浙江理工大学学报（自然科学版），第３１卷，第４期，２０１４年７月 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｓｃｉ－Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ） Ｖｏ１．３１，Ｎｏ．４，Ｊｕ１．２０１４ 文章编号：１６７３—３８５１（２０１４）０４－０４６７—０７ 一种短小芽孢杆菌分离鉴定及培养条件研究 孔高飞，金敏，朱莲莲。林高强，刘小川 （浙江理工大学生物工程研究所，杭州３１００１８） 摘要：为实施城市垃圾渗透液的生物无害化处理，分离、筛选、鉴定，获得特定菌株，并对其最适培养条件和最 佳培养基组分进行优化。从城市垃圾填埋场垃圾渗透液中分离芽孢杆茵，通过设计特异性引物进行ＰＣＲ反应鉴定 目的菌株。此茵细胞呈现杆状，革兰氏阳性，经鉴定为短小芽孢杆菌。采用单因素实验和正交实验法对茵株生长适 宜的培养基进行了优化。优化后的培养基主要成分为：玉米淀粉０．１ ，酵母提取物１．Ｏ ，小牛浸膏０．３ ，ＮａＣ１ ０．５ ，ＭｇＳ０４・７Ｈ２Ｏ ０．４９％。在这种条件下，菌株培养１０ ｈ，其ＯＤ３２。由ｌ＿４４上升到６．９３，为该菌株的深入研究 和应用奠定了基础。 关键词：垃圾渗透液；短小芽孢杆菌；鉴定；培养条件优化 中图分类号：Ｑ９３８．１ 文献标志码：Ａ Ｏ 引 言 随着社会的高速发展，越来越多的废弃物被排 放到环境中，有些化合物含有剧毒，有致癌的作用， 且很难自然降解。这些有害的物质随着垃圾渗透 液，对周围地下水和土壤造成了严重的污染。治理 环境污染已经成为世界各国努力攻克的难题。科学 家们采用化学、物理方法结合生物方法来处理污染 杆菌能够分泌活性很强的纤维素酶、脂肪酶＿４Ｊ、木聚 糖酶ｌ５ 和果胶裂解酶＿６］等，有利于降解大分子物质。 还可以产生抗菌素及抗菌蛋白等拮抗性物质［７］，抑 菌范围广ｌ＿８］，对多种病原菌都有抑制作用＿９］。产生 的聚一７一谷氨酸可用于降解塑料口。。。黄庆ｌ１ｕ从成都 市垃圾中分离得到一株短小芽孢杆菌能够产生脱毛 蛋白酶，利用该蛋白酶采用酶法脱毛技术应用在皮 革工业中，对解决皮革的环境污染问题有着重要的 物，其中微生物方法治理环境有明显的优势。但是 由于人们日常生活中基本上不对垃圾进行分类，导 致了生活垃圾渗透液中金属离子含量很高，一些降 解垃圾的菌株抗性差，处理垃圾效果不明显。因此 意义。Ｆａｋｈｆａｋｈ等［１ ］也报道了短小芽孢杆菌Ａ１ 菌株能降解羊毛废弃物。短小芽孢杆菌发酵所产生 的蛋白酶组成洗涤剂去污效果好ｌ＿】 ，提高了洗涤剂 的利用率。Ｐａｎｂａｎｇｒｅｄ等［１ 报道短小芽孢杆菌产 生的木聚糖酶具有良好的耐碱性，能够进行生物漂 亟待开发出一种高表达的、抗性强的，且能够降解垃 圾渗透液的优良菌株。已经有研究报道短小芽孢杆 菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）对降解垃圾有很好的效果＿１］， 且短小芽孢杆菌由于繁殖速度快，能产生稳定的芽 孢，抗逆能力强，成为了越来越受瞩目的生防材料 之一。 白，可以降低有机氯化物，减少环境污染。Ｇｅｅｔｈａ 等ｌ１ ］通过优化含有农业废弃物的培养基，提高了短 小芽孢杆菌在农业废弃物中产木聚糖酶的水平，降 低了生产木聚糖酶的成本，又利用了废弃物，减少污 短小芽孢杆菌为芽孢杆菌属的一种，显微镜下 观察营养细胞为杆状，革兰氏反应阳性［２］，能运动。 菌落形态有半透明状和不透明状两种［３］。短小芽孢 收稿日期：２Ｏ１３—１１～ｌ１ 染。游春平等口。 分离得到的短小芽孢杆菌对稻瘟 病菌有一定的抑制作用。ＡｋｈｔａｒＥ＂］在治疗鹰嘴豆 根腐病时，采用短小芽孢杆菌制剂获得了很好的防 治效果。张蕾ｌ＿１ ］筛选到一株短小芽孢杆菌ＴＹ０７９， 作者简介：孔高飞（１９８８一），女，山西晋城人，硕士研究生，研究方向为微生物环境生态学。 