六味地黄丸提取物对小鼠支持细胞体外增殖的影响

ＬＩＳＨＩＺＨＥＮ　ＭＥＤＩＣＩＮＥ　ＡＮＤ　ＭＡＴＥＲＩＡ　ＭＥＤＩＣＡ　ＲＥＳＥＡＲＣＨ　２０１３　ＶＯＬ．２４　ＮＯ．６　时珍国医国药２０１３年第２４卷第６期　Ｋ５６２细胞的抑制作用［Ｊ］．西安医科大学学报，２００２，２３（３）：２１７．　ＮＧ一１０８细胞株是由Ａｍａｎｏ博士等通过用小白鼠的神经胚　胎母细胞瘤（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）与大白鼠神经胶质细胞瘤（ｇｌｉｏｍａ）细ｌ　５　ｊ　段炳南，陈庆林．绞股蓝总皂甙对小鼠腹腔巨噬细胞内酶活性及吞　胞杂交融合而成的神经肿瘤株。这种杂交细胞能无限地继代繁　殖，能合成并释放乙酰胆碱递质，具有神经细胞的突起，具有正常　［Ｊ］．中国药业，２００６，１５（６）：４６．　神经细胞所具有的离子通道及酶等　。因此具有胆碱能特性　…　陈几香，张建国，张莉，等．绞股蓝总皂苷保肝作用实验研究［Ｊ］．　的ＮＧ一１０８细胞作为神经细胞模型，能较好地模拟ＡＤ的病理改　中国药业，２００７，１６（１３）：７．　噬功能的影响［Ｊ］．江西医学院学报，２００７，４７（３）：３８．　黄雪萍．绞股蓝总苷与辛伐他汀治疗原发性高脂血症的疗效比较　变。因此我们通过观察绞股蓝四个部位的提取物对ＮＧ一１０８细　ｒ　］　韦登明，饶广勋，杨文辉．绞股蓝总甙对实验性脑缺血损伤的保护　胞的增殖影响发现：绞股蓝正丁醇部位相对于水提取部位、石油　作用［Ｊ］．中药药理与ｌ临床，２００５，２１（１）：２Ｏ．　醚部位、乙酸乙酯部位而言，对ＮＧ一１０８细胞比较敏感，这可能『９］　姚柏春，袁华，黄翔，等．绞股蓝对海马注射Ａｐ。一４。大鼠脑内细　与其相对其他部位所含有皂苷类成分较多有关。绞股蓝正丁醇　胞周期蛋白表达和钙稳态变化的影响［Ｊ］．中国病理生理杂志，　部位在５～８０　ｍｌ浓度时，均可促进细胞生长，而在８０　ｍｌ　２００６，２２（８）：１６１８．　与空白对照组比较，无显著性意义。绞股蓝正丁醇部位的含药血［１ｏ］　齐刚，杨程，张莉，等．绞股蓝总皂苷对血管性痴呆大鼠海马　清在对ＮＧ一１０８细胞作用中，在１０％和２０％这两个剂量对ＮＧ　１０８细胞均有促进其生长作用，其中１０％剂量与空白血清组比　较，有显著性差异。虽然实验筛选结果表明，绞股蓝正丁醇部位　一一氧化氮合酶阳性神经元及核酸的保护作用研究［Ｊ］．中国临床康　昌，等．绞股蓝对老年性记忆减退和视觉诱发　复，２Ｏ０４，８（２８）：６２５７．　秦震，盛ｌ＿　周毅力，对ＮＧ一１０８细胞增殖有较好的作用，但其作用机制还有待进一　，　步研究。　电位的影响［ｊ］．温州医学院学报，１９９１，（１）：１７．　ｈｙｂｒｉｄ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　ａｓ　ａ　ｍｏｄｅｌ　ｎｅｕｒｏｎａｌ　ｓｙｓｔｅｍ『Ｍ　１．Ｉｎ　Ｃｅｌｌｕｌｌａｒ　Ｎｅｕｒｏｂｉ—　ｏｌｏｇｙ　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄｉｔｅｄ　ｂｙ　Ｃｈａｄ　Ｊ，Ｗｈｅａｌ　Ｈ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒ－　ｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９９２：７５．　ｔｙ　ＲＪ，Ｒｏｂｂｉｎｓ　Ｊ．Ｂｍｗｎ　ＤＡ．ＮＧ１０８—１５　ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａｘｇｌｉｏｍａ　ｌＺ　　Ｄｏｃｈｅｒｌ参考文献：　［１］陈武，邹盛勤，吴晓春，等．绞股蓝无糖口含片的制备工艺研究　［Ｊ］．食品科学，２００８，２９（３）：２４５．　