2型糖尿病大鼠模型的建立及其氧化应激特征分析

・　８　・　２０１０年１月第ｌ０卷第１期Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｒｅｍｅｄｉｅｓ＆ＣｌｉｎｉｃｓＪａｎｕａｒｙ　２０１　ｏ．Ｖｏ１．１Ｏ．Ｎｏ．１　．２型糖尿病大鼠模型的建立及其氧化应激特征分析　奚苗苗文爱东　梁欣陈宏莉刘瑞柏桦海春旭　【摘要】　目的建立一种与人类２型糖尿病发病特点相似的动物模型。方法将体质量１８０～２２０　ｇ的　ＳＤ雄性大鼠３０只随机分为５组，分别为：对照组、高脂高糖组（ＨＨ）、高脂高糖＋劬ｃｏ照射组（ＨＨ＋Ｒ）、高脂高糖除　抗氧化剂组（ＨＨ—ＡｎｔｉＯ）及高脂高糖除抗氧化剂＋６０Ｃｏ照射组（ＨＨ＋Ｒ—ＡｎｔｉＯ）。ＨＨ＋Ｒ组和ＨＨ＋Ｒ—ＡｎｔｉＯ组于实验　第１５、３Ｏ、６０天给予剂量为４　Ｇｙ的６ｏＣｏ一　射线全身照射。在指定时间点检测各处理组动物的氧化应激指标，实　验第６０天时进行静脉糖耐量实验。大鼠出现胰岛素抵抗后，腹腔注射链脲佐菌素（２０　ｒａｇ／ｋｓ），每周１次，连续４　周，大鼠诊断为２型糖尿病后，进行胰腺灌流实验检测胰岛Ｂ细胞功能。整个实验进行过程中监测血糖和胰岛素　水平。结果各组动物在不同时间点出现不同程度的氧化损伤改变。第６Ｏ天时，除ＨＨ组外，其余各组动物均出　现胰岛素抵抗。结合小剂量链脲佐菌素注射后，大鼠出现比较稳定的中度高血糖，其中ＨＨ—ＡｎｔｉＯ组大鼠对葡萄　糖刺激的反应最为接近２型糖尿病患者胰岛素分泌的两相性特点；同时胰腺中胰岛素也有一定的贮存量，约为　对照组的４０％。结论与遗传因素在发病过程中起主导作用的转基因大鼠模型相比．本研究建立的大鼠２型糖　尿病模型能更好地观察环境因素对机体的影响，可以用于预防和治疗２型糖尿病的药物研究。　【关键词】糖尿病，２型；模型，动物　Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｙｐｅ　２　ｄｉａｂｅｔｉｃ　ｒａｔ　ｍｏｄｅｌ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｉｔｓ　ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｓｔｒｅｓｓ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ　ＸＩ　Ｍｉａｏ－ｍｉａｏ＇，ＷＥＮ　Ａｉ－ｄｏｎｇ，ＬＩＡＮＧ　Ｘｉｎ，ＣＨＥＮ　Ｈｏｎｇ－ｌｉ，ＬＩＵ　Ｒｕｉ，ＢＡＩ　Ｈｕｏ，ＨＡ１　Ｃｈｕｎ－ｘｕ．＊Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＰｈ￣Ｆｏｕｒｔｈ　ＪＩ】彻　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ　肌７１００３２，Ｃｈｉｎａ　ｙ，Ｘｉｉｆｎｇ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，　‘　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｄｅｖｅｌｏｐ　ａ　ｒａｔ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｔｙｐｅ　２　ｄｉａｂｅｔｅｓ　ｍｅｌｌｉｔｕｓ　ｔｈａｔ　ｐｒｅｓｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ　ｃｌｏｓｅ　ｔｏ　ｔｈｏｓｅ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｉｒｔｙ　ｍａｌｅ　ＳＤ　ｒａｔｓ　ｗｅｉｇｈｔｅｄ　１８０￣２２０曲ｗｅｒｅ　ｅｑｕａｌｌｙ　ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ　ｉｎｔｏ　ｆｉｖｅ　ｇｒｏｕｐｓ：ｃｏｎ　ｔｏｌｒ　ｇｒｏｕｐ，ｈｉｇｈ　ｆａｔ　ａｎｄ　ｈｉｇｈ　ｓｕｇａｒ　ｇｒｏｕｐ（ＨＨ　ｇｒｏｕｐ），ｈｉｇｈ　ａｔｆ　ａｎｄ　ｈｉｇｈ　ｓｕｇａｒ　ｐｌｕｓ　６ｏ（：ｏ一　ｅｘｐｏｓｕｒｅ　ｇｒｏｕｐ（ＨＨ＋Ｒ），　ｈｉｇｈ　ｆａｔ　ａｎｄ　ｈｉｇｈ　ｓｕｇａｒ　ａｎｄ　ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ｄｅｐｒｉｖａｌ　ｇｒｏｕｐ（ＨＨ－ＡｎｔｉＯ　ｇｒｏｕｐ），ｈｉｇｈ　ｆａｔ　ａｎｄ　ｈｉｇｈ　ｓｕｇａｒ　ａｎｄ　ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ｄｅ—　ｐｒｉｖａｌ　ｐｌｕｓ　６０Ｃｏ一　ｅｘｐｏｓｕｒｅ　ｇｒｏｕｐ（ＨＨ＋Ｒ－ＡｎｔｉＯ　ｇｒｏｕｐ）．