人用30%的饱和硫酸铵沉淀30min后，4℃条件下4,000r/min离心40min；上清液再用50%的饱和硫酸铵沉淀30min后，4℃条件下4,000r/min离心40min，除去免疫球蛋白沉淀；上清液用85%的饱和硫酸铵沉淀30min，在pH8.5

的条件下，4℃，4,000r/min离心40min收集沉淀，并用蒸馏水溶解[21]。

凌雪萍等考虑到了工业化生产的需求，选用了有机溶剂和盐沉淀法，采用两次硫酸铵沉淀和一次乙醇沉淀分离纯化LF，最终纯度达到45%左右[22]。

盐析法相对于以上所述的色谱法比较简单，易于操作，而且成本相对也低，缺点是纯度低。但此法适用于保健品和食品添加剂等纯度要求不高的行业。

（三）检测

1.电泳

SDS-PAGE凝胶电泳，是电泳的一种，利用检体中蛋白质分子量大小的不同，使其在电泳胶中分离，是最常用的蛋白质分析技术之一。

李珊珊等人优化了SDS-PAGE测定乳铁蛋白的工艺。确定了采用12%的分离胶浓度，200V的分离电压；采用改良考马斯亮蓝染色法，清洗后的凝胶用染色液（20％乙醇、10％磷酸、10％硫酸铵、0.25％考马斯亮蓝R-250）着色过夜，再经洗脱液（5％甲醇、7.5％乙酸）脱色3～4次；蛋白样品上样量为12μL，以0.1111mg/mL作为乳铁蛋白标准溶液的上样浓度[23]。

电泳后可采用凝胶成像或薄层扫描方法通过测定电泳条带的透射值，来确定蛋白的量。

2.高效液相色谱（HPLC）

高效液相色谱法（HighPerformanceLiquidChromatography，简称HPLC），以液体为流动相，采用高压输液系统，是色谱法的一个重要分支，具有高压、高效、高灵敏度等特点。

许宁等人使用VydaeC4(4.6mm×250mm，5µm)的色谱柱[24]。HPLC方法如下：流动相：A液：乙腈-水(95:5)(含0.10％三氟乙酸)；B液：0.10％三氟乙酸水溶液。

梯度：20min内B液从25％增至75％流速：1.0mL/min检测波长：210nm柱温：25℃

任璐[25]采用ShodexIECCM-825弱阳离子色谱柱分离，以浓度为0.02mol/L，pH值为7.0的磷酸缓冲盐溶液和浓度为0～1.5mol/L氯化钠的混合溶液作为流动相，进行梯度洗脱，流速为0.5mL/min，检测波长为280nm。结果表明：LF的标准曲线方程为y=494439x+25044，R2=0.9991，LF在质量浓度为0.05～4.0g/L范围内呈线性关系，且LF的平均加标回收率为96.883%。

高效液相色谱测定比较精确，重复性好，但是需要纯度高的样品，并且较为昂贵。

3.分光光度计法

乳铁蛋白在475nm波长有特征吸收峰。陆蓉蓉[26]在比较乳铁蛋白的测定方法时，试用了分光光光度计法。此方法只适用于高浓度的乳铁蛋白溶液，与ELISA

法分析结果有一定的相关性，但准确性较差。因为吸收值与乳铁蛋白的铁饱和度有关，铁饱和度越高，蛋白越显红色，A475也越高。

4.毛细管电泳

毛细管电泳（Capillaryelectrophoresis）利用毛细管中被分析的带电分子在电场作用下，因移动速率不同而达到分离不同分子的目的。毛细管电泳具有上样量少、快速、精确的特点。

孙国庆[27]等人使用毛细管电泳法检测乳铁蛋白的含量，选用P/ACEMDQ高压毛细管电泳仪（配有二极管阵列）。将样品经样品缓冲液处理，毛细管柱选择为直径50μm，有效长度400mm的涂层中性毛细管柱；柱温为40℃；缓冲溶液为柠檬酸缓冲液（pH为3.0±0.2）；工作电压为21kV；检测波长为214nm；进样时间为5s，进行检测。结果乳铁蛋白平均回收率为75%~91%；相对标准偏差（RSD）为1.1%~2.8%；最低检出限位0.003mg/mL。

5.酶联免疫法

酶联免疫法（ELISA）是把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关。此方法灵敏度很高。

杜凌等[28]人使用酶联免疫法测定婴儿奶粉中的乳铁蛋白含量。实验中使用的是TMB酶作为酶底物，以及纯化山羊抗牛亲合乳铁蛋白抗原，酶联检测仪是Bio-RAD，Mod-550，检测限在7.8-500ng/mL之间。

但ELISA法，检测结果的平行性与电泳法和HPLC法相比，较差。所以不适合作为定量检测的方法。并且需时较长。6.固定化单克隆抗体法

该方法实际上是利用抗原-抗体之间的高特异性结合反应而实现目标物的分离。载有单克隆抗体的免疫色谱是一种亲和力色谱法，他较成功地实现了LF的一步分离。利用该法分离脱脂人初乳LF，产品纯度98%；分离脱脂牛乳所获基料LF纯度97%，结果令人满意。该方法的优点是分离效果好、纯度高，抗体被固定可重复使用，其缺点是柱的制备工艺复杂，抗体成本昂贵，难以工业化生产[29]。

7.比浊法

又称浊度测定法，通过测量透过悬浮质点介质的光强度来来确定悬浮物质浓度，这是一种光散射测量技术。

乳铁蛋白微粒与抗乳铁蛋白的抗血清结合发生竞争性的免疫凝集反应，微粒增强的比浊法免疫测定乳铁蛋白是基于利用比浊法测定凝集反应产生的光散射。

M.L.Cuillière等人[30]使用兔抗LF的抗血清（rabbitanti-LFantiserum，anti-LFAs）的免疫球蛋白片段作为抗体，与乳铁蛋白结合产生复合体。这种免疫测定比较灵敏，测定限定在反应复合体0.2m/L，并且能够测定稀释的牛奶中反应复

合体，不需要任何处理，可以测定的乳铁蛋白浓度范围是0.675~21.6g/L，

反应使用的缓冲液含有0.05M硼酸盐、0.1MNaCl、1.5mMNa2-EDTA、30mMNaN3、2g/LTritonX-100和30g/LPEG6000，pH8。使用Sanofi-Diagnostics-Pasteur浊度计进行测量。

随着科学界对乳铁蛋白的不断深入的研究，相信乳铁蛋白在人类社会生活中的运用会越来越广泛。

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