湖南农业大学学报（自然科学版） ２０１５年４月 第４１卷第２期 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＨｕｎａｎＡ￣ｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆＮａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）。ＡＤｒ．２０１５．４１ｆ２１：１４９—１５５ ＤＯＩ：１０．１３３３１／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｈａｕ．２０１５．０２．００７ 投稿网址：ｈｔｔｐ：／／ｘｂ．ｈｕｎａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ 鸡蛋蛋清和蛋白多酶水解工艺的优化 霍永久 ，刘正旭 ，金晓君 ，赵国琦 （１．扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州２２５００９；２．苏州天马集团天吉生物制药有限公司，江苏苏州 ２１５１０１） 摘要：探讨复合蛋白酶（ｐｒｏｔａｍｅｘ）、中性蛋白酶（ｎｅｕｔｒａｓｅ）、碱性蛋白酶（ａｌｃａｌａｓｅ）￥１］风味蛋白酶（ｌｆａｖｏｕｒｚｙｍｅ）４种 商业酶多酶水解鸡蛋蛋清、蛋白的工艺和水解效果（最适温度和ｐｈ相近的ｐｒｏｔａｍｅｘ、ｎｅｕｔｒａｓｅ、ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ ３种酶 同时水解；最适温度和ｐｈ相差较大的ａｌｃａｌａｓｅ、ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ分阶段水解）。结果表明：ｐｒｏｔａｍｅｘ、ｎｅｕｔｒａｓｅ和 ｌｆａｖｏｕｒｚｙｍｅ ３种酶同时水解蛋清、蛋白的正交试验优化条件为水解时间６ ｈ、ｐＨ ６．５、酶比例１：１：２、蛋清浓度 １：５（ｖ ： ），此条件下水解６ ｈ的水解度达５３．２４％，水解产物相对分子质量３００以下的比例达６８．０６％，游离 氨基酸比例达４４．０２％；ａｌｃａｌａｓｅ、ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ分阶段水解蛋清、蛋白的正交试验优化条件为蛋清浓度１：５、酶比 例１：２、水解时间各３ ｈ，在此条件下的水解度达４５．０５％，水解产物相对分子质量５００以下的达９５．５９％，游离 氨基酸比例达３８．０１％。 关 键 词：鸡蛋；蛋白酶；水解；复合蛋白酶；中性蛋白酶；碱性蛋白酶；风味蛋白酶 中图分类号：ＴＱ９３６．１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００７—１０３２（２０１５）０２—０１４９—０７ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｅｇｇ ｗｈｉｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｓｉｎｇ ｍｕｌｔｉ－ｅｎｚｙｍｅ Ｈｕｏ Ｙｏｎｇｊｉｕ ，Ｌｉｕ Ｚｈｅｎｇｘｕ ，Ｊｉｎ Ｘｉａｏｊｕｎ２，Ｚｈａｏ Ｇｕｏｑｉ （１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｙａｎｇｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｚｈｏｕ，Ｊｉａｎｇｓｕ ２２５００９，Ｃｈｉｎａ；２．Ｓｕｚｈｏｕ Ｔｉａｎｍａ ｇｒｏｕｐ，Ｓｕｚｈｏｕ，Ｊｉａｎｇｓｕ ２１５１０１，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｆｏｒ ｅｇｇ ｗｈｉｆｔｅ ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ ｕｓｉｎｇ ｍｕｌｔｉ—ｅｎｚｙｍｅ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｐｒｏｔａｍｅｘ，ｎｅｕｔｒａｓｅ，ａｌｃａｌａｓｅ ａｎｄ ｌｆａｖｏｕｒｚｙｍｅ ｗｅｒｅ ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ ｉｎ ｓｉｍｉｌａｒ ｏｐｔｉｍａｌ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｐＨ ｗｉｔｈ ｔｈｒｅｅ ｅｎｚｙｍｅｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｐｒｏｔａｍｅｘ，ｎｅｕｔｒａｓｅ ａｎｄ ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ；ｓｔａｇｉｎｇ ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｏｐｔｉｍａｌ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｐＨ ｗｉｔｈ ｔｗｏ ｅｎｚｙｍｅｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ａｌｃａｌａｓｅ ａｎｄ ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ）．Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ ｅｇｇ ｗｈｉｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｓｉｎｇ ｐｒｏｔａｍｅｘ，ｎｅｕｔｒａｓｅ ａｎｄ ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ ｗｅｒｅ ６ ｈ，ｐＨ ６．５， ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｔ ａ ｒａｔｉｏ ｏｆ １：１：２，ａｎｄ ｅｇｇ ｗｈｉｔｅ（ ｇ ｗｈｉｔｅ：Ｚｗ№ｒ）ａｔ ａ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ １：５．Ｉｎ ｔｈｉｓ ｃｉｒｃｕｍｓｔａｎｃｅ，ｔｈｅ ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ（ＤＨ）ｗａｓ ５３．２４％，ｔｈｏｓｅ ｈｙｄｒｏｌｙｚａｔｅ ｗｉｔｈ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ３００ ｔｏｏｋ ｕｐ ６８．０６％， ａｎｄ ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｆｒｅｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅａｃｈｅｄ ｔｏ ４４．０２％．Ｂｙ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ，ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ Ａｌｃａｌａｓｅ—Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ ｗｅｒｅ ｅｇｇ ｗｈｉｔｅ ａｔ ａ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ １：５，ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｔ ａ ｒａｔｉｏ ｏｆ １：２，ａｎｄ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｔｉｍｅ ｏｆ ３ ｈ＋３ ｈ．Ｏｎ ｔｈｅｓｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ＤＨ ｒｅａｃｈｅｄ ｔｏ ４５．０５％，ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｌｙｚａｔｅ ｗｉｔｈ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ５００ ｔｏｏｋ ｕｐ ９５．