＿ｌ　Ｈｕ　Ｑ，Ｓｈｉ　ＹＬ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｌｌ　ｉｎｗａｒｄ—ｒｅｃｔｉｆｙｉｎｇ　ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　ｃｕｒ－　ｒｅｎｔ　ｉｎ　ＮＧ１０８—１５　ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａｘ　ｇｌｉｏｍａ　ｃｅｌｌｓ［Ｍ］．Ｐｆｌｕｇｅｒ＂ｓ　Ａｒｃｈ　［２］刘青青，吴景东．绞股蓝提取液对自然衰老影响的实验研［Ｊ］．辽宁　Ｅｕｒ　Ｊ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９９７，４３３：１１７．　中医药大学学报，２００８，１０（６）：２０３．　Ｓｈｉ　ＹＬ，Ｆｕｍｙａ　Ｋ，Ｗａｎｇ　ＷＰ，ｅｔ　ａ１．Ｔｏｏｓｅｎｄａｎｉｎ　ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｃａ¨ｃｏｎ—　［３］刘侠，汪平君，许伏新．绞股蓝总皂苷抑制小鼠Ｌｅｗｉｓ肺癌生长与　＿Ｊ斗。　ｄｕｃｔａｎｃｅ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｉｎ　ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｇｌｉｏｍａ　ｈｙｂｒｉｄ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｃｈｉ　Ｓｃｉ　提高免疫力研究［Ｊ］．安徽中医学院学报，２００１，２０（１）：４３．　［４］徐长福，王冰，任淑婷，等．绞股蓝总皂甙对小鼠Ｓ１８０肉瘤及　Ｂｕｌｌ，１９９３，３８：１４８９．　’　／＼　味地黄丸提取物对小鼠支持细胞体外增殖的影响　王庆忠，王东方，刘慧莲，冯道俊，王汉海，郭祖宝　２６１０６１）　（山东省高校生物化学与分子生物学重点实验室／潍坊学院生物与农业工程学院，山东潍坊摘要：目的探讨六味地黄丸提取物对小鼠支持细胞体外增殖的影响。方法通过形态学观察、ＭＴＩ＂法检测细胞活力、　ＴＵＮＮＥＬ法检测细胞凋亡指数和Ｂｒｄｕ标记法检测细胞增殖活性等研究５个不同浓度的六味地黄丸提取物对小鼠支持细　胞体外生长和增殖的作用。结果当用２０　ｍｇ／Ｌ以上的六味地黄丸提取物处理培养的小鼠支持细胞时，ＴＥＮＮＥＬ法获得　的细胞凋亡指数、ＭＴＩ＂法测得的细胞生长抑制率和Ｂｒｄｕ标记法测得的细胞增殖率与对照组相比有显著差异，并呈剂量　依赖效应；细胞形态观察结果也证实这一现象。结论六味地黄丸提取物以剂量依赖方式促进体外培养的小鼠支持细胞　的增殖，抑制细胞凋亡，可能通过促进支持细胞的增殖与活性促进精子发生。　关键词：六味地黄丸；提取物；　支持细胞；增殖；　小鼠　Ｄ０Ｉ标识：ｄｏｉ：１０．３９６９／ｉ．ｉｓｓｎ．１００８－０８０５．２０１３．０６．０３２　中图分类号：Ｒ２８５．５　文献标识码：Ａ　文章编号：１００８－０８０５（２０１３）０６－１３６３－０３　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｅｘｔｒａｃｔｓ　ｆｒｏｍ　Ｌｉｕｗｅｉ　ｄｉｈｕａｎｇ　Ｐｉｌｌ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｏｕｓｅ　Ｓｅｒｔｏｌｉ　ｃｅｌｌｓ　ＷＡＮＧ　Ｑｉｎｇ—ｚｈｏｎｇ，ＷＡＮＧ　Ｄｏｎｇ—ｆａｎｇ，ＬＩＵ　Ｈｕｉ－ｌｉａｎ，ＦＥＮＧ　Ｄａｏ－ｊｕｎ，ＷＡＮＧ　Ｈａｎ—ｈａｉ，ＧＵＯ　Ｚｕ－ｂａｏ　（Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　ｂｉｏｃｈｅｍ￣ｔｒｙ　ａｎｄ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ　ｉｎ　ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｓｈａｎｄｏｎｇ　