ε-聚赖氨酸工业化研究进展

作者：刁建中 陈桂光

来源：《科技视界》 2013年第3期

刁建中1 陈桂光2，3

（1.南宁新技术创业者中心，广西 南宁 530007；2.广西大学 生命科学与技术学院，广西 南宁 530004；

3.广西南宁智天生物科技有限公司，广西 南宁 530000）

【摘 要】ε-聚赖氨酸是一种微生物源的、可食用、无毒害、可生物降解的天然氨基酸聚合物，其在食品、医药、环保和化工等许多工业领域具有广泛的应用价值。本文就国内外关于ε-PL发酵菌种改造、发酵生产及聚合度控制三个方面对ε-PL最新工业化研究现状作了综述性介绍。

【关键词】ε-聚赖氨酸；工业化；应用研究；展望

Industrial Research Progress of ε-Poly-L-lysine

DIAO Jian-zhong1 CHEN Gui-guang2，3

(1.Nanning New Technology Entrepreneurs Center, Nanning Guangxi, 530007; 2.College of Life Science and Technology, Guangxi University, Nanning Guangxi,

530004; 3.Guangxi Nanning Zhi Tian Biotechnology Co. Ltd., Nanning Guangxi, 530000)

【Abstract】ε-Poly-L-lysine is a natural amino acid polymer with microbial source, edible, non-toxic and biodegradable, which used widely in many industrial fields such as food, medicine, environmental protection, and chemical. This paper mainly reviews the latest industrialized Research and applications of ε-PL on the aspects of ε-PL fermentation strain improvement, fermentation process and the degree of polymerization of ε-PL control.

【Key words】ε-Poly-L-lysine; Industrial; Application study; Prospect

ε-聚赖氨酸(ε-Poly-L-lysine, ε-PL)一般是由25-35个L-赖氨酸单体通过α-COOH 和ε-NH2脱水缩合而成的微生物源L-赖氨酸同聚物，分子量通常为2500-4500 Da。ε-PL首先是由日本学者Shima和Sakai于1977年发现[1]。目前，ε-PL主要作为食品防腐剂，广泛用于淀粉质类食品防腐。ε-PL作为一种新型食品防腐剂，相比于传统化学防腐剂和其他生物防腐剂, 具有更广的抑菌谱(有效抑制G+、G-、酵母菌和霉菌等)、更好的水溶性、更强的热稳定性和更广的pH适用范围等优点。与此同时，ε-PL的添加不会影响食品原有的风味且具有较高的安全性[2，3]。早在1980s，日本就允许ε-PL作为食品防腐剂使用；随后，韩国也批准ε-PL在食品中添加；2003年，ε-PL获得美国FDA认证(GRN000135)，并开始进入美国和欧洲市场。另外，ε-PL作为高分子聚合物前体，还被用作生物可降解材料、乳化剂、高吸收性水凝胶、药物载体、抗癌增进剂等。

基于ε-PL优良的防腐性能及其广泛的应用前景，国内外研究人员均投入大量人力、物力对其开展工业化生产研究。其中，日本Chisso公司于1989年率先应用生物技术方法实现了ε-PL的工业化生产，现已建成年产千吨级ε-PL工业生产线。目前，国内有关ε-PL的研发

总体上还处在实验室和中试阶段，发酵水平停留在20 g/L左右，实现工业化生产还面临着诸多问题。在此我们从ε-PL发酵菌种改造、发酵生产及聚合度控制三个方面对ε-PL最新工业化研究进展作一简单介绍。

1 ε-PL发酵菌种改造

ε-PL产生菌株主要集中在麦角菌属及链霉菌属，工业生产用菌以小白链霉菌为主。由于ε-PL野生菌其合成ε-PL的能力均不强，因此，如何提高原始ε-PL产生菌合成能力以提高其发酵水平，是实现ε-PL工业化生产的必要前提。目前，国内外研究者主要是采用解除/降低L-赖氨酸反馈抑制，从而提高天门冬氨酸激酶活性这一改造策略。Hiraki等[4]借助L-赖氨酸产生菌改造经验，利用亚硝基胍作诱变剂，筛选L-赖氨酸结构类似物(S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸，简称AEC)和甘氨酸双抗性突变株，以解除/降低天门冬氨酸激酶底物反馈抑制作用和增加细胞膜通透性，强化菌株合成ε-PL前体L-赖氨酸的能力。历经近20年不断改造，最终筛选到一株高产突变株 Streptomyces albulus 11011A，其ε-PL合成能力较野生菌提高了10倍，达到2.11 g/L。陈纬纬等[5]利用硫酸二乙酯诱变Kitasatospora sp. PL 6-3，利用AEC抗性平板筛选到的高产菌株较出发菌株产量提高了3倍。丛茂林等[6]利用N+注入法诱变白色链霉菌TS02，采用AEC抗性平板结合抑菌圈的方法筛选到一株产量提高30%的高产突变株。