５９％，ａｎｄ ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆｆｒｅｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｗａｓ ３８．０１％． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｅｇｇ；ｐｒｏｔｅａｓｅ；ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ；ｐｒｏｔａｍｅｘ；ｎｅｕｔｒａｓｅ；ａｌｃａｌａｓｅ；ｆｌａＶｏｕｒｚｙｍｅ 鸡蛋蛋清、蛋白中蛋白质含量高达１３％～１５％， 富含多种对人体有益的蛋白质。鸡蛋蛋清、蛋白所 含人体必需氨基酸的种类多，配比平衡性好，是生 物利用效率最高的一类蛋白 ¨。鸡蛋蛋清、蛋白 质的黏度大，热稳定性差，且含有卵类黏蛋白、卵 白蛋白、卵转铁蛋白和溶菌酶等过敏性蛋白，其应 用范围因此而受到 。水解可以降低蛋清、蛋 白的相对分子质量，减小致敏性，生成的多肽混合 收稿日期：２Ｏ１４＿ｏ９ ４ 修回日期：２０１５—０３—０８ 基金项目：江苏省高校优势学科建设工作资助项目（ＰＡＰＤ）；江苏省科技支撑项目（ＢＥ２０１４３１０；ＢＥ２０１３２９３） 作者简介：霍永久（１９７１一），男，江苏东海人，副教授，主要从事猪的营养、生产与环境研究，ｙｊｈｕｏ＠ｙｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ １５０ 湖南农业大学学报（自然科学版）ｈｔｔｐ：／／ｘｂ．ｈｕｎａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ ２０１５年４月 物更有利于人体吸收【３－４］，与原蛋白相比，其水解产 物的黏度、溶解性及起泡性等功能特ｌ生得到了改善， 且具有抗氧化、降血脂、降血压等生理活性［５ 。单 酶水解鸡蛋蛋清、蛋白存在水解度不高、蛋白残留 量高、蛋清肽得率低和易产生苦味肽等缺点，因而， 研究者尝试用多酶水解来解决上述问题［ 剐。由于 单一蛋白酶水解蛋白质具有专一性，所以，蛋白酶 的单一使用使底物中相应的肽键断裂，联合使用则 因为酶作用位点之间产生互补而降低蛋白残留量， 提高水解度，增加蛋清、蛋白肽得率。笔者研究 ｐｒｏｔａｍｅｘ、ｎｅｕｔｒａｓｅ、ｎａＶｏｕｒＺｙｍｅ组合和ａｌｃａｌａｓｅ、 ｌｆａｖｏｕｒｚｙｍｅ组合水解蛋清、蛋白的水解物的性能， 将能降低水解液苦味的端肽酶Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ作为水 解蛋清、蛋白最终加人的酶，以优化多酶同时水解 及分阶段水解的参数，旨在为蛋清、蛋白多酶水解 工艺的优化提供参考依据。 １材料与方法 １．１ 材料 鸡蛋为市售鲜鸡蛋。 商业￣ｐｒｏｔａｍｅｘ、ｎｅｕｔｒａｓｅ ０．８ Ｌ、ａｌｃａｌａｓｅ ２．４ Ｌ ＦＧ和ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ ５００ＭＧ购自诺维信公司。 所用试剂为浓硫酸、硫酸铜、无水硫酸钾、氢 氧化钠、硼酸、盐酸、甲基红一溴甲酚绿指示剂、 甲醛、３０％过氧化氢等。 １．２主要仪器与试剂 主要仪器：ＨＳ－４（Ｂ）型恒温浴槽（成都仪器厂）、 ７２２可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）、 ＫＤＮ一０４Ｂ消化炉（上海新嘉电子有限公司）、 ＫＤＮ－０４Ｂ定氮仪（上海新嘉电子有限公司）、ＳＨＡ－Ｃ 水浴恒温振荡器（常州国华电器有限公司）、５８１０Ｒ 离心机（德国艾本德（ＥｐｐｅｎｄｏｒＯ股份公司）、７９＿２磁 力加热搅拌器（常州国华电器有限公司）、ＰＢ－２１ ｐＨ 计（德国Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ赛多利斯）、Ｗａｔｅｒｓ ６００高效液相 色谱仪（配备２４８７紫外检测器、Ｅｍｐｏｗｅｒ工作站， 美国Ｗａｔｅｒｓ公司）、Ａｇｌｌ００安捷伦液相色谱仪（美国 安捷司）。 １．３方法 １．３．１水解前处理 将新鲜鸡蛋洗净，用７５％的乙醇棉球擦拭蛋 壳，使用漏勺分离蛋清、蛋黄，用灭菌蒸馏水将蛋 清稀释至一定浓度（浓度以Ｖ蛋清：Ｖ水表示），９５℃ 加热变性２０ ｍｉｎ，用ＨＣ１或ＮａＯＨ调节至一定ｐＨ 供水解。 １．３．２水解 在反应温度条件下水浴预热后，加入所需酶， 于恒温水浴振荡器（１２０ ｒ／ｒａｉｎ）中进行水解反应。水 解反应期间用ｐＨ计监测蛋清液的ｐＨ，并通过滴 加ＮａＯＨ溶液来调节ｐＨ，使ｐＨ保持在一定值。 于设置的水解时间收集蛋清、蛋白水解液，置沸水 浴中灭活酶２０ ｍｉｎ，使水解反应终止。水解方式 分为２种： １）将最适温度和ｐＨ相近的蛋白酶（ｐｒｏｔａｍｅｘ、 ｎｅｕｔｒａｓｅ、ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ ３种酶，下文用“Ｐ＋Ｎ＋Ｆ”表 示）同时加入进行水解，水解温度设定为５５℃，酶 总量设定为６％，针对水解时间、ｐＨ、酶比例和蛋 清浓度４个因素进行正交设计。 ２）对于最适温度和ｐＨ相差较大的蛋白酶 ａｌｃａｌａｓｅ和ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍ（下文用“Ａ．Ｆ表示”１，在 ａｌｃａｌａｓｅ的最适温度（５５℃）和最适ｐＨ（７．５）条件下反 应一定时间后，将反应底物溶液调至ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ的 最适温度（５５ ｏｃ）和最适ｐＨ（６．０），再加人ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍ 进行水解。ａｌｃａｌａｓｅ、ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ分阶段水解蛋清、 蛋白的酶总用量设定为６％，针对蛋清浓度、酶比例 和水解时间３个因素进行正交试验。 １．３．３测定指标及方法 １）水解度的测定。总氮含量测定采用凯氏定氮 法，由凯式半自动定氮仪测得【９］。氨基氮含量测定 由甲醛滴定法测得【１们。 水解度＝氨基氮含量／总氮含量。 蛋白残留率＝离心沉淀物的含氮量／总氮含量。 ２）蛋清、蛋白水解物相对分子质量的测定。将 蛋清、蛋白水解物溶液经０．４５ ｍ微孔过滤膜过滤后 上ＴＳＫ ｇｅｌ ２０００色谱柱，以细胞色素Ｃ（ＭＷ １ ２５００）、 抑肽酶（ＭＷ６５００）、杆菌酶（ＭＷ１４５０）、乙氨酸一乙 氨酸一酪氨酸一精氨酸（ＭＷ４５１）和乙氨酸一乙氨酸一 乙氨酸（ＭＷ１８９）为标准品，测定水解物的相对分子 质量。 高效液相色谱条件：色谱柱ＴＳＫ ｇｅｌ ２０００，７．８ ｍｍｘ３００ ｍｍ；柱温３０℃；流速０．５ ｍＬ／ｍｉｎ；检测 第４１卷第２期 霍永久等鸡蛋蛋清和蛋白多酶水解工艺的优化 波长２２０ ｎｍ；流动相乙腈、水、三氟乙酸的体积比 高效液相分析仪测定水解液中的氨基酸组成。 为４５．００：５５．００：０．０ｌ。标准品高效液相色谱图ｆ相 高效液相色谱条件：Ｃ】８柱，４．０ ｍｎ．１ｘ １２５ ｍｍ； 对分子质量流出曲线）和ＧＰＣ校正曲线分别见图１ 柱温４０℃；流速１．０ ｍＬ／ｍｉｎ；检测波长３３８ ａｍ和 和图２。 ２６２ ｎｍ（Ｐｒｏ）；流动相Ａ为２０ ｍｍｏｌ／Ｌ的醋酸钠液，流 。舯 动相Ｂ为２０ ｍｍｏｌ／Ｌ的醋酸钠液和甲醇及乙腈，其体 积比为１：２：２。 ４ ０ Ｉ 游离氨基酸组成分析：将蛋清、蛋白水解液样 。 ｓ ； 品与１０％三氯乙酸溶液等体积混合，在室温下静置２ 。。 ｌ Ｉ害 ｈ，经双层滤纸过滤后，取１ ｍＬ于１．Ｏｘ１０４ｇ离心１０ ｑ … ＿１ｌ 、一 ＼ ．一～ ａｒｉｎ。用在线自动衍生化用Ａｇｉｌｅｎｔ １ １００高效液相分 保留时ｆＢ３／ｍｉｎ 析仪测定水解液（上清液）中氨基酸组成。 图１ 标准品高效液相色谱图 Ｆｉｇ．１ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｏｆ ｓｔａｎｄａｒｄ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ２结果与分析 ２．１ Ｐ＋Ｎ＋Ｆ水解鸡蛋蛋清、蛋白的试验结果 巢， ’ ＋ ２．１．１正交试验结果 ２ ００ 由表１中的极差分析结果可知，在５５℃条件下， 保留时Ｉｈ￣／ｍｉｎ 图２标准品相对分子质量分布的ＧＰＣ校正曲线 水解时间、ｐＨ、酶比例、蛋清浓度对水解反应的影 Ｆｉｇ．２ ＧＰＣ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ 响依次减小。