通信作者：刘小川，Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｃｌｉｕ＠ｚｓｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ ４６８ 浙江理工大学学报（自然科学版） ２０１４年第３１卷 对黄瓜枯萎病、棉花黄萎病具有显著的抑制作用。 由此可以看出短小芽孢杆菌在环境治理、工业、 农业等领域都有广阔的应用前景。本文致力于从城 市生活垃圾填埋场渗透液中分离得到一株短小芽孢 杆菌，研究其最适培养基和最佳培养条件，使培养基 的各组分之间保持平衡，得到菌株的最适生长环境， 可以降低培养成本提高产率，为该菌株的工业和城 市垃圾渗透液处理应用奠定基础。 １材料与方法 １．１实验材料 １．１．１菌种 由某地城市垃圾填埋场渗透液中分离筛选 所得。 １．１．２基础培养基（ＮＡ培养基） 牛肉膏０．３ ，蛋白胨０．５ ，葡萄糖０．２５ ， ＮａＣ１ ０．５ ，用ＮａＯＨ调ｐＨ至７．２，１２１℃高压灭 菌２Ｏ ｍｉｎ。固体培养基向其中加１．６ 的琼脂。 １．１．３主要试剂 溶菌酶、蛋白酶Ｋ、ｒＴａｑ酶、ＣＴＡＢ、牛肉膏、 ＫＮ（）３、ＮＨ ＮＯ。、蛋白胨、酵母提取物、ＮａＣ１、葡萄 糖、蔗糖、ＭｇＳＯ４・７ＨｚＯ、玉米淀粉、红薯淀粉、Ｚｎ— ＳＯ ・７ＨｚＯ、马铃薯淀粉、小麦淀粉和ＫＨ ＰＯ ＋ Ｋ２ＨＰＯ４（１：１）复合盐。 １．１．４仪器设备 ＮＡＮｏＤＲＯＰ ２０００分光光度计（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩ— ＥＮＴＩＦＩＣ）、ＳｙｎＧｅｎｅ凝胶成像系统（Ｓｙｎｇｅｎｅ）、 ＰＣＲ仪（￥１０００ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ）、连续光谱酶标仪 （ＭｏｌｅｃｕＬａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ公司）、电泳仪（ＢＩ（）－ＲＡＤ）。 １．２方法 １．２．１短小芽孢杆菌的鉴定 １．２．１．１形态鉴定 采集某地城市生活垃圾填埋场渗透液，对渗透 液中的细菌进行富集培养。将富集培养的菌液在 ＮＡ固体培养基上进行稀释涂布分离培养。观察菌 株的菌落形态，挑取可疑菌落，培养２４ ｈ并染色，在 显微镜下观察，依据《常见细菌鉴定手册》［１ ９］初步认 定是芽孢杆菌者，进行单菌分离富集培养。 １．２．１．２特异性ＰＣＲ分析鉴定 采用直接ＰＣＲ扩增菌种ＤＮＡ检测技术。直 接ＰＣＲ技术是只针对细菌的１６Ｓ ｒＲＮＡ基因碱基 序列中的特异序列的部分进行分析，设计出几对特 异性引物，ＰＣＲ扩增１６Ｓ ｒＲＮＡ基因的特异性片 段，通过分析扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，根据目 的条带的大小来判断所得到的条带是否为目的条 带。将分离得到的菌株接种于ＮＡ培养基，３７℃， ２２０ ｒ／ｍｉｎ培养１０ ｈ。采用改进的ＣＴＡＢ法提取菌 株的总基因组。通过对短小芽孢杆菌１６Ｓ ｒＲＮＡ碱 基序列及ｇｙｒＡ、ｒｐｏＡ基因序列的分析，设计出６对 特异性引物（表１），通过对菌株的总基因组进行特 异性ＰＣＲ扩增反应，分析其电泳结果图，进一步从 分子水平来鉴定分离得到的菌株是否为短小芽孢杆 菌。ＰＣＲ扩增程序为：９４℃预变性３ ｍｉｎ；９４℃ ４０ Ｓ，６１．７℃４０ Ｓ，７２℃４５ Ｓ，循环３３次；７２℃延伸 １０ ｍｉｎ。 表１特异性ＰＯＲ引物 名称 序列 ＣＧＴＡＧＡＧＣＣＡＣＴＴＧＡＧＣＧ ＣＴＧＣＣＧＴＴＡＣＡＧＴＴＣＣＴＴ ＡＧＧＧＡＡＧＡＡＣＡＡＧＴＧＣＡＧＡＧ ＧＣＴＣＣＴＣＡＧＣＧＴＣＡＧＴＴＡＣＡ 山ｒ弘乃 限 Ａ（ 泯ｒＡＡＧＡＡＣＴＴＡＧＣＧＡＧＣＧ ＧＣＴＣＣＴＣＡＧＣＧＴＣＡＧＴＴＡＣＡ 山 ＴＧＧＧＡＴＧＡＣＡＡＧＴＧＡＴＡＡＧＣ ＣＴＣＣＧＴＴＧＡＣＡＡＧＣＡＡＧＴＴＣＧ ＡＡＡＴＣＴＧＣＣＣＧＴＡＴＣＧＴＣＧ ＧＣＧＴＣＡＣＧＧＣＧＡＧＡＴＣＴＣＡＡ ＡＡＡＴＣＴＧＣＣＣＧＴＡＴＣＧＴＣＧ ＧＣＧＴＣＡＧＧＣＴＡＴＣＡＴＡＴＣＡＡ １．