为了保证本品无菌检查方法的检验质量，确保检验结果的准确性和可靠性，根据《中国药典》（2010年版）要求，我们对***的无菌检查进行了方法学验证考察。验证结果如下： 1、菌种：
大肠埃希菌[CMCC(B)44 102] 金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]
铜绿假单胞菌[CMCC（B）10 104]
枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501]
生孢梭菌[CMCC（B）64 941]
白色念珠菌[CMCC（F）98 001]
黑曲霉[CMCC（F）98 003]
以上菌种均由中国药品生物制品检定所提供，以上菌种所用菌株传代次数均未超过5代，符合验证试验要求。 2、 材料和仪器 2.1供试品：
***，批号：20130402，滨州蓝海中医药科技研究中心提供，标示：高压灭菌。 ***，批号：20130402，滨州蓝海中医药科技研究中心提供，标示：辐照灭菌（2.8kGY）。 2.2培养基：
营养琼脂培养基（批号1103162中国药品生物制品检定所） 营养肉汤培养基（批号101215中国药品生物制品检定所） 玫瑰红钠琼脂培养基（批号110222中国药品生物制品检定所） 改良马丁培养基（批号110211中国药品生物制品检定所） 改良马丁琼脂培养基（批号101028中国药品生物制品检定所） 硫乙醇酸盐流体培养基（批号110214中国药品生物制品检定所） 蛋白胨水培养物（批号100803中国药品生物制品检定所） 2.3仪器
1
LRH-250A生化培养箱（广东省医疗器械厂） YXQ-LS-50SII立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业）
HH-B11-600电热恒温培养箱（天津实验仪器厂） 9240MBE数显鼓风不锈钢干燥箱（上海博迅有限公司） HZY-III型智能集菌仪（杭州高得医疗器械有限公司） 全封闭集菌培养器（杭州高得医疗器械有限公司） 2.4稀释剂
0.9%无菌氯化钠溶液 0.1%蛋白胨水溶液 3、 菌液制备
（1）将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物分别接种至10ml营养肉汤中，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基10ml中，30℃～35℃培养18～24小时，取此培养液1ml加到9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，采用10倍递增稀释法，稀释至10-3～10-8，使菌数小于100cfu/ml，见表1。
（2）接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基10ml中，30℃～35℃培养18～24小时，取此培养液1ml加到9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～10-8，使菌数小于100cfu/ml，见表1。
（3）将白色念珠菌的新鲜培养物分别接种至10ml改良马丁液体培养基中，23℃～28℃培养24～48小时，取此培养液1ml加到9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～10-6，使菌数小于100cfu/ml，见表1。
（4）将黑曲霉的新鲜培养物接种至10ml改良马丁琼脂培养基中，23℃～28℃培养5～7天，加3ml～5ml0.9%无菌氯化钠溶液，洗下霉菌孢子，吸出菌液，取1ml菌液加到9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，采用10倍递增稀释法，稀释至10-4～10-6，使孢子数小于100cfu/ml，见表1。
表1 活菌预试验——活菌计数
菌 名 代 数 稀释级 次数 大肠埃希金黄色葡萄球铜绿假单枯草芽孢生孢梭白色念菌 第三代 10-7 1ml 菌 第三代 10-4 1ml 胞菌 第三代 杆菌 第三代 菌 珠菌 黑曲霉 第三代 第三代 第三代 10-6 1ml 10-7 1ml 10-6 1ml 10-5 1ml 10-5 1ml 2
1 2 平均值 66 63 64.5 74 66 70 53 53 53 56 59 57.5 59 62 60.5 85 86 85.5 50 48 49 4培养基灵敏度检查
取每管装量为12ml 的硫乙醇酸盐流体培养基9 支，分别接种小于100 cfu 的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2 支，另1支不接种作为空白对照，培养3 天； 取每管装量为9ml 的改良马丁培养基5 支,分别接种小于100 cfu 的白色念珠菌、黑曲霉各2 支，另1 支不接种作为空白对照，培养5 天。逐日观察结果。结果见表2
表2：培养基灵敏度检查结果
培养基 菌种 管数 1 金黄色葡萄球菌 2 1 2 1 2 1 2 观察结果 1d + + + + + + + + — 1 2 1 2 + + + + — 2d + + + + + + + + — + + + + — 3d + + + + + + + + — + + + + — 4d — + + + + — 5d — + + + + — 硫乙醇酸盐流体培养基 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌 生孢梭菌 空白组 白色念珠菌 改良马丁培养基 黑曲霉 空白组 “—”表示无菌生长。“+”表示生长良好