３种酶同时水解鸡蛋蛋清、蛋白的最 优组合为Ａ２Ｂ２Ｃ２Ｄ３，即水解时间为６ ｈ、ｐＨ为６．５、 ３）氨基酸组成分析。总氨基酸组成分析：将蛋 酶比例为１：１：２、蛋清浓度为１：５。在此条件下 的水解度达５３．２４％。 清、蛋白水解液样品溶解在６ ｍｏｌ／Ｌ盐酸中，１１０℃ 水解２４ ｈ，蒸干盐酸，定容得水解液。用Ａｇｉｌｅｎ １ １００ 表１ Ｐ＋Ｎ＋Ｆ水解蛋清、蛋白的正交试验结果 Ｔａｂｌｅ １ Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ ｅｇｇ ｗｈｉｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｓｉｎｇ Ｐ＋Ｎ＋Ｆ １５２ 湖南农业大学学报（自然科学版）ｈｔｔｐ：／／ｘｂ．ｈｕｎａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ ２０１５年４月 ２．１．２水解产物的相对分子质量分布 表２ Ｐ＋Ｎ＋Ｆ水解蛋清、蛋白产物的相对分子质量分布 Ｔａｂｌｅ ２ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｆｒｏｍ ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ 由图３和表２可见，在５５℃条件下，当水解时间 为６ｈ、ｐＨ为６．５、酶比例为１：ｌ：２、蛋清浓度为１： ５时，ｐｒｏｔａｍｅｘ、ｎｅｕｔｒａｓｅ、ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ同时水解水 解物的相对分子质量大部分在５００以下，即水解物 ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｅｇｇ ｗｈｉｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｓｉｎｇ Ｐ＋Ｎ＋Ｆ 主要以短肽的形式存在，其中相对分子质量为 １８０～３００和３００～５００的分别为６８．０６％和１８．６５％。 。６０ ０．４０￣ ・蕊 』＼ ２．１．３产物的总氨基酸组成 ０＿２。｛ ｌ １２ ００ ｌｆ。 客 ／ ｌ ｌ１４ ００ １６ ００ 由表３可见，在２．１．１最优水解条件下，水解物 ｌ、 ２６ ００ ｏ 一… ８ ００ １０ ００ 土 １８ ００ ≈一 — ｌ ｜ ２０ ００ ２２ ００ ２４ ００ 的总游离氨基酸含量为７．４０４ ６ ｒａｇ／ｍＬ，占总氨基 酸含量的４４．０２％，即水解产物中有将近５０％的成分 是以游离氨基酸的形式存在。 酶解时间／ｍｉｎ 图３ Ｐ＋Ｎ＋Ｆ水解蛋清、蛋白产物的高效液相色谱图 Ｆｉｇ．３ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｏｆ ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｅｇｇ ｗｈｉｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｓｉｎｇ Ｐ＋Ｎ＋Ｆ 表３ Ｐ＋Ｎ＋Ｆ蛋清、蛋白水解物和水解前蛋清、蛋白的氨基酸组成 Ｔａｂｌｅ ３ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｅｇｇ ｗｈｉｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｅｇｇ ｗｈｉｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｓｉｎｇ Ｐ＋Ｎ＋Ｆ ２．２ Ａ—Ｆ水解鸡蛋蛋清、蛋白的试验结果 ２．２．１正交试验结果 素依次为酶比例、蛋清浓度、水解时间，最优组合 为Ａ３Ｂ１Ｃ２，即蛋清浓度１：５，酶比例为１：２，水解 时间各为３ ｈ。在此条件下的水解度可达４５．０５％。 由表６极差分析可知，影响水解反应的主次因 第４１卷第２期 霍永久等鸡蛋蛋清和蛋白多酶水解工艺的优化 １５３ 表４ Ａ—Ｆ水解鸡蛋蛋清、蛋白的正交试验结果 Ｔａｂｌｅ ４ Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｓｔａｇｉｎｇ ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｇｇ ｗｈｉｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｓｉｎｇ Ａ－Ｆ ２．