２．２短小芽孢杆菌的培养方法 １．２．２．１菌种活化 将分离得到的短小芽孢杆菌菌株转接到ＮＡ固 体培养基，３７℃恒温培养１２ ｈ，备用。 １．２．２．２种子液的制备 挑取单菌落，接人装量为２０ ｍＩ ＮＡ培养基的 １００ ｍＬ三角摇瓶中，置于控温摇床，３７℃，２２０ ｒ／ ｍｉｎ培养１２ ｈ，备用。 １．２．３短小芽孢杆菌培养基的单因素实验 １．２．３．１碳源种类及浓度对短小芽孢杆菌生长的 影响 以ＮＡ培养基作为基础培养基，分别用葡萄糖、 麦芽糖、蔗糖、马铃薯淀粉、小麦淀粉、红薯淀粉和玉 米淀粉作为基础培养基的碳源，其他组分不变。采 用摇瓶发酵培养条件，１０ ｈ后，采用酶标仪，测定菌 液的０ｌＤｓｚ。，以确定培养基的最佳碳源。确定最佳 碳源之后，改变基础培养基中最佳碳源的质量分数， 其他组分不变，来进一步研究不同浓度的碳源对菌 体生长的影响（每次处理重复３次，以下所有处理均 重复３次）。 ４７Ｏ 浙江理工大学学报（自然科学版） ２０１４年第３１卷 ２．２短小芽孢杆菌发酵培养基的优化 ２．２．１影响菌种生长的最佳碳源及浓度 ＮＡ培养基作为单因素实验的基础培养基，分 有机氮源成分丰富，不仅提供了氮源，还包含有碳源 ＱｒＪ 和少量的无机盐，而无机氮源成分相对单一。酵母 ８ ７ ６ ５ ４ ３ ２ ● Ｏ 提取物作为氮源明显优于其他氮源，因此选用酵母 别以０．２５ ９／６的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、马铃薯淀粉、 小麦淀粉、红薯淀粉和玉米淀粉作为基础培养基的 碳源，发酵培养１０ ｈ后，采用酶标仪，测定菌液的 ＯＤ 。由图３可知，短小芽孢杆菌生长的最佳碳源 提取物作为最佳氮源。 将基础培养基中的各组分固定在玉米淀粉 ０．１ ，小牛浸膏０．３ ９／６，ＮａＣ１ ０．５ ，最佳氮源酵母 提取物质量分数分别为０．３ 、０．４ 、０．５ 、 ０．６ ９／６、０．７ 、０．９ 、１．Ｏ 、１．１ ９／６、１．２ 、１．５ 和 是玉米淀粉，其次是红薯淀粉，故选用活性最高的玉 米淀粉为最佳碳源。 ２．ｏＯ，其他成分不变，进行发酵培养。１０ ｈ后，采 将基础培养基中的其他成分固定为蛋白胨 ０．５ ，小牛浸膏０．３ ，ＮａＣ１ ０．５ ，最优碳源玉米 淀粉质量分数分别固定为０．１ 、０．２ ９／６、０．４ 、 ０．５ 、１．０ 、１．５ ９／６、２．０ ，进行发酵培养，１０ ｈ 后，采用酶标仪，测定０ｌＤ。。。。由图４可知，玉米淀 粉质量分数为０．１ 时，菌体生长量最大，为最佳质 量分数。 碳源 趔 图４玉米淀粉浓度对菌种生长的影响 ２．２．２影响菌种生长的最佳氮源及浓度 ＮＡ培养基作为单因素实验的基础培养基，将 ０．５ 蛋白胨、酵母提取物、ＫＮＯ。和ＮＨ ＮＯ。作为 氮源，基础培养基中的其他成分不变，接种培养１Ｏ ｈ后，采用酶标仪，测定０Ｄ 。由图５可知，短小芽 孢杆菌对有机氮源的利用能力比无机氮源高。因为 用酶标仪，测定０１｝ 。由图６可知，（）Ｄ值随酵母 提取物质量分数的增大先增大后减小。当质量分数 达到１．０ 时，ＯＤ值最大。因此选取１．０ 为最佳 酵母提取物的质量分数。 ５ ４ 。 ｌ ０ ＫＮＯ ＮＨ ＮＯ 酵母提取物蛋白胨 氮源 图５氮源种类对菌种生长的影响 ｊ璺｜ ０ ２ 酵母提取物质量分数／％ 图６酵母提取物浓度对菌种生长的影响 ２．２．３影响菌种生长的最佳无机盐及浓度 基础培养基中的其他成分不变，分别用０．５ 的ＮａＣ１、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ＫＨ２ＰＯ４＋Ｋ２ＨＰＯ４（１： １）复合盐和ＺｎＳＯ ・７ＨｚＯ作为基础培养基中的无 机盐，以不加无机盐的基础培养基为空白对照，采用 摇瓶发酵培养条件，１０ ｈ后，采用酶标仪，测定菌液 的０Ｄ。。。