Ｔｈｅ　ＨＨ＋Ｒ　ａｎｄ　ＨＨ＋Ｒ—ＡｎｔｉＯ　ｇｒｏｕｐｓ　ｕｎｄｅｒｗｅｎｔ　６０Ｃｏ一　ｔｏｔａｌ　ｂｏｄｙ　ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ　ａｔ　ａ　ｄｏｓａｇｅ　ｏｆ　４　Ｇｙ　ｏｎ　ｄａｙｓ　１５，３０　ａｎｄ　６０．Ｆｏｒ　ｔｈｅｓｅ　ｆｉｖｅ　ｇｒｏｕｐｓ，ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｓｔｒｅｓｓ　ｉｎｄｅｘｅｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔ—　ｅｄ　ａｔ　ｐｒｅ—ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ｔｉｍｅ　ｐｏｉｎｔｓ，ａｎｄ　ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｔｅｓｔ（ＩＶＧＴＩ）ｗａｓ　ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ　ｏｎ　ｄａｙ　６０．Ａｆｔｅｒ　ｄｅｖｅｌｏ　ｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｉｎｓｕｌｉｎ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｔｓ，２０　ｍｇ／ｋｇ　ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ（ＳＴＺ）ｗａｓ　ｉｎｊｅｃｔｅｄ　ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙ　ｏｎｃｅ　ａ　ｗｅｅｋ　ｆｏｒ　ｆｏｕｒ　ｗｅｅｋｓ．Ａｆｔｅｒ　ｔＩｌｅ　ｒａｔｓ　ｗｅｒｅ　ｄｉａｇｎｏｓｅｄ　ａｓ　ｔｙｐｅ　２　ｄｉａｂｅｔｅｓ　ｍｅｌｌｉｔｕｓ．ｐｅｆｆｕｓｉｏｎ　ｐａｎｃｒｅａｓ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｅｖａｌｕａｔｅ　ｔｈｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｓｕｌａｒ　Ｂ　Ｃｅｌ１．Ｔｈｅ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ｂｌｏｏｄ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ａｎｄ　ｓｅｌ＇Ｍｍ　ｉｎｓｕｌｉｎ　ｗａｓ　ｍｏｎｉｔｏｒｅｄ　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｗｈｏｌｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｖａｒｉｏｕｓ　ｄｅｇｒｅｅｓ　ｏｆ　ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｄａｍａｇｅ　ｗａｓ　ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅｓｅ　ｇｒｏｕｐｓ　ａｔ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｔｉｍｅ　ｐｏｉｎｔｓ．Ｏｎ　ｄａｙ　６０，ｉｎｓｕｌｉｎ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｗａｓ　ｆｏｕｎｄ　ｉｎ　ｒａｔｓ　ｅｘｃｅｐｔ　ｆｏｒ　ＨＨ　ｇｒｏｕｐ　ｒａｔｓ．Ａｔｉｅｒ　ｌｏｗ—ｄｏｓｅ　ＳＴＺ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，ｒａｔｓ　ｓｔａｂｌｙ　ｓｈｏｗｅｄ　ｍｏｄｅｒａｔｅ　ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ　ｔｏ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｉｎ　ＨＨ—ＡｎｔｉＯ　ｇｒｏｕｐ　ｒａｔｓ　ｗａｓ　ｃｌｏｓｅｓｔ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｔｗｏ－ｐｈａｓｅ　ｃｈａｒａｃ—　ｔｅｒｉｓｔｉｃ　ｏｆ　ｉｎｓｕｌｉｎ　ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｄｉａｂｅｔｉｃｓ．Ｔｈｅ　ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　ｉｎｓｕｌｉｎ　ｓｔｏｒａｇｅ　ｏｆ　ＨＨ－ＡｎｔｉＯ　ｇｒｏｕｐ　ｒａｔｓ　ｗａｓ　ａｂｏｕｔ　４０％　ｔｈｅ　ａｍｏｕｎｔ　ｏｆ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｒａｔｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｙｐｅ　２　ｄｉａｂｅｔｅｓ　ｍｅｌｌｉｔｕｓ　ｍｏｄｅｌ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｃａｎ　ｂｅ　ｍｏｒｅ　ｈｅｌｐｆｕｌ　ｉｎ　ｏｂｓｅｒｖｉｎｇ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｏｎ　ｂｏｄｙ　ｔｈａｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｍｏｄｅｌ　ｗｈｅｒｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｆａｃｔｏｒ　ｐｌａｙｓ　ｍａｉｎ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｔｈｉｓ　ｍｏｄｅｌ　ｃａｎ　ａｌｓｏ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ｆｏｒ　ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ　ａｎｄ　ｔｒｅａｔｉｎｇ　ｔｙｐｅ　２　ｄｉａｂｅｔｅｓ　ｍｅｌｌｉｔｕｓ．　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｓ】Ｄｉｄａｂｅｔｅｓ　ｍｅｌｌｉｔｕｓ，ｔｙｐｅ　２；Ｍｏｄｅｌｓ，ａｎｉｍａｌ　２型糖尿病是一种全球广泛流行的代谢性疾病，　表现为体内胰岛素相对不足、靶细胞对胰岛素敏感　外采用的２型糖尿病动物模型多与遗传相关。在这　类模型中，动物Ｂ细胞功能缺失发生在代谢紊乱之　性降低或患者产生的胰岛素本身存在结构上的缺　陷，最终引起糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱…。目前国　基金项目：国家自然科学基金（３０６７１７８８）　前，并不完全与人类２型糖尿病的发病情况相符［　。　由于糖耐量受损（ｉｍｐａｉｒｅｄ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ，ＩＧＴ）、　胰岛素抵抗和氧化应激与２型糖尿病的发生发展密　作者单位：７１００３２西安，第四军医大学西京医院药剂科（奚苗　苗、文爱东），预防医学系毒理学教研室（梁欣、陈宏莉、刘瑞、柏桦、　海春旭）　切相关　，本研究将高脂高糖、缺失抗氧化剂和辐射　产生的氧化损伤与链脲佐菌素（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ．ＳＴＺ）促　进超氧自由基形成的自由基毒性相结合．旨在建立　通信作者：海春旭，Ｅｍａｉｌ：ｈａｎｄｓｏｍｆｉｓｈ￣ａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ　国药物与临床２０１０年１月第ｌ０卷箍　塑　塑　！　望：』　：　！　：：　：　一种既符合人类２型糖尿病发病特点，又简单易得　料（配比为基础饲料或除抗氧化剂基础饲料：蔗糖：　炼猪油：胆同醇：蛋黄粉：胆酸钠＝６２．５：２０．０：１０．０：２．０：　的２型糖尿病动物模型，并探索氧化应激在２型糖　尿病进展过程中的作用。　１材料和方法　５．