2 ε-PL发酵生产

2.1 营养条件优化发酵

培养基组成及配比对微生物合成代谢产物有重要影响，是发酵过程优化与调控的出发点。Hiraki等[4]通过对S. albulus 11011A培养基组成成份和环境条件的优化，使其ε-PL发酵水平提高了4倍。Shih和Shen[7]应用响应面优化法对S. albulus IFO 14147发酵培养基的三个关键营养因素(葡萄糖、硫酸铵和酵母粉)配比进行了优化。实验结果表明，降低三个关键营养因素可以显著提高S. albulus IFO 14147 摇瓶发酵水平。Saimura等[8]研究结果显示，SO42-和NH4+是ε-PL产生菌合成ε-PL必不可少的营养元素。实际上，ε-PL经ε-PL聚合酶合成需要L-赖氨酸的巯基化过程，才能进行L-赖氨酸的聚合；而ε-PL合成前体L-赖氨酸合成过程中需要NH4+。因此，ε-PL合成过程中SO42-和NH4+必不可少。另外，柠檬酸添加到培养基中有利于ε-PL合成，可能是由于柠檬酸促进了胞内TCA循环中的草酰乙酸向天门冬氨酸的转化[8]。Kobayashi等认为，Fe2+、Mn2+和Co2+对K. kifunense合成ε-PL也有重要调节作用[9]。

2.2 pH分阶段控制发酵

发酵工艺优化研究是提高ε-PL产量的有效方法。Kahar等[10]根据S. albulus S410在菌体生长和ε-PL合成过程中与pH的关系，建立了两阶段pH调控策略：第一阶段控制pH在5.0以上用于菌体生长，第二阶段保持pH在4.0左右用于ε-PL合成。基于该策略，在5 L搅拌式生物反应器补料-分批发酵条件下，ε-PL产量从5.7 g/L提高到48.3 g/L，是目前报道的最高发酵产量。鉴于搅拌式生物反应器能耗较大的缺点，Kahar等[11]又研究了气升式生物反应器用于ε-PL发酵生产。相比于搅拌式生物反应器，他们发现气升式反应器不仅节约了动力消耗，而且由于剪切力小大大降低了菌体细胞内核酸类物质的泄漏，进而增加了ε-PL后提取收率，有效降低了生产成本。Shih和Shen[12]利用两阶段pH调控策略结合葡萄糖流加工艺，使得S. albulus IFO 14147发酵水平提高了258%，达到5.2 g/L。

2.3 细胞固定化发酵

利用链霉菌游离菌体在搅拌式反应器中发酵生产ε-PL时，面临着发酵液粘度高、细胞易裂解、菌体不能重复使用、不易实现半连续和连续式生产方式等不足。Hiraki和Suzuki等[13]

采用凝胶固定和多孔陶瓷包埋等细胞固定化方法，实现了对游离链霉菌细胞固定化的制备。他们将固定化后的链霉菌细胞用于半连续和连续式ε-PL发酵生产，显著降低ε-PL发酵生产成本，但却不能提高ε-PL发酵水平。Zhang等[14]利用丝瓜囊固定化培养Kitasatospora sp. MY 5-36，实现了在搅拌式生物反应器中重复补料-分批发酵生产ε-PL的模式，使得ε-PL批次发酵水平达到34.1 g/L，生产效率达到9.34 g/L·d-1，较非固定化发酵分别提高了51%和183%。

2.4 原位产物去除发酵

ε-PL作为一种抑菌物质，依靠其带有的正电荷与微生物细胞膜结合而影响胞内蛋白质合成和细胞质的分布，从而达到抑制微生物生长的作用。从这个抑菌机制上看，ε-PL有可能对其自身产生菌也同样具有抑制作用。Liu等[15]利用树脂原位吸附ε-PL的方法，研究了原位分离技术(ISPR)对ε-PL发酵的影响。他们首先从 Amberlite IRC-50，-76，-120和D152四种弱酸性阳离子型树脂中筛选出具有较高的ε-PL吸附和解吸附能力的D152作为原位吸附载体。在摇瓶发酵16 h时添加2 mL D152，到72h发酵结束时ε-PL产量由0.81g/L(不添加 D152)提高到2.86 g/L。而在利用搅拌式发酵罐生产ε-PL时，将D152用尼龙袋固定在发酵罐挡板和电极上，到196 h发酵结束时ε-PL产量达到23.4 g/L，比对照提高了6.2倍。可见，ISPR能够很好消除ε-PL潜在的产物抑制作用，并且可以显著提高ε-PL发酵水平。然而，采用尼龙袋固定树脂在发酵罐内可能会严重影响发酵液流场分布，带来发酵体系传质不均等弊端；同时，尼龙袋可能会因为搅拌强度过大而破损。总之，基于树脂的ISPR为ε-PL发酵提供了新的思路，但具体操作方式仍需要继续探索。