，结果如图７所示。图７显示，钠离子、镁 离子对短小芽孢杆菌的生长都有促进作用，镁离子 第４期 孔高飞等：一种短小芽孢杆菌分离鉴定及培养条件研究 ４７１ 作用比较明显，因此选用ＭｇＳＯ４・７ＨｚＯ为最佳无 ５ ４ 餐 ＱＱ ＳＯ ・７Ｈ２Ｏ。由表４可知，玉米淀粉的Ｆ一７．９１５， ３ ２ ｌ Ｏ 机盐。据报道磷酸盐和锌离子可以促进芽孢杆菌的 生长，而这项研究表明磷酸盐和锌离子对菌体的生 长稍微抑制，这可能是因为离子浓度过高的关系。 将培养基中的其他成分固定在玉米淀粉 ０．１ ，酵母提取物１．０ ，ＮａＣ１ ０．５ ，小牛浸膏 ０．３ ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ Ｏ质量分数分别为０．２ 、 ０．３ 、０．４ 、０．５ ，进行发酵培养。１０ ｈ后，采用 酶标仪，测定ＯＤ。２。。由图８可知，ＭｇＳＯ ・７ＨｚＯ 的质量分数为０．３ ，菌体的生长量相对于其他浓 度的生长量处于较高水平。因此０．３ 是ＭｇＳＯ ・７Ｈ：Ｏ的最优质量分数。 不加离子ＮａＣＩ 器 无机盐离子 图７无机盐对菌种生长的影响 趔 量 ０ ０ ＭｇＳＯ ・７Ｈ：０质量分数／％ 图８ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ浓度对菌种生长的影响 ２．２．４碳源、氮源和无机盐的正交优化 通过单因素实验确定了最佳碳源、氮源、无机 盐，分别是玉米淀粉０．１ ，酵母提取物１．Ｏ ，Ｍｇ— ＳＯ ・７Ｈ：Ｏ ０．３ 。通过正交实验寻找培养基中的 各组分之间的最佳配比。实验因素水平编码及水平 设置见表２。采用摇瓶培养条件，正交实验２７个处 理组合条件下菌种在发酵１０ ｈ时的ＯＤｓｚｏ见表３， 正交方差分析见表４。 由表３可知，最佳组合为 Ｂ２ Ｃ３，即玉米淀粉 ０．１０ ，酵母提取物１．０Ｏ ９／６，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．４９ 。 通过极差分析可知Ｒｅ＞Ｒ ＞Ｒｃ。各因素影响菌体 生长程度从大到小为酵母提取物、玉米淀粉、Ｍｇ— Ｐ一０．１１２＞０．０５，酵母提取物Ｆ一３２．４２０，Ｐ一 ０．０３０＜０．０５，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ的Ｆ一６．１５６，Ｐ一 ０．１４０＞０．０５。表明酵母提取物对菌体生长的影响 为显著差异，玉米淀粉和ＭｇＳＯ ・７ＨｚＯ为不显著 差异。 表２正交实验因素和水平 表３正交实验指标结果 方差来源 平方和自由度均方 Ｆ值 Ｐ值 玉米淀粉０．７７５ ２ ０．３８７ ７．９１５ ０．１１２ 酵母提取物 ３．１７３ ２ １．５８６ ３２．４２０ ０．０３０ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．６０２ ２ ０．３０１ ６．１５６ ０．１４０ 误差０．０９８ ２ ０．０４９ 总计 ４．６４８ ８ 由此得到最佳培养基组成为：玉米淀粉０．１０９／６， 酵母提取物１．Ｏ０ ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ Ｏ ０．４９ ，小牛浸 膏０．３０ ，ＮａＣ１ ０．５０ 。 ２．３发酵条件优化 ２．３．１初始ｐＨ优化 短小芽孢杆菌培养过程中的ｐＨ难以控制，通 过控制发酵液的初始ｐＨ来寻找最适ｐＨ。将最佳 培养基的初始ｐＨ分别调至３、４、５、６、７．０、７．２、 ７．４、７．６、７．８、８．０、９、１０、１１、１２，在摇瓶发酵培养条 件下培养１０ ｈ，采用酶标仪，测菌液的０Ｄ。 。。 由图９可知，短小芽孢杆菌在初始ｐＨ小于５ 和大于１Ｏ的时候，生长缓慢。在初始ｐＨ在６～９ 之间，ＯＤ值很高，说明短小芽孢杆菌对ｐＨ的适应 ４７２ 浙江理工大学学报（自然科学版） ２０１４年第３１卷 性比较宽，在ｐＨ ６～９之间都能很好地生长。