２．２ Ａ－Ｆ水解鸡蛋蛋清、蛋白产物的相对分子质 量分布 １ ０００以下，其中≤１８０、＞１８０～３００、＞３００～５００所 占的比例分别为１ １．８９％、６７．６５％、１６．０５％。 表５ Ａ—Ｆ水解鸡蛋蛋清、蛋白产物的相对分子质量 Ｔａｂｌｅ ５ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｆｒｏｍ ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｅｇｇ ｗｈｉｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｓｉｎｇ Ａ—Ｆ水解鸡蛋蛋清、蛋白，在蛋清浓度１：５、 酶比例１：２、水解时间各３ ｈ条件下水解物的相对分 子质量分布曲线如图４所示。 。 ｏ ４０ Ｉｆ 。 。 一 Ｊ８ ＣＯ １０ Ｏ０ １２ Ｏ０ １４ Ｏ０ １６ Ｏ０ 《｝ 容 １８ Ｏ０ ２０Ｏ０ ２２ ０ｏ ２４ Ｏ０ ２６ Ｏ０ 水解时间／ａｉｒｎ 图４ Ａ—Ｆ水解鸡蛋蛋清、蛋白产物的高效液相色谱图 Ｆｉｇ．４ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｏｆ ｓｔａｇｉｎｇ ２．２．３ Ａ－Ｆ水解鸡蛋蛋清、蛋白产物的氨基酸组成 在２．２．１的最优条件下， 水解物的总游离氨基 ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｅｇｇ ｗｈｉｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｓｉｎｇ Ａ—－Ｆ 酸含量为６．８１９ ３ ｍｅｄｎ￣，占总氨基酸含量的３８．０１％， 由表５可知，ａｌｃａｌａｓｅ、ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ分阶段水解 即水解产物中有近４０％的成分是以游离氨基酸的形 式存在。 鸡蛋蛋清、蛋白产物的相对分子质量大部分集中在 表６ Ａ—Ｆ鸡蛋蛋清、蛋白水解物和水解前蛋清、蛋白的氨基酸组成 Ｔａｂｌｅ ６ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｅｇｇ ｗｈｉｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｅｇｇ ｗｈｉｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｓｉｎｇ １５４ 湖南农业大学学报（自然科学版）表６（续） ｈｔｔｐ：／／ｘｂ．ｈｕｎａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ ２０１５年４月 ３结论与讨论 蛋白水解物的苦味主要来自于水解物中的疏 水性多肽【ｌｌＪ。如果用于水解的蛋白酶是非专一性的 溶解性好的蛋白水解产物。吴晖等 ］发现，蛋清水 解专用蛋白酶与碱ｌ生蛋白酶ａｌｃａｌａｓｅ ＡＦ ２．４ Ｌ、碱性 蛋白酶ａｌｃａｌａｓｅ ＡＦ ２．４ Ｌ与胰蛋白酶组合水解鸭蛋蛋 清、蛋白的效果较好，在水解８ ｈ后水解度可达２６．２％ 内切酶，那么它们对蛋白原料的酶切作用是随机 的，无论采用何种水解条件都会或多或少产生游离 氨基酸，且随着水解度的提高，蛋白质内部的疏水 性氨基酸末端大量游离出来，小肽末端的疏水性氨 基酸残基也逐渐暴露，水解产物的苦味越重。呈苦 和２６．６％，明显优于其单酶的水解效果。万丽娜等［１ ｏ］ 发现ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ修饰后的水解液苦味很小，接受度 较高。毛善勇等 ３Ｊ以牛肉为原料，先用ｐｒｏｔａｍｅｘ在 其优化条件下水解６ ｈ，再用ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ在其优化条 件下水解６ ｈ，所得产物的水解度达２４．２６％，比 ｐｒｏｔａｍｅｘ单酶水解牛肉蛋白的水解度提高了 １１．