2.5 L-赖氨酸流加发酵

L-赖氨酸是ε-PL的合成前体物。一般来说，在发酵过程中添加一定量前体物对目标产物的合成都具有促进作用。Hirohara等[8]报道外源添加L-赖氨酸可以促进S. lydicus USE-11合成ε-PL的能力，但不能促进甚至抑制S. lydicus USE-51合成ε-PL的能力。可见，前体L-赖氨酸对ε-PL合成是否有促进作用，完全取决于菌株本身。贾士儒等[16]利用淀粉酶产色链霉菌发酵生产ε-PL时，在流加葡萄糖和硫酸铵的补料阶段，同时添加10-15g/L L-赖氨酸，120h发酵结束时ε-PL产量达到14-19 g/L，比对照提高了25-50%。

3 ε-PL聚合度控制

目前研究表明ε-PL聚合度在10以上即有很好的抑菌效果，而高聚合度ε-PL(≥30)呈苦味，不利于在食品中大量添加。因此，在发酵过程中若能控制菌株合成低聚合度ε-PL(10-20)将有效提高单位ε-PL的抑菌效价和消除因大量ε-PL添加可能引起的苦味隐患。Nishikawa

和Ogawa[17]在利用质谱研究ε-PL产生菌合成的ε-PL结构时发现ε-PL存在衍生物。随后，他们对该衍生物的结构进行鉴定，并发现该衍生物是ε-PL末端的-COOH和甘油的-OH缩合形成的酯化物。同时，他们还证实在发酵体系中添加其他短链脂肪醇(如乙烯基乙二醇、丙二醇和丁二醇)也可与ε-PL形成相应的酯化物，而外源添加的ε-PL并不能与甘油形成酯化结构的衍生物。另外，随着外源短链脂肪醇添加浓度的增加，酯化物中的ε-PL聚合度在不断减小；当短链脂肪醇添加超过一定浓度，ε-PL合成就会终止。可见，ε-PL与短链脂肪醇的酯化是发生在L-赖氨酸聚合的过程中。Nishikawa[18]指出尽管五亚甲基乙二醇能在ε-PL合成过程中有效控制ε-PL链长，但因在食品安全性方面存在隐患而不能在食品工业中应用。而甘油可以在食品工业中应用，但其对ε-PL聚合度控制不明显。Nishikawa 的研究结果表明，若在ε-PL合成体系中同时添加甘油和璜化β-环糊精将显著降低ε-PL链长，使得ε-PL分子量由3.5-4.5KDa减小到2.5KDa。当β-环糊精和正辛醇共同添加到ε-PL合成体系中可以更有效的形成低聚合度ε-PL，且不形成ε-PL-正辛醇的酯化物。至于为什么不形成ε-PL-正辛醇的酯化物而只形成低聚合度ε-PL，原因尚不清楚。尽管β-环糊精和正辛醇可以很好的在ε-PL合成过

程中控制ε-PL聚合度，但正辛醇在水中的溶解度极低且对ε-PL产生菌的生长有强烈抑制作用。因此β-环糊精和正辛醇用于ε-PL合成过程中控制ε-PL聚合度还存在一定局限性，但它为控制ε-PL聚合度提供了一种新思路。另外，Takehara等[19]希望筛选到低聚合度ε-PL产生菌，以实现从源头合成低聚合度ε-PL控制，从而摒弃外源添加化学物质可能带来的潜在危害。他们成功筛选到合成5-20聚合度的ε-PL产生菌，但发酵水平却远远低于现有产生菌发酵产量。因此，现阶段制备大量低聚合度ε-PL仍存在一定技术困难，还需要进一步研究。

4 展望

ε-PL作为新型天然食品防腐剂，具有很好的生物相容性和安全性，2003年已被美国FDA批准为安全食品保鲜剂。目前，ε-PL主要与甘氨酸、酒精、醋和糊精等复配后进行应用，50%含量ε-PL市场售价大约为1300-1500元/kg，且已经在日本形成了数十亿日元的市场规模。由此可见，ε-PL在食品防腐领域具有极大的市场潜力和蕴育巨大的商业价值。迄今为止，日本已有年产千吨ε-PL的微生物发酵生产线实现工业化，而国内由于对ε-PL的研究起步较晚，总体上还处于实验室和中试阶段。因此，在现有基础上更广泛的开展ε-PL发酵菌种改造、发酵生产及聚合度控制的研究具有积极的现实意义。可以预见在不久的将来，国内ε-PL的产业化研究和商品化利用会取得更大进展，为国民经济和社会发展作出更大贡献。

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［责任编辑：王洪泽］