初始 ｐＨ为７．２的时候，菌种生长最好，因此选用７．２为 短小芽孢杆菌的最佳初始ｐＨ值。 图９初始ｐＨ对菌种生长的影响 ２．３．２温度优化 温度也是影响菌体生长的一个重要因素，能够 改变酶的反应速率。温度升高可以增大酶的反应速 率，促进生长代谢，但酶又会因为温度过高而失去活 性。分别选取２８、３７、４０、４３、４５、４７、４９℃和５０℃作 为摇床温度，在摇瓶发酵培养条件下培养１０ ｈ，测 菌液的ＯＤｓｚ。。 由图１Ｏ可知，短小芽孢杆菌在２８～３７℃均可 良好生长，说明短小芽孢杆菌对温度的适应性也较 宽，３７℃时菌体生长最好。高于４５℃后，菌体生长 缓慢，０ｌＤ值急剧下降，表明菌体生长的最高临界温 度为４５￣５０℃。由此可以得出，短小芽孢杆菌生长 的最适温度为３７℃。 ｉ Ｑ Ｑ 图１Ｏ发酵温度对菌种生长的影响 ３讨论 随着工业化进程的推进，科技日益发达，工业、 农业、日常生活等方方面面都面临着废弃物大量排 放的问题。废弃物随着降雨的冲刷，会造成土壤、水 域的污染，导致了饮用水、食物都受到污染，严重威 胁到我们人类的生存。随着人们的环保意识和健康 意识增强，对环境、食品的安全要求越来越高。环境 污染问题成为当前社会一个严重的问题。其中，城 市垃圾渗透液的无害化处理一直是待攻克的难题， 传统治理垃圾渗透液的方法是采用化学物理方法来 处理污染物，但是会对环境造成二次污染。近年来， 针对不同的污染物采用不用的治理方法，其中微生 物方法治理环境在生物方法中具有明显的优势，微 生物制剂也成为近年来研究的热点。其核心是获得 高表达的、适应性广的优良菌种，其中短小芽孢杆菌 由于繁殖速度快，能产生稳定的芽孢，抗逆能力强， 成为了越来越受瞩目的生防材料之一。 传统方法分离鉴定微生物，主要是通过选择性 培养微生物，在根据形态观察做出初步鉴定，之后根 据生理生化反应再进行系统的分类和鉴定。这种方 法费力耗时，忽略了微生物具有多样性，且同一物种 不同的菌株也可能有差异。对相近种也不能准确鉴 定。因此人们利用现代分子生物学方法找到了一种 快速鉴定菌种的方法，１６Ｓ ｒＲＮＡ基因序列分析 方法。 １６Ｓ ｒＲＮＡ基因的结构既具有保守性又具高变 异性［ｚ 船］，长度大小适中，既有保守的基因片段，又 含有不同菌种间变异的基因片段，因此采用１６Ｓ ｒＲＮＡ基因序列分析鉴定短小芽孢杆菌。但是由于 １６Ｓ ｒＲＮＡ的进化速度缓慢，非常保守，并不能很好 地鉴定出相对近的菌种，因此在采用１６Ｓ ｒＲＮＡ基 因序列分析的同时，要采用一些生理生化反应或者 一些其他保守基因序列的分析来补充。比如可以选 择１６Ｓ￣２３Ｓ ｒＲＮＡ基因序列和一些比较保守的功 能基因序列分析。本实验首先要从垃圾渗透液中分 离得到一株抗性强的短小芽孢杆菌，通过对短小芽 孢杆菌１６Ｓ ｒＲＮＡ碱基序列及ｇｙｒＡ、ｒｐｏＡ基因序 列的分析，设计出６对特异性引物，通过对被初步鉴 定为芽孢杆菌的菌株进行特异性ＰＣＲ扩增反应，分 析其电泳结果图，进一步从分子水平来鉴定分离得 到的菌株是否为短小芽孢杆菌。 短小芽孢杆菌的生长受外部环境的影响，环境 不适宜生长的情况下，就会由营养细胞转变为芽孢， 处于休眠状态，不能高效快速生长。碳源、氮源和无 机盐都会影响菌体的生长。因此需要筛选出满足其 生长的最佳碳源、氮源、无机盐及最优生长条件。通 过单因素实验确定了短小芽孢杆菌最佳培养基的成 分为：玉米淀粉，酵母提取物，ＭｇＳＯ ・７Ｈ。Ｏ。利 用正交实验设计优化了短小芽孢杆菌的培养基，得 到最适培养基为：玉米淀粉０．１０ ９／６，酵母提取物 第４期 孔高飞等：一种短小芽孢杆菌分离鉴定及培养条件研究 ４７３ １．Ｏ０ ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．４９ ９／６，小牛浸膏０．３０ ， ＮａＣ１ ０．５０ 。并通过单因素实验法确定了最佳培 养条件，温度３７℃，初始ｐＨ ７．２。采用最优培养基 和基础培养基分别在摇瓶发酵培养条件下培养１０ ｈ。测得ＯＤ。 