ｐｒｏｖｉｎｃｅ（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　ｂｉｏ—ｅｎｇｉ—　ｎｅｅｒｉｎｇ　ａｎｄ　ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｗｅｉｒａｎｇ　ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ，Ｗｅ　ｎｇ　２６１０６１，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｅｓｅｎｔ　ｓｔｕｄｙ，ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｅｘｔｒａｃｔｓ　ｏｆ　Ｌｉｕｗｅｉ　ｄｉｈｕａｎｇ　ｐｉｌｌ（Ｌｗ）ｗｉｔｈ　５　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｃｕｌ－　ｔｕｒｅｄ　Ｓｅｒｔｏｌｉ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ＤＭＥＭ　ｍｅｄｉｕｍ　ｗｅｒｅ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ，ＭＴＦ　ｓｕｐｒａｖｉｔａｌ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｆｏｒ　ｃｅｌｌ　ｖｉａ—　ｂｉｌｉｔｙ　ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ，Ｔｕｎｎｅｌ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｃｅｌｌ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ａｎｄ　ＢｒｄＵ　ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｏｒ　ｃｅｌｌｆ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｍｏｎｉｔｏｒ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｗｈｅｎ　收稿日期：２０１２．１０—１２；修订日期：２０１３－０３－０７　基金项目：山东省自然科学基金（Ｎｏ．ＺＲ２０１２ＣＱｏ２８）；山东省潍坊市科技发展计划（Ｎｏ．２０１１１０２２；２０１１１１０２３；２０１０１４３）；　山东省潍坊学院优秀学术团队项目（Ｎｏ．２０１０Ｚ０３）　作者简介：王庆忠（１９６１．），男（汉族），山东潍坊人，现任潍坊学院生物与农业工程学院教授，博士学位，主要从事生殖生理学与药理学的研究工作　・１３６３・　时珍国医国药２０１３年第２４卷第６期ＬＩＳＨＩＺＨＥＮ　ＭＥＤＩＣＩＮＥ　ＡＮＤ　ＭＡＴＥＲＩＡ　ＭＥＤＩＣＡ　ＲＥＳＥＡＲＣＨ　２０１３　ＶＯＬ．２４　ＮＯ．６　ｔｈｅ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　Ｓｅｒｔｏｌｉ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　１０　ｍｇ／Ｌ　ｏｒ　ｍｏｒｅ　ｏｆ　ｅｘｔｒａｃｔｓ　ｏｆ　ＬＷ，ｔｈｅ　ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ｉｎｄｅｘ　ｆｒｏｍ　ＴＥＮＮＥＬ　ｍｅｔｈｏｄ　ｈａｄ　ｎｏ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｄａｔａ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ，ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｒａｔｅ　ｏｆ　Ｓｅｒｔｏｌｉ　ｃｅｌｌｓ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｂｙ　ＭＴＦ　ｍｅｔｈｏｄ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｄａ—　ｔａ　ｏｆ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｍｏｎｉｔｏｒ　ｂｙ　ＢｒｄＵ　ｌａｂｅｌｉｎｇ　ａ１ｌ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｄａｔａ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｗｉｔｈ　ａ　ｄｏｓｅ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｍａｎｎｅｒ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ａｌｓｏ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｔｈｅ　ａｂｏｖｅ　ｐｈｅｎｏｍｅｎａ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｔｓ　ｏｆ　ＬＷ　ｅｎｈａｎｃｅｓ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　Ｓｅｒｔｏｌｉ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ，ｗｈｉｃｈ　ｐｒｏｂａｂｌｙ　ｐｒｏｍｏｔｅ　ｔｈｅ　ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｌｉｕｗｅｉ　ｄｉｈｕａｎｇ　ｐｉｌｌ；Ｅｘｔｒａｃｔｓ；Ｓｅｒｔｏｌｉ　ｃｅｌｌｓ；Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ；Ｍｏｕｓｅ　全球不育人口中男性不育约占５０％［１１，其中７０％不育男子　血清培养２４　ｈ。然后加入提取物，使其终浓度分别为５，１０，２０，　表现为精子缺失、稀少或无活力　］，治疗男性不育关系着家庭与　４Ｏ，８０　ｍｇ／Ｌ，并继续进行无血清培养４８　ｈ。每一浓度设５个平行　社会的和谐稳定。六味地黄　汤（１ｉｕｗｅｉ　ｄｉｈｕａｎｇ　ｐｉｌｌ，ＬＷ）具有　孔。同时设对照组（不加药组）及空白组（仅加培养基）。继续培　滋阴补肾、兼益肝阴的功效。主治肾阴不足，骨蒸潮热，盗汗遗　养４８　ｈ后，每孔加入５ｇ／Ｌ的ＭＴＴ　２０　ｉｘｌ，培养箱中孵育４　ｈ。然　精，小便淋漓，舌红少苔乏津，脉细数或脉虚大等　，在当今临床　后吸出孔内培养液，每孔加入ＤＭＳＯ液２００　ｔｘｌ，微孔板震荡器上　上常用于不孕不育症的治疗　，５　Ｊ。用ＬＷ治疗少、弱精子的男性　振荡１０　ｍｉｎ以使结晶物溶解。最后在酶标仪上于４９０　ｎｍ波长　不育症有明显的疗效　Ｊ，但对其作用机理的研究报道甚少。睾　下测定各孔的０１）值。并以下述公式计算细胞存活率和抑制率：　丸支持细胞（Ｓｅｒｔｏｌｉ　ｃｅｌｌｓ）是生精上皮中的唯一直接与生精细胞　相接触的体细胞，起到营养、支持、保护等作用，并通过分泌多种　激素和生长因子调节着精子发生过程　Ｊ。在本研究中，我们以　细胞存活率ｃ％　＝　｛　ｉ　２　２｝　＿　ｌ　抑制率＝１００％一存活率　×　００％　小鼠睾丸支持细胞为材料，研究了ＬＷ提取物对其增殖的影响，　２．４原位末端标记法（ＴＵＮＮＥＬ）检测支持细胞凋亡指数０．２％　明胶包被盖玻片ｌＯｍｉｎ，ＰＢＳ洗涤３ｍｉｎ　ｘ　２次。对数增长期的支　探讨了ＬＷ促进精子生成的机理。　１材料　持细胞以５　ｘ　１０　ｅｅｌｌ／Ｌ的密度接种于盖片，药物处理和细胞培养　１．