６９％。 味的氨基酸主要有亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、蛋 氨酸、色氨酸、精氨酸、苯丙氨酸。这些疏水性氨 基酸残基在水解液中的比例越高，苦味可能越大。 苦肽也是蛋清、蛋白水解物产生苦味的原因之一。 本试验中，ｐｒｏｔａｍｅｘ、ｎｅｕｔｒａｓｅ、ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ 同时水解鸡蛋蛋清、蛋白的水解度达５３．２４％，比其 控制或消除蛋白水解液苦味的方法包括选择性分 离法、掩盖法、类蛋白反应和酶法处理。酶法水解 过程易于控制，效率高，且条件温和，不会使多肽 的营养成分丢失，不改变多肽的重要特性。肽链端 解酶（端肽酶）是酶法处理中主要的酶类。肽链内切 单独水解的水解度分别提高了４５．８４％、４９．５３％和 １４．４９％；ａｌｃａｌａｓｅ、ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ分阶段水解的水解度 达４５．０５％，比其单独水解的水解度分别提高了 ２６．３２％和６．３％。多酶（分步）水解产物的水解度大幅 度增高，主要是因为ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ氨基肽酶的作用， 可选择性从多肽和蛋白质Ｎ－端水解释放氨基酸，使 酶是酶法处理中的另一种酶类，从肽链的内部将肽 链裂开。ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ兼具内外肽酶的活性，将其用 于水解不仅能产生端肽酶的外切效应，还能产生美 水解液中氨基氮明显上升ｌＪ引。由于不同蛋白酶的作 用位点不同，采用多酶复合水解可产生互补效应， 能进一步提高水解度和肽的得率。笔者发现 拉德反应，生成浓香的风味物质，使水解液的苦味 大大降低。 将ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ和其他蛋白酶联合水解不仅能 促进蛋白质的溶出，提高氮的回收率 ，而且可有 效水解苦味肽，减轻甚至消除苦味，获得苦昧值低、 ｐｒｏｔａｍｅｘ和ｎｅｕｔｒａｓｅ单酶水解的水解度低，ｎｅｕｔｒａｓｅ 单酶水解的蛋白残留率高，将二者同时与蛋清、蛋 白作用能提高水解度，还能改善水解液的风味。 第４１卷第２期 霍永久等鸡蛋蛋清和蛋白多酶水解工艺的优化 ａｌｃａｌａｓｅ是内切酶，用其水解鸡蛋蛋清、蛋白所得的 水解液苦味值较大，在ａｌｃａｌａｓｅ水解一段时间后添加 ｌｆａｖｏｕｒｚｙｍｅ可使苦味值大大降低。Ｃｉｇｉｃ等¨２Ｊ发现 ａｌｃａｌａｓｅ和ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ分阶段水解有效降低了鸡蛋 清水解液的苦味，并提高了水解度。 本试验中，ｐｒｏｔａｍｅｘ、ｎｅｕｔｒａｓｅ、ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ同 时水解鸡蛋蛋清、蛋白产物的相对分子质量分布主 要集中在５００以下，其中相对分子质量＞１８０～３００和 ＞３００～５００所占比例分别为６８．０６％和１８．６５％。 ａｌｃａｌａｓｅ、ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ分阶段水解鸡蛋蛋清、蛋白产 物的相对分子质量主要分布在１ ０００以下，其中＞ １８０～３００和＞３００～５００所占的比例分别为６７．６５％、 １６．０５％。可以看出，多酶水解蛋清、蛋白产物主要 以短肽形式存在。短肽有利于人体吸收，致敏性更 低，还可提供抗氧化、降血压、抗菌、降血脂等生 物’活Ｊ ，有扩大蛋清应用范围的潜力 引。ｐｒｏｔａｍｅｘ、 ｎｅｕｔｒａｓｅ、ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ同时水解产物的总游离氨基酸 含量为７．４０４ ６ ｍｇ／ｍＬ，占总氨基酸含量的４４．０２％； ａｌｃａｌａｓｅ、ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ分阶段水解产物的总游离氨基 酸含量为６．８１９ ３ ｍｇ／ｍＬ，占总氨基酸含量的３８．０１％。 