。值由１．４４增长为６．９３。生长量提高 了将近４．８倍。 在今后的研究中，将继续优化发酵过程的培养 条件，以及对该菌株进行诱变，提高短小芽孢杆菌的 产率。 参考文献： ［１］Ｍｅｙｅｒｓ Ｐ，Ｇｏｋｏｏｌ Ｐ，Ｒａｗｌｉｎｇｓ Ｄ，ｅｔ ａ１．Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｃｙａｎｉｄｅ—ｄｅｇｒａｄｉｎｇ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ ｓｔｒａｉｎ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ 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ｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ［Ｊ］．Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓ— ｔｒｙ，１９８３，４７（５）：９５７—９６３． ｒ１５］Ｇｅｅｔｈａ Ｋ，Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ Ｐ．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ｗａｓｔｅ ｆｏｒ ｘｙｌａｎａｓｅ ｐｒｏ— ｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ Ｂ２０［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１０，１５（５）：８８２—８８９． Ｅ１６］游春平，李湘明．稻瘟病菌拮抗微生物的筛选及鉴定 ［Ｊ］．江西农业大学学报，２００１，２３（４）：５１９—５２１． ［１７］Ａｋｈｔａｒ Ｍ，Ｓｉｄｄｉｑｕｉ Ｚ．Ｇｌｏｍｕｓ ｉｎｔｒａｒａｄｉｅｅｓ，Ｐｓｅｕｄｏ— ｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ，ａｎｄ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ：ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａ— ｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｒｏｏｔ－ｒｏｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｆ ｃｈｉｃｋｐｅａ（Ｃｉｅｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ Ｌ．）［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２００８，７４（１）：５３—６０． ［１８１张蕾，石新丽，李敏，等．短小芽孢杆菌ＴＹ０７９ 产抗菌物质的发酵培养基研究［Ｊ］．河北省科学院学 报，２０１０，２７（２）：４７—５０． ［１９］东秀珠，蔡妙英．常见细菌系统鉴定手册［Ｍ］．北京： 科学出版社，２００１：１６２－１７１． ［２Ｏ］段景杰，赵亚杰，吕振山．ＤＮＡ检测技术及其在微生 物采油中的应用口］．油田化学，２００３（２）：１９２—１９６． Ｅ２１］金鑫．ＰＣＲ扩增ｒＲＮＡ基因在细菌菌种鉴定中的应 用［Ｊ］．国外医药：抗生素分册，２００３，２４（５）：２２３— ２２５． ［２２］都立辉．１６Ｓ ｒＲＮＡ基因在细菌菌种鉴定中的应用 ［Ｊ］．