１　动物ＩＣＲ小鼠购于北京维通利华实验动物有限公司，并在　过程同“２．３”。细胞的染色按试剂盒说明书进行，主要步骤如　下：①取出细胞爬片，ＰＢＳ洗涤３　ｍｉｎ　ｘ２次，４％多聚甲醛固定２０　本实验室动物房饲养。　ｎ，ＰＢＳ洗涤５　ｍｉｎ　ｘ　２次；②加３％Ｈ２Ｏ２室温下孵育２０　ｍｉｎ，　１．２试剂和仪器Ｌ一谷胺酰胺、二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）、胎牛血清　ｍｉ　ｍｉｎ×３次；③０．１％蛋白酶Ｋ在４℃下作用３０　ｍｉｎ，　（ＦＢＳ）、ＤＭＥＭ、胶原酶ＩＶ、透明质酸酶、胰蛋白酶（Ｔｒｙｐｓｉｎ）、明　ＰＢＳ洗涤５　ｍｉｎ×３次；④加反应混合液，湿盒内３７℃孵育６０　胶、ＭＴｒ等均购于Ｓｉｇｍａ—Ａｌｄｒｉｃｈ公司；ＴＵＮＮＥＬ细胞凋亡检测　ＰＢＳ洗涤５ｎ，ＰＢＳ洗涤５　ｍｉｎ×３次，然后加５０　ｌ的ＰＯＤ，继续孵育６０　试剂盒为凯基生物有限公司产品，ＬＷ配方中各药材购于同仁堂　ｍｉｎ，ＰＢＳ洗涤５　ｍｉｎ×３次；⑤加５０　新配制的ＤＡＢ显色试剂，　药店。主要仪器包括Ａｎ　Ｔｈｏｓ　ＴＨ２酶标仪（Ａｕｓｔｒｉａ公司）、ＲＥ一　ｍｉ５２９９旋转蒸发仪（上海一凯设备有限公司）等。　２方法　作用３—５　ｍｉｎ，自来水洗，置镜下观察。每张玻片上随机选取５　个视野，计数５００个细胞中的阳性细胞数，每处理组各计数３张　取平均值并计算出凋亡指数。　２．１小鼠支持细胞的分离与培养①脱臼处死出生９—１０　ｄ的　玻片，ｄｕ标记法检测细胞增殖活性细胞接种、培养和药物处　雄性小鼠，离体睾丸，ＰＢＳ洗涤３　ｍｉｎ×３次，除去睾丸白膜；②转　２．５　Ｂｒ将Ｂｒｄｕ加入各培养皿中，使　移睾丸组织到ｌ５　ｍｌ离心管中，加ｌＯ倍体积的ＰＢＳ洗涤３　ｍｉｎ　ｘ　理过程同上。在药物处理４８　ｈ后，／Ｌ，培养箱中孵育４　ｈ。细胞染色过程按Ｂｒ—　３次；③加１０倍体积的消化液（在不含钙和镁的ＰＢＳ中添加２　ｇ／　其终浓度为１０　ｍｍｏｌｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）说明书进行，主要步骤如下：　Ｌ胶原酶ＩＶ、０．２　ｇ／Ｌ　ＤＮＡ酶、２　ｇ／Ｌ透明质酸酶和２　Ｌ胰蛋白　ｄｕ原位检测试剂盒（ＢＤ　Ｂｉ０　ｍｉｎ，ＰＢＳ洗涤５　酶），室温下（２５～２８￣Ｃ）作用５～１０　ｍｉｎ，伴随着或轻或重的吸　①一２０。ｃ下以冰冷的乙醇一丙酮混合液固定１打，然后２５０　ｇ离心５　ｍｉｎ，弃上清；④加１Ｏ　ｍｌ　ＤＭＥＭ培养基　ｍｉｎ×２次；②用稀释的缓冲液透化３０　ｍｉｎ后，０．３％Ｈ　Ｏ：孵育　（ＤＭＥＭ中添加２　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｌ一谷氨酰胺、５％ＦＢＳ、１０　ｕｎｉｔ／Ｌ青霉　１０　ｍｉｎ，ＰＢＳ洗涤５　ｍｉｎ　ｘ２次；③加工作液Ａ，８９。Ｃ作用１０　ｍｉｎ，　素和１００　ｍｇ／Ｌ链霉素）重悬细胞，用６０　Ｍ孔径的筛网过滤，滤出　冷却至室温，ＰＢＳ洗涤５　ｍｉｎ　ｘ３次；④每盖片加１：１０稀释的生　ｄｕ抗体１００　Ｉｘｌ，室温孵育１　ｈ，ＰＢＳ洗涤５　ｍｉｎ×２　液于２００　ｘ　ｇ离心５　ｍｉｎ，弃上清；⑤加ＤＭＥＭ培养基重悬细胞，以　物素标记的抗Ｂｒ⑤每盖片加Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ—ＨＲＰ１００　ｌ，室温孵育３０　ｍｉｎ；⑥ＰＢＳ　５　ｘ　ｌ０　ｃｅｌｌ／Ｌ密度接种到明胶包被的培养瓶或培养板或盖玻片，　次；置培养箱中培养。⑥据支持细胞贴壁快的特性，采用贴壁筛选法　洗涤５　ｍｉｎ×２次，加ＤＡＢ试剂显色，并以苏木精复染，镜下观察　　纯化支持细胞　。实验时选择对数生长期的细胞进行传代和接　和计数。每一盖片随机计数３个视野，约分别计数２００个细胞，种。　实验重复３次。　６统计分析实验数据以平均数４＿ＳＥＭ表示，数据用ＰＳＳ１－０．０　２．