０：０．５），分别为：高脂高糖组（ＨＨ）、高脂高糖＋∞Ｃ０　照射组（ＨＨ＋Ｒ）、高脂高糖除抗氧化剂组（ＨＨ—Ａｎ—　ｔｉＯ）及高脂高糖除抗氧化剂＋加Ｃｏ照射组（ＨＨ＋Ｒ—　ＡｎｔｉＯ），ＨＨ＋Ｒ组和ＨＨ＋Ｒ—ＡｎｔｉＯ组于实验第１５、３０　天以及第６０天给予剂量为４　Ｇｙ的　。一＾ｙ射线全　身照射。于实验开始后的第２１、３６、６６天（即照射后　１．１材料　一级ＳＤ大鼠，雄性，体质量１８０～２２０　ｇ，第四军　医大学实验动物中心提供，动物合格证号为ＳＣＸＫ　（军）２００７—００７。主要试剂：ＳＴＺ购自Ｓｉｇｍａ，丙二醛　（ＭＤＡ）标准品、硫代巴比妥酸（ＴＢＡ）购自Ｍｅｒｃｋ，　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ一１００购自Ｓｉｎｏ—Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　２５％的葡萄糖注射液由第四军医大学西京医院药剂　科提供（批号：２００６０３０９），基础饲料由第四军医大学　实验动物中心提供。主要仪器：高效液相色谱　（ＨＰＬＣ，ＤＩＯＮＥＸ，ＵＳＡ），７２２型光栅分光光度计（上　海仪器总厂），ＳＨｚ一８８一ｌ台式水浴恒温震荡器（江　苏太仓鹿河生化仪器厂），９７０ＣＲＴ荧光分光光度计　（上海分析仪器总厂），血糖仪（ＳｕｒｅＳｔｅｐ　Ｐｌｕｓ　Ｓｙｓｔｅｍ，　Ｊｏｈｎｓｏｎ　Ｃｏｍｐａｎｙ），显微镜（Ｏｌｙｍｐｕｓ）。　１．２实验饲料配制　１．２．１植物油中维生素Ｅ等抗氧化剂的去除：将植　物油２００　ｍｌ置于５００　ｍ１分液漏斗中，加入２００　ｍｌ　无水乙醇，振摇萃取１　ｍｉｎ，静置１５　ｍｉｎ，分层后收　集油层（下层），将经过一次萃取的油层按同法再萃　取２次。然后在２２０℃条件下加热７　ｈ，除去油中残　余乙醇及维生素　。最后将加热过的维生素Ｅ置于　２００　ｍｍｘｌ５０　ｍｍ￣１５０　ｍｍ密闭箱中，在波长为２８０～　４００　ｎｍ紫外灯（２２０　Ｖ／５０　ｒｌｚ）下照射２　ｈ，即得。　１．２．２基础饲料中部分抗氧化剂的去除：紫外线照　射法破坏基础饲料中的抗氧化剂。将含豆饼面、玉米　面、鼠多维等成分的基础饲料平铺成厚度约为１　ｍｉｌｌ　的薄层放置在辐射强度为３　Ｗ／ｍ　的短波紫外线下　辐射５　ｈ，饲料薄层表面距灯管３　ｍ，每３０　ｒａｉｎ重新　搅拌铺开１次。　１．２．３维生素Ｅ的测定方法与条件：高效液相色谱　法（ＨＰＬＣ）检测处理前后植物油中的维生素Ｅ。色谱　条件：色谱柱为ＯＤＳ一２　Ｈｙｐｅｒｓｉｌ　Ｃｌ８（５　Ｉｘｍ，２５０　ｍｍＸ　４．６　ｍｍ．Ｔｈｅｒｍｏ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）：流动相为甲醇　和去离子双蒸水（９９：１）；柱温：２５　；流速：１　ｎｄ／ｍｉｎ；　检测波长：２７５　ｎｍ；进样量：２０　ｌ。　１＿３动物分组及处理　将体质量为１８０～２２０　ｇ的ｓＤ雄性大鼠３Ｏ只随　机分为５组，每组６只，自由进食水，１２　ｈ光照。除对　照组喂以基础饲料外，其余各组均喂以高脂高糖饲　第６天）检测各处理组动物的硫代巴比妥酸反应产　物（ｔＴＢＡＲＳ）、超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）及晚期糖基化　终末产物（ＡＧＥｓ）水平。６０　ｄ时检测大鼠的葡萄糖耐　受性并于９０　ｄ时再检测１次氧化损伤指标。大鼠出　现胰岛素抵抗后，腹腔注射ＳＴＺ（２０　ｍｇ／ｋｇ），每周１　次，连续４周，大鼠诊断为２型糖尿病后，进行胰腺　灌流实验。整个实验进行过程中监测空腹血糖　（ＦＢＧ）和空腹血清胰岛素（ＦＳＩ）水平。　１．４　ＴＢＡＲＳ的测定　取血清样品５０　ｌ，加入０．０４２　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｈ２ＳＯ　４．０　ｍｌ，按文献［４］所述方法于Ｅ　５１５　ｎｍ，Ｅ　５５３　ｎｍ处　用荧光分光光度计测定荧光强度，ＴＢＡＲＳ以等量　ＭＤＡ折算，根据求出的ＭＤＡ标准曲线，计算出相应　的ＭＤＡ浓度　１．５　ＳＯＤ活性的测定　取血清样品３０　ｌ，按文献［５］所述方法于波长　５６０　ｎｍ处检测其吸收度并计算ＳＯＤ活性。　１．６　ＡＧＥ　的测定　取血清样品５０　ｌ，用生理盐水稀释至３　ｍｌ，振　荡１５　Ｓ后，用荧光分光光度计于Ｅ　３７０　ｎｍ，Ｅｍ４４０　１１１１１处测定荧光强度　１．