可见，多酶水解产物总氨基酸中，游离氨基酸所占 比例较大，在３种酶同时水解的条件下所占比例约达 ５０％。杨万根等【ｌ ６Ｊ利用单酶ａｌｃａｌａｓｅ ２．４ Ｌ碱性蛋白酶 和ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｎ蛋白酶水解蛋清、蛋白，得到的总游离 氨基酸含量分别为６．４２９、４．１９３ ｍｇ／ｍＬ。本试验中多 酶水解产物的总游离氨基酸含量与此相比均有明显 提高。另外，ｐｒｏｔａｍｅｘ、ｎｅｕｔｒａｓｅ、ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ ３种 酶同时水解物总氨基酸中７种必需氨基酸的含量为 ４３．５６％，Ａｌｃａｌａｓｅ、Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ分阶段水解物总氨基 酸中７种必需氨基酸的含量为４２．６８％，均略高于酶解 前蛋清、蛋白中７种必需氨基酸的含量（４２．４１％）。 通过综合分析，由本试验结果可得到如下结论： １１ ｐｒｏｔａｍｅｘ、ｎｅｕｔｒａｓｅ和ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ同时水解鸡蛋蛋 清、蛋白的优化条件为水解时间为６ ｈ、ｐＨ ６．５、酶 比例为１：１：２、蛋清浓度为１：５，在此条件下水解 ６ ｈ的水解度达５３．２４％，产物中相对分子质量３００以下 的比例达６８．０６％，游离氨基酸比例达４４．０２％。２） ａｌｃａｌａｓｅ和ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ分阶段水解鸡蛋蛋清、蛋白的 优化条件为蛋清浓度１：５、酶比例为１：２、水解时 间各３ ｈ，在此条件下的水解度达４５．０５％。产物相对 分子质量大部分集中在５００以下，≤１８０、＞ｌ８０￣３００ 和＞３００～５００所占的比例分别为ｌ１．８９％、６７．６５％、 １６．０５％，游离氨基酸比例达３８．０１％。 参考文献： ［１］ 周玲，周萍．不同水解条件对蛋清、蛋白液功能性质 的影响［Ｊ］．食品研究与开发，２０１４，３５（２）：１０３—１０６． ［２】刘爽，夏杨毅，尚永彪．鸡蛋蛋清、蛋白水解产物的 研究进展［Ｊ］．食品科学，２０１３，３４（１５）：４０９＿１４ｌ４． ［３］杨瑾，唐传核．鸡蛋蛋清、蛋白水解物的抗氧化性研 究［Ｊ］．现代食品科技，２０１１，２７（１２）：１４４６＿１４５Ｏ． ［４ ４］Ｒａｏ Ｑ ｃ，Ｒｏｃｃａ－Ｓｍｉｔｈ Ｊ Ｒ，Ｌａｂｕｚａ Ｔ Ｐ．Ｓｔｏｒａｇｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｈｅｎ ｅｇｇ ｗｈｉｔｅ ｐｏｗｄｅｒｓ ｉｎ ｔｈｒｅｅ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｗａｔｅｒ ｄｏｕｇｈ ｍｏｄｅｌ ｓｙｓｔｅｍｓ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１３，１３８（２／３）： １０８７－ｌ０９４． ［５］ 周利亘，王君虹，张治国，等．中性蛋白酶水解蛋清、 蛋白的工艺［Ｊ］．浙江农业科学，２０１１（２）：３３５—３３７． ［６】 Ｃｈｅｎ Ｃ，Ｃｈｉ Ｙ Ｊ，Ｘｕ Ｗ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｙｔ ｏｆ ｓｐｒａｙ—ｄｒｉｅｄ ａｎｄ ｆｒｅｅｚｅ—ｄｒｉｅｄ ｅｇｇ ｗｈｉｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１２，５（６）：２３４２－２３５２． ［７】刘晓艳，于纯淼，张妍，等．复合动物蛋白酶水解蛋 清、蛋白最优工艺的研究［Ｊ］．中国调味品，２０１０，３５（６）： ６２－６５． ［８ ８］吴晖，任尧，李晓凤．单酶和双酶分步水解鸭蛋清、 蛋白的工艺［Ｊ］．食品与发酵工业，２０１０，３６（１１）：９３—９７． ［９］ ＧＢ／Ｔ ５００９５－２０１０食品中蛋白质的测定［Ｓ］． 【１Ｏ］万丽娜，熊星星，罗岩，等．风味蛋白酶修饰蛋清水 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