２　ＬＷ提取物的制备六味地黄丸配方为熟地黄２４　ｇ，山茱萸　２．（制）１２　ｇ，山药１２　ｇ，泽泻９　ｇ，茯苓９　ｇ，牡丹皮９　ｇ。各药材经粉　软件ｓ进行统计处理，以Ｏｎｅ—ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ判断各组间差异，以　碎后过３０目筛，按ＬＷ复方之组成准确称取各药材配合后，加５　Ｐ＜０．０５为差异显著。　—７倍体积的去离子水，浸１　ｈ，索氏提取器中煮沸回流提取１　ｈ，　３结果　冷却后真空抽滤，滤渣再索氏提取２次。合并滤液，在旋转蒸发　３．１　光镜下观察到ＬＷ提取物对支持细胞的增殖有促进作用　仪上４０℃真空浓缩至干。称重，配制成１０．０　ｇ／Ｌ提取物的储存　倒置显微镜下，无血清培养的对照组的支持细胞生长不良，少数　液，一２０℃冷藏备用。　呈梭形或多角形，多数呈圆形或脱壁漂浮（图１一Ａ）。５　ｍｇ／Ｌ的　２．３　ＭＴＹ比色法检测支持细胞活性用０．２５％胰蛋白酶消化对　Ｌｗ提取物处理组的细胞形态结构与对照组相似（图未出示）；　数生长期的支持细胞，制成５　ｘ　１０　ｃｅｌｌ／Ｌ的细胞悬液，以每孔　ｌＯｍｇ／Ｌ的ＬＷ提取物处理组可观察到呈梭形或多角形的细胞增　２００　ｌ接种于９６孔板，置培养箱中培养１２　ｈ后，弃掉培养基，无　多（图未出示）；２０　ｍｇ／Ｌ的ＬＷ提取物处理组中梭形或多角形细　・１　３６４．　ＬＩＳＨＩＺＨＥＮ　ＭＥＤＩＣＩＮＥ　ＡＮＤ　ＭＡＴＥＲＩＡ　ＭＥＤＩＣＡ　ＲＥＳＥＡＲＣＨ　２０１３　ＶＯＬ．２４　ＮＯ．６　胞数量明显增多，细胞总数增加（图１一Ｂ），这在４０　ｍｇ／Ｌ的ＬＷ提取物处理组中表现更加明显（图１一Ｃ）。可以看出，随处理剂　量的增加，ＬＷ提取物有促进支持细胞的增殖的作用。　致。　时珍国医国药２０１３年第２４卷第６期　３．２　ＭＴＹ法检测到ＬＷ提取物促进支持细胞增殖ＭＴＴ法测定　的不同浓度的ＬＷ提取物对支持细胞的生长与增殖的影响见　表１。从表１中可以看出，５ｍｇ／Ｌ和ｌＯｍｇ／Ｌ的ＬＷ提取物对培　养的小鼠支持细胞的增殖没有显著影响，２０　ｍ＃Ｌ　ＬＷ提取物处　理组对支持细胞增殖的抑制作用与对照组比较已经有较明显的　差异，随着处理浓度的增大，这种抑制作用越来越弱。说明ＬＷ　提取物在一定浓度范围内可促进支持细胞的生长与增殖。　图２体外培养的小鼠支持细胞　增殖活性的Ｂｒｄｕ标记法检测（　±ｓ。ｎ＝３）　■■■　Ａ一对照组；Ｂ一２０　ｍｇ／ＬＬＷ提取物处理组；　Ｃ一４０ｍｇ／ＬＬＷ提取物处理组　表１　ＭＴＴ法检测各浓度ＬＷ提取物　对支持细胞增殖作用的影响（ｉ　）　一　～∞　Ｈ！　ｏ　∞！　Ｉｓ０　，　∞　４结论与讨论　睾丸是精子的发育器官，支持细胞通过分泌激素和多种生长　因子调节着精子发生过程　。ＬＷ是治疗不孕不育症的常用药　剂　“Ｊ，用ＬＷ治疗少精子和弱精子的男性不育症有明显的疗　效　Ｊ。在本研究中，我们以体外培养的小鼠支持细胞为材料，　通过倒置显微镜下的细胞形态与结构观察、ＭＴＦ法测定细胞活　活性四种方法研究了ＬＷ提取物对小鼠支持细胞的影响。结果　表明ＬＷ提取物促进体外培养的小鼠支持细胞增殖，抑制细胞调　亡，并呈剂量依赖效应。这一结果与以前的报道相一致　。我　们认为，ＬＷ提取物对生精过程的促进作用可能在一定程度上依　赖于其对睾丸支持细胞的促增殖作用。但这种促增殖作用的分　子机制还需要进一步的研究。　图Ｉ　倒置显微镜下观察到的ＬＷ提取物对支持细胞的影响（Ｂａ：５０　ｍ）　性、ＴＵＮＮＥＬ法检测细胞凋亡指数和Ｂｒｄｕ标记法检测细胞增殖　加　Ｍ　０　０　０　０　参考文献：　与对照组比较，　Ｐ＜０．０５；ｎ：３　［１］Ｐｏｏｎｇｏｔｈａｉ　Ｊ，Ｇｏｐｅｎａｔｈ　Ｔ　Ｓ，Ｍａｎｏｎａｙａｋｉ　Ｓ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｍａｌｅ　ｉｎ—　ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ［Ｊ］．Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ．Ｍｅｄ　Ｊ，２００９，５０：３３６．　３．３　ＴＵＮＮＥＬ法检测到ＬＷ提取物不诱导培养的支持细胞凋亡　『２］　Ｗｉｓｅ　Ｐ．Ｍａｌｅ　ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ　ｕｐｄａｔｅ［Ｊ］．Ｗｅｓｔ　Ｊ　Ｍｅｄ，１９９１，１５（５）：６３５．　为了验证以上结果，我们进行了ＴＵＮＮＥＬ检测，结果表明Ｌｗ提取物不诱导培养的支持细胞凋亡（表２）。随着处理浓度的增加，　『３］　于世良，史定文．中药名方精解［Ｍ］．北京：中医古籍出版社，１９９３：　１３６．　凋亡指数减小。２０　ｍｇ／Ｌ以上的Ｌｗ提取物处理组的凋亡指数与对照组相比有显著差异。　表２不同浓度的ＬＷ提取物对支持细胞影响的凋亡指数　［４］　王瑞林，战为平．六味地黄丸系列及氯米酚治疗排卵障碍不孕２５　例疗效与Ｂ超观察［Ｊ］．吉林中医药，２０００，２０（４）：３４．　［５］　王书鸿．六味地黄丸和其衍生方在临床上的应用［Ｊ］．广西医学院　学报，１９８５，２（３）：７０．　『６］　凌庆枝，敖宗华，许泓瑜，等．六味地黄汤对生精障碍模型大鼠的促　生精作用研究［Ｊ］．陕西中医，２００３，１７（１１）：２３．　ｒ，］　Ｌ／Ｊ　ＬＷ提取物处理浓度／ｍｇ・Ｌ　对照　５　１０　２Ｏ　支持细胞凋亡指数（％）　４６．７３　４４．５１　３９．４１　３４．２１　孙振高，孙金龙，姜鲲鹏，等．六味地黄软胶囊对精液参数及精子　ＤＮＡ质量的影响［Ｊ］．中华中医药杂志，２０１１，２５（２）：２１．　４０　８Ｏ　２９．４３　２６．２１　［８］　刘怀民．六味地黄合五子衍宗加昧治疗男性少、弱精症８０例临床　观察［Ｊ］．新疆中医药，２０１ｌ，１６（４）：１９．　Ｌ　Ｊ　Ｈｕｔｅｈｉｓｏｎ　Ｇ　Ｒ，Ｓｃｏｔｔ　Ｈ　Ｍ，Ｗａｌｋｅｒ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｓｅｒｔｏｌｉ　ｃｅｌｌ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　与对照组比较，　Ｐ＜０．０５；／Ｚ＝３　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ａｎ　ａｎｉｍａｌ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｔｅｓｆｉｃｕｌａｒ　ｄｙｓｇｅｎｅｓｉｓ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ［Ｊ］．　３．４　Ｂｒｄｕ标记法检测到ＬＷ提取物促进支持细胞增殖对各不　测结果见图２。对照组的增殖细胞占３．２％，２０　ｍｇ／Ｌ的Ｌｗ处理　Ｂｉｏｌ　Ｒｅｐｒｏｄ，２００８，７８：３５２．　同浓度的Ｌｗ提取物处理的支持细胞增殖活性的Ｂｒｄｕ标记法检　『１０］　Ｓｈｉ　Ｙ　Ｑ，Ｗａｎｇ　Ｑ　Ｚ，Ｌｉａｏ　Ｓ　Ｙ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎ　ｖｉｔｏｒ　ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｐｅｒｍａｔｏｇｏ－　ｎｉａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｆｒｏｍ　ＫＭ　ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｆｒｏｎｔ　Ｂｉｏｓｃｉ，２００６，１１：２６１４．　等．六味地黄汤抑制大鼠生精细胞凋亡及　［１１］　凌庆枝，敖宗华，许泓瑜，其促进精子发生［Ｊ］．无锡轻工大学学报，２００４，２３（１）：７５．　组中的增殖细胞占１３．３％，随着处理浓度的增大，增殖细胞比例增加，呈剂量依赖效应。这与ＭＴＩ＂法检测细胞活力的结果相一　・１３６５・