７血糖及血清胰岛素测定　大鼠禁食过夜，尾静脉采血，血糖仪测定ＦＢＧ，　放射免疫分析法检测ＦＳＩ，并用Ｉｎ（１／ＦＢＧ￣ＦＳＩ）计算　胰岛素敏感指数（ＩＳＩ）　。胰岛素抵抗的标准是：实验　组动物Ｉｓ１ｌ与对照组相比差异有统计学意义。以　ＦＢＧ＞７．８　ｍｍｏｌ／Ｌ并伴随胰岛素抵抗为２型糖尿病　诊断标准。　１．８静脉糖耐量实验　在实验６０　ｄ时进行静脉糖耐量实验（ＶＧＴｒ）。将　２５％的葡萄糖注射液按０．５　ｇ／ｋｇ的剂量　，尾静脉注　射给禁食未麻醉的大鼠，分别于注射前及注射后５、　１５、３０、６０、ｌ２０、１８０　ｎｆｉｎ测定血糖水平。　１．９胰腺灌注　大鼠诊断为２　糖尿病后，进行胰腺灌流实验　］。　２０１０年１月弟１Ｏ卷第１期Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｒｅｍｅｄｉｅｓ＆ＣｌｉｎｉｃＳ　灌注液为Ｋｒｅｂｓ—Ｒｉｎｇｅｒ碳酸氢钠缓冲液（含２　ｇ／Ｌ　ＢＳＡ和５　ｍｍｏｌ／Ｌ葡萄糖）。灌注速度为２　ｍｌ／ｍｉｎ，　在该速度下平衡３０　ｍｉｎ取样，分别于灌注开始的　第３Ｏ、４Ｏ、４５　ｍｉｎ取样。为了检测胰岛Ｂ细胞的　功能。在第４５　ｍｉｎ取样后，将葡萄糖浓度从５　ｍｍｏｌ／Ｌ提高到１１　ｍｍｏｌ／Ｌ，４６—５０　ｍｉｎ内，每１　ｍｉｎ取一个样．５５～６５　ｍｉｎ内，每５　ｍｉｎ取一个样，　第６５　ｍｉｎ取样后将葡萄糖浓度从１１　ｍｍｏｌ／Ｌ降　至５　ｍｍｏｌ／Ｌ。于第７０　ｍｉｎ和８０　ｍｉｎ取样，样品置　于一２０℃待测，放射免疫分析法检测胰岛素水　平。　１．１０胰腺中胰岛素的提取ｌ８］　胰腺灌流实验结束后，将胰腺移至滤纸上吸干　水分，称质量，用４℃预冷的Ｏ．７　ｍ０Ｌ门Ｌ　ＨＣＩ：乙醇（１：　３，ｖ／ｖ）溶液匀浆，２０００　ｒ／ｍｉｎ离心１０　ｍｉｎ，取上清，　下层颗粒用酸化乙醇于４℃提取２４　ｈ，２０００　ｒ／ｍｉｎ　离心１０　ｍｉｎ．取上清。将两次上清合并置于一２０℃待　测，放射免疫分析法检测胰岛素水平。　１．１１统计学处理　实验数据均表示为，使用ＡＮＯＶＡ进行多组均　数之间差异的统计学检验，两两比较采用ＬＳＤ法。　统计计算由ＳＰＳＳ统计软件完成。Ｐ＜０．０５为差异有　统计学意义。　２结　果　２．１色谱定性分析结果：由图谱可见，在选定色谱　条件下，植物油中的杂质对维生素Ｅ的测定无干扰，　经过萃取、煮沸，植物油中的维生素Ｅ可被破坏。　２－２氧化损伤指标：不同时期各组动物的血清ＭＤＡ　浓度、血清ＳＯＤ的活性及ＡＧＥｓ荧光值分别见表１、　２、３。　２．３血糖及血清胰岛素测定：实验第６０天时。ＨＨ—　ＡｎｔｉＯ组、ＨＨ＋Ｒ组和ＨＨ＋Ｒ—ＡｎｔｉＯ组大鼠均出现胰　岛素抵抗，见表４。　２．４　ＩｖＧ１Ｔｒ：所有大鼠在实验６０天时进行ＩＶＧＴＩ＂，　结果见表５。　２．５注射ＳＴＺ４周后ＦＳＩ、ＦＢＧ及ＩＳＩ的变化：对产　生胰岛素抵抗的ＨＨ—ＡｎｔｉＯ组、ＨＨ＋Ｒ组和ＨＨ＋Ｒ—　ＡｎｔｉＯ组大鼠腹腔注射ＳＴＺ（２０　ｍｇ／ｋｇ，每周１次）４　周，对照组同剂量腹腔注射生理盐水。各处理组大鼠　ＦＢＧ与对照组相比显著升高且大于７．８　ｍｍｏｌ／Ｌ．胰　岛素分泌与正常组相比显著减少，胰岛素抵抗依然　存在，因此为大鼠２型糖尿病模型，见表６。　２．６胰腺灌注：通过将葡萄糖浓度从５　ｍｍｏ￣Ｌ升高　表１不同时期大鼠血清ＭＤＡ浓度变化（；螂）　￣ｍｏｌ／Ｌ　注：　与对照组比较Ｐ＜０．０５；　与ＨＨ组比较Ｐ＜０．０５：ｃ与ＨＨ—　ＡｎｔｉＯ组比较Ｐ＜０．０５　表２不同时期大鼠血清ＳＯＤ活性变化（　）　Ｕ／ｍｌ　注：　与对照组比较Ｐ＜０．０５；　与ＨＨ组比较Ｐ＜０．０５；ｃ与ＨＨ—　ＡｎｔｉＯ组比较Ｐ＜０．０５：　与ＨＨ＋Ｒ组比较Ｐ＜０．０５　表３不同时期大鼠血清ＡＧＥｓ荧光值变化（；±ｓ）　注：　与对照组比较Ｐ＜０．０５；　与ＨＨ组比较Ｐ＜０．０５；　与ＨＨ—Ａｎ—　ｒｉＯ组比较Ｐ＜０．０５：　与ＨＨ＋Ｒ组比较Ｐ＜０．０５　表４第６Ｏ天时大鼠ＦＢＧ　ＦＳＩ及ＩＳＩ的变化（；　）　注：　与对照组比较Ｐ＜０．０５；　与ＨＨ组比较Ｐ＜０．０５：　与ＨＨ—ＡｎｔｉＯ　组比较Ｐ＜Ｏ．０５；　与ＨＨ＋Ｒ组Ｐ＜０．０５　表５第６Ｏ天时ＩＶｃｒＩＴＩ＇终点（１８０　ｍｉｎ）￣糖值（　）ｍｍｏｌ／Ｌ　注：　与对照组比较Ｐ＜０．０５；　与ＨＨ组比较Ｐ＜０．０５；　与ＨＨ—　ＡｎｔｉＯ组比较Ｐ＜０．０５：　与ＨＨ＋Ｒ组比较Ｐ＜０．０５　：星围丝　堕　Ｑ　Ｑ簦！　箜　Ｑ鲞筮　塑　ｉ！　！塑　！　！　！