结果判定：空白对照管无菌生长，加试验菌的培养基管均生长良好，该培养基的灵敏度检查符合规定。
3
5．检验方法验证 5.1预实验
5.1.1采用了直接接种法，取本品0.5g，分别直接加入到100ml、200ml、500ml体积的培养基进行培养，经过试验发现，由于本品为中药细粉，在培养基中形成混悬样溶液，影响了本品培养结果的观察，所以本品不宜采用直接接种法进行本品的无菌检查。
5.1.2改用薄膜过滤法，取本品0.5g，加0.9%无菌氯化钠溶液50ml，摇匀，然后通过薄膜过滤，结果中药细粉将薄膜滤孔完全堵塞，不能过滤，尝试采用先离心后过滤的方法进行试验，仍然不能解决薄膜滤孔堵塞的问题。 5.2正式试验
取供试品0.5g，加0.9%无菌氯化钠溶液50ml，用无菌滤纸滤过后，再用0.9%无菌氯化钠溶液50ml，冲洗残渣，合并滤液，按照薄膜过滤法过滤，用0.9%无菌氯化钠溶液冲洗3次，每次100ml，最后一次冲洗液中加入小于100cfu的试验菌，分别加入相应硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基100ml，作为样品验证组。另取样品验证组所用试验菌加入至50ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，无菌滤纸滤过，滤液按照薄膜过滤法过滤，0.9%无菌氯化钠溶液冲洗3次，每次100ml，最后加入同体积培养基，作为阳性对照组。
取供试品按照样品验证组制备方法，不加试验菌，分别加入相应硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基100ml，作为样品组。
以同体积的培养基的培养器作为空白对照组。
按规定温度培养3～5天。各试验菌同法操作。结果见表3。
表3 ***（批号20130402，高压灭菌）无菌检查法验证（薄膜过滤法） 培养基 菌种 样品验证组 阳性对照组 4
1d 2d 3d 4d 5d 1d 2d 3d 4d 5d 大肠埃希菌 硫乙醇酸盐流体培养基100ml 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 生孢梭菌 空白组 样品组 白色念珠菌 改良马丁黑曲霉 培养基空白组 100ml 样品组 ++ ++ ++ ++ — — + + — — ++ ++ ++ ++ — — ++ ++ — — ++ ++ ++ ++ — — ++ ++ — — ++ ++ ++ ++ — — ++ ++ — — ++ ++ ++ ++ — — ++ ++ — — ++ ++ ++ ++ — — + + — — ++ ++ ++ ++ — — ++ ++ — — ++ ++ ++ ++ — — ++ ++ — — ++ ++ ++ ++ — — ++ ++ — — ++ ++ ++ ++ — — ++ ++ — — “+”表示有菌生长；“++”表示生长良好，“—”表示无菌生长。 5.3 结果判断
与阳性对照组比较，样品验证组中的试验菌均生长良好，供试品可采用该方法进行无菌检查。 6 验证结论
按照《中国药典》（2010年版）无菌检查法的方法验证，供试品***的无菌检查法为：取本品规定量，每瓶取0.5g，分别加0.9%无菌氯化钠溶液50ml，无菌滤纸滤过，再用0.9%无菌氯化钠溶液50ml洗涤，合并滤液，全部滤液按照薄膜过滤法处理，采用0.9%无菌氯化钠溶液300ml分次冲洗（每次100ml）的方法检查，应符合规定。 7 样品测定：
取本品10瓶，每瓶取0.5g，分别加0.9%无菌氯化钠溶液50ml，无菌滤纸滤过，另取0.9%无菌氯化钠溶液50ml洗涤，合并滤液，全部滤液按照薄膜过滤法，采用0.9%无菌氯化钠溶液300ml分次冲洗（每次100ml），每个培养器加入硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基接种各100ml，最后取供试品按照上述方法过滤后接种金黄色葡萄球菌小于100cfu作为阳性对照。同时以同体积的培养基的培养器作为阴性对照。结果见表4。
表4：两批供试品的无菌检查检验结果
5
培养基 批号 1 20130402 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 天数 硫乙醇酸盐流体培— — — — — — — — — — — — — — 高压灭菌组 20130402 养基(100ml/管) 辐照灭菌组 — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 阴性对照 20130402 改良马丁培养基 (100ml/管) 高压灭菌组 20130402 辐照灭菌组 — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 阴性对照 阳性对照 (金黄色葡萄球菌) 培养48小时，生长良好
由上述检测结果可知，分别采用高压灭菌和辐照灭菌处理的两批样品，无菌检查均符合规定。
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