乳业科学与技术，２００６，２８（５）：２０７—２０９． （下转第４８０页） ４８０ 浙江理工大学学报（自然科学版） ２０１４年第３１卷 ａｎｄ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ ｏｆ ｕ１６（Ｎ１／Ｎ４ ｉｎ－ｐｌａｎｅ ｂｅｎｄｉｎｇ ｖｉｂｒａｔｉｏｎ），Ｕ１４（ｐｙｒａｚｉｎｅ ｒｉｎｇ ｂｒｅａｔｈｉｎｇ ｖｉｂｒａｔｉｏｎ） ａｎｄ Ｄｌ０（Ｃ２Ｃ７ ｓｔｒｅｔｃｈｉｎｇ ｖｉｂｒａｔｉｏｎ＋Ｃ３ Ｈ９ ｉｎ－ｐｌａｎｅ ｂｅｎｄｉｎｇ ｖｉｂｒａｔｉｏｎ）ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ ｍｏｓｔｌｙ ｔｏ Ｒａｍａｎ ｓｐｅｃ— ｔｒｕｍ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ．Ｉｎ Ｂａｎｄ Ｂ，ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ２－ＣＰ ｍａｉｎｌＹ ｓｐｒｅａｄｓ ａｌｏｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ ｏｆｕｓ（Ｃ２Ｃ３／Ｃ５Ｃ６ ｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌ ｓｔｒｅｔｃｈｉｎｇ ｖｉｂｒａｔｉｏｎ）ａｎｄ ｕ１４（ｐｙｒａｚｉｎｅ ｒｉｎｇ ｂｒｅａｔｈｉｎｇ ｖｉｂｒａｔｉｏｎ）．Ｔｈｅ ｉｎｔｅｎ— ｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｖｉｂｒａｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｂａｎｄ Ａ ａｎｄ Ｂａｎｄ Ｂ ｉＳ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｓ ｔｈａｔ，ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ Ｂａｎｄ Ａ ａｎｄ Ｂａｎｄ Ｂ ｉｎ ｅｘｃｉｔｅｄ ｓｔａｔｅ ａｒｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：２一ｃｙａｎｏｐｙｒａｚｉｎｅ；ＵＶ ｓｐｅｃｔｒｕｍ；ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ；ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｒａｍａｎ ｓｐｅｃｔｒｕｍ：ｄｅｎｓｉ— ｔｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｔｈｅｏｒｙ；ｐｈｏｔｏｉｎｄｕｃｅｄ ｓｔａｔｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｄｙｎａｍｉｃｓ （责任编辑：许惠儿） （上接第４７３页） Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ ｌｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｄｅｎｔ…ＣａｔＩＯｎ ｏｆ Ｂａｃ…ＵＳ Ｐｕｍｉｌｕｓ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ＫＯＮＧ Ｇａｏ－ｆｅｉ，Ｊ ＩＮ Ｍｉｎ，ＺＨＵＬｉａｎ—ｌｉａｎ，ＬＩＮ Ｇａｏ－ｑｉａｎｇ，ＬＩＵ Ｘｉａｏ ｃｈｕａｎ （Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｓｃｉ—Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１００１８，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｉｍｐｌｅｍｅｎｔ ｈａｒｍｌｅｓｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍｕｎｉｃｉｐａｌ ｗａｓｔｅ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｆｌｕｉｄ，ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ ｉｓｏｌａｔｅｓ，ｓｃｒｅｅｎｓ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚｅｓ ｉｔｓ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ．Ｔｈｅ ｂａｃｉｌｌｕｓ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｗａｓｔｅ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｆｌｕｉｄ ｉｎ ｍｕｎｉｃｉｐａｌ ｌａｎｄｆｉｌｌｓＴｈｅ ．ｔａｒｇｅｔ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌ ｐｒｅｓｅｎ— ｔｅｄ ｒｈａｂｄｉｔｉｆｏｒｍ ａｎｄ ｉｓ Ｇｒａｍ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ．Ｉｔ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｔｏ ｂｅ ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ．Ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ａｎｄ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｗｅｒｅ ａｄｏｐｔｅｄ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｍｏｓｔ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎ． Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｎｃｌｕｄｅ：ｃｏｒｎ ｓｔａｒｃｈ ０．１ ，ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ １．０ ，ｂｅｅｆ ｅｘｔｒａｃｔ ０．３ ，ＮａＣ１ ０．５ ，ａｎｄ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．４９ ．Ｕｎｄｅｒ ｓｕｃｈ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅ ０Ｄａ２ｏ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ａｆｔｅｒ １０ ｈ ｃｕｌｔｕｒｅ ｒｉｓｅｓ ｔｏ ６．９３ ｆｒｏｍ １．４４．Ｔｈｉｓ ｌａｙｓ ａ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｎ－ｄｅｐｔｈ ｓｔｕｄｙ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｗａｓｔｅ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｆｌｕｉｄ；ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ；ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ｃｏｎｄｉ— ｔｉｏｎｓ （责任编辑：许惠儿）