：　：　！　：　：　：　表６注射ｓ＇ｒｚ４周后大鼠ＦＢＧ　ＦＳＩ及ＩｓＩ的变化（　）　注：　与对照组比较Ｐ＜０．０５：　与ＨＨ－Ａｎｔｉ（）组比较Ｐ＜Ｏ．０５；‘与　ＨＨ＋Ｒ组比较Ｐ＜Ｏ．０５　至ｌＩ　ｍｍｏｌ／Ｌ刺激胰腺分泌胰岛素，检测３个实验　组和对照组大鼠胰岛Ｂ细胞功能。ＨＨ＋Ｒ、ＨＨ＋Ｒ—　ＡｎｔｉＯ联合ＳＴＺ注射组大鼠胰岛素释放趋势相似，　结果见图１Ａ。ＨＨ—ＡｎｔｉＯ联合ＳＴＺ注射组大鼠的胰　腺灌注结果见图１Ｂ。　时　（ｍｉｎ）　图１　大鼠胰腺灌注过程中胰岛素的分泌量　２．７胰腺中胰岛素的提取：胰腺灌注结束后，提取　胰腺中的胰岛素．观察胰腺中胰岛素的储存量。图２　结果表明，ＨＨ—ＡｎｔｉＯ组、ＨＨ＋Ｒ组和ＨＨ＋Ｒ—ＡｎｔｉＯ　组大鼠胰腺中胰岛素的量分别为对照组的４０％，５％　和４％　一一　对照组ＨＨ—ＡｎｔｉＯ组ＨＨ＋Ｒ组ＨＨ＋Ｒ—ＡｎｔｉＯ组　图２大鼠胰腺中提取的胰岛素浓度　３讨　论　有研究表明　ｆ　，２型糖尿病的形成与氧化应激、自　由基防御机能紊乱密切相关。有研究表明放射线对　细胞的生物化学损伤主要是电离辐射导致多种自由　基对细胞的功能和结构损伤。我们选择４　Ｇｙ的辐射　剂量对大鼠进行∞ｃｏ一　射线全身照射，目的是为了　造成大鼠全身自由基的损伤而不致死亡，同时给予　高脂高糖或高脂高糖除抗氧化剂饲料，观察大鼠氧　化损伤指标的变化。实验表明，辐射对大鼠造成了明　显的自由基损伤，照射组中的氧化损伤指标如　ＭＤＡ、ＡＧＥｓ含量升高，超氧自由基的清除剂ＳＯＤ的　活性下降。在氧化损伤发生的同时，我们发现ＨＨ＋　Ｒ～ＡｎｔｉＯ组大鼠在实验开始６０　ｄ时出现高胰岛素　血症、胰岛素抵抗和ＩＧＴ。实验结果表明氧化应激诱　发胰岛素抵抗，胰腺必需分泌足够高的胰岛素来克　服胰岛素抵抗，长期的高胰岛素分泌，导致ＩＧＴ的发　生。ＩＧＴ是引发２型糖尿病的危险因素　］。　维生素Ｅ是典型的脂溶性抗氧化剂之一，能保　护细胞膜免受脂质过氧化物的破坏，临床实验表明　给２型糖尿病患者补充ｄ一生育酚（维生素Ｅ的主要　成分之一）能改善他们的胰岛素功能…　，本研究将基　础饲料中的维生素Ｅ及部分抗氧化剂去除，引起氧　化应激增强、自由基生成增多。加之ＩＧＴ造成的血液　黏度升高，微血管灌注不良，进一步促进自由基的形　成，加重了氧化损伤程度。大鼠血清ＭＤＡ水平升高　提示体内过氧化脂质的增多．ＳＯＤ活性下降和ＭＤＡ　的堆积都可能加速了ＩＧＴ的进程。总的来说，ＩＧＴ大　鼠不但存在明显的脂质过氧化，而且机体抗氧化能　力也明显下降，这可能在ＩＧＴ转化为２型糖尿病的　进程中起重要作用。因此，我们认为氧化损伤参与了　ＩＧＴ的过程．并可能具有病因学意义，提示对ＩＧＴ者　早期给予抗氧化剂干预治疗，可能有利于防止ＩＧＴ　发展为２型糖尿病。　ＡＧＥｓ的形成一般是伴随２型糖尿病的一种重　要的生化异常。最近的诸多研究提示ｌｌ１］，２型糖尿病　患者的血管病变进展迅速可能与ＡＧＥｓ影响血管壁　的自稳态有关。本部分实验结果提示，升高的血糖水　平加之机体的氧化应激环境，能够加速ＡＧＥｓ的生　成。血清胰岛素检测结果提示，胰岛素可能也参与了　糖基化反应，为了进一步证明我们的假设，还需进行　体外糖基化模拟实验　ＨＨ—Ａｎｔｉ０组、ＨＨ＋Ｒ组和ＨＨ＋Ｒ—ＡｎｔｉＯ组大鼠　出现胰岛素抵抗后，腹腔注射ＳＴＺ（２０　ｍｇ／ｋｇ），每周　１次，连续４周，复制　稳定的高血糖模型。ＳＴＺ对大　鼠胰腺的作用机制Ｅｌ３主要是通过葡萄糖转运子　２０１０年１月第ｌ０卷第１期Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｒｅｍｅｄｉｅｓ＆Ｃｌｉｎｉｃｓ　（ＧＬＵＴ）中的ＧＬＵＴ２完成。为了证明本研究复制的　高血糖模型为２型糖尿病模型，通过胰腺灌注实验　观察模型动物胰岛素对葡萄糖的反应情况。当葡萄　糖浓度从５　ｍｍｏｌ／Ｌ升高至１　１　ｍｍｏｌ／Ｌ时，ＨＨ—ＡｎｔｉＯ　组动物胰岛素的分泌表现为两相性，第一相为胰岛　素快速分泌后逐渐减少，第二相的胰岛素分泌则出　现了明显的缺陷。该组动物的胰岛素水平在灌注初　期（葡萄糖浓度为５　ｍｍｏｌ／Ｌ），就不正常地高于对照　组．这可能是ＨＨ—ＡｎｔｉＯ组动物的胰岛素抵抗增加　了机体对Ｂ细胞分泌需求所致。通过检测灌注后的　胰腺中胰岛素的量来确定模型组大鼠胰腺Ｂ细胞的　分泌功能，与大剂量注射ＳＴＺ不同，以２０　ｍｇ／ｋｇ的　剂量多次给予ＳＴＺ不会造成胰腺胰岛素水平的急剧　下降．ＨＨ—ＡｎｔｉＯ组大鼠胰腺中胰岛素的量约为对照　组的４０％，提示胰腺Ｂ细胞还具有一定程度的分泌　胰岛素功能，与２型糖尿病患者的临床症状相似。　ＨＨ＋Ｒ组和ＨＨ＋Ｒ—ＡｎｔｉＯ组大鼠对葡萄糖的敏感性　较差。也许与辐射造成的全身损伤有关．确切原因还　需进一步探讨。　综上所述，各组动物在不同时间点出现不同程　度的氧化损伤改变。６０　ｄ时，除ＨＨ组外，其余各组　动物均出现胰岛素抵抗。结合小剂量ＳＴＺ注射后，大　鼠出现比较稳定的中度高血糖，其中ＨＨ—ＡｎｔｉＯ组　大鼠对葡萄糖刺激的反应最为接近２型糖尿病患者　胰岛素分泌的两相性特点，同时胰腺中胰岛素也有　一定的贮存量，约为对照组的４０％。与遗传因素在发　病过程中起主导作用的转基因大鼠模型相比，本研　究建立的大鼠２型糖尿病模型能更好地观察环境因　素对机体的影响，可以用于预防和治疗２型糖尿病　的药物研究。　参考文献　１　朱禧星．杨永年。沈稚舟．现代糖尿病学．上海：上海医科大学　出版社．２０００．　２　李聪然，游雪甫，蒋建东．糖尿病动物模型及研究进展．中国比　较医学杂志，２００５，１５（１）：５９—６３．　３　Ｒｏｂｅ￣ｓｏｎ　ＲＰ，Ｈａｒｍｏｎ　Ｊ，Ｔｒａｎ　ＰＯ，ｅｔ　ａ１．Ｂｅｔａ—ｃｅｌｌ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｔｏｘｉｅｉ—　ｔｙ，ｌｉｐｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，ａｎｄ　ｃｈｒｏｎｉｃ　ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｓｔｒｅｓｓ　ｉｎ　ｔｙｐｅ　２　ｄｉａｂｅｔｅｓ．　Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２００４，５３（ｓｕｐｐｌ　１）：１１９—１２４．　４　ｙａｇｉ　Ｋ．Ａ　ｓｉｍｐｌｅ　ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｅ　ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｌｉｐｏｐｅｍｘｉｄｅ　ｉｎ　ｂｌｏｏｄ　ｐｌａｓｍａ．Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｍｅｄ，１９７６，１５（２）：２１２—２１６．　５　Ｋｏｎｏ　Ｙ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ　ｒａｄｉｃａｌ　ｄｕｒｉｎｇ　ａｕｔｏｘｉｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｙｄｍｘｙｌａｍｉｎｅ　ａｎｄ　ａｎ　ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ　ｄｉｓｍｕｔａｓｅ．　Ａｒｃｈ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ，１９７８，１８６（１）：１８９－１９５．　６　Ｍｕｎｃｈ　Ｇ，Ｋｅｉｓ　Ｒ，Ｗｅｓｓｅｌｓ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｄｖａｎｃｅｄ　ｇｌｙｃａｔｉｏｎ　ｅｎｄ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｉｎ　ｓｅｒｕｍ　ｂｙ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ　ａｎｄ　ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ　ＥＬＩＳＡ．Ｅｕｒ　Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｃｈｅｍ　Ｃｌｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９７，３５　（９）：６６９—６７７．　７　李光伟，潘孝仁，Ｓｔｅｐｈｅｎ　Ｌ，等．检测人群胰岛素敏感性的一项　新指数．中华内科杂志，１９９３，３２（１０）：６５６—６６０．　８　Ｍａｓｉｅｌｌｏ　Ｐ，Ｂｒｏｃａ　Ｃ，Ｇｒｏｓｓ　Ｒ，ｅｔ　ａ１．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ＮＩＤＤＭ：ｄｅｖｅｌ—　ｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　ｎｅｗ　ｍｏｄｅｌ　ｉｎ　ａｄｕｌｔ　ｒａｔｓ　ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ　ｓｔｒｅｐｔｏｚａｔｏｃｉｎ　ａｎｄ　ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，１９９８，４７（２）：２２４—２２９．　９　Ｇｒｏｄｓｋｙ　ＧＭ，Ｂａｔｔｓ　ＡＡ，Ｂｅｎｎｅｔｔ　ＬＬ，ｅｔ　ａ１．Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ　ｏｎ　ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｓｕｌｉｎ　ｆｒｏｍ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｒａｔ　ｐａｎｃｒｅａｓ．Ａｍ　Ｊ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，　１９６３，２０５（４）：６３８—６４４．　１０　Ｔｒｉｐａｔｈｙ　Ｄ，Ｃａｒｌｓｓｏｎ　Ｍ，Ａｌｍｇｒｅａ　Ｐ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｓｕｌｉｎ　ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｎｓｕｌｉｎ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　ｒｅｌａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ：１ｅｓｓｏｎｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｂｏｔｈｉａ　ｓｔｕｄｙ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２０００，４９（６）：９７５—９８０．　１　１　Ｇｏｋｋｕｓｕ　Ｃ，Ｐａｌａｎｄｕｚ　Ｓ，Ａｄｅｍｏｇｌｕ　Ｅ，ｅｔ　ａ１．Ｏｘｉｄａｎｔ　ａｎｄ　ａｎｔｉｏｘｉ－　ｄａｎｔ　ｓｙｓｔｅｍｓ　ｉｎ　ＮＩＤＤＭ　ｐａｔｉｅｎｔｓ：ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｖｉｔａｍｉｎ　Ｅ　ｓｕｐｐｌｅ—　ｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｅｎｄｏｃｒ　Ｒｅｓ，２００１，２７（３）：３７７—３８６．　１２　Ｒａｍａｓａｍｙ　Ｒ，Ｖａｎｎｕｃｃｉ　ＳＪ，Ｙａｎ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ａｄｖａｎｃｅｄ　ｇｌｙｅａｔｉｏｎ　ｅｎｄ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ａｎｄ　ＲＡＧＥ：ａ　ｃｏｍｍｏｎ　ｔｈｒｅａｄ　ｉｎ　ａｇｉｎｇ，ｄｉａｂｅｔｅｓ，ｎｅｕ—　ｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｇｌｙｅｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００５，１５（７）：１６－　２８．　１３　Ｓｚｋｕｄｅｌｓｋｉ　Ｔ．Ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ａｌｌｏｘａｎ　ａｎｄ　ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ　ａｃｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｂ　Ｃｅｌｌｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒａｔ　ｐａｎｃｒｅａｓ．Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｒｅｓ，２００１，５０（６）：５３７－　５４６．　（收稿日期：２００９—０２—２３）