微生物学 实验三 平板菌落计数法

微生物学实验三平板菌落计数法 微生物学实验三平板菌落计数法 实验三平板菌落计数

学习菌种的平板菌落计数的基本原理和方法。

平板菌落计数法就是将试样样品经适度吸收之后，其中的微生物充份集中成单个细胞，挑一定量的吸收样液注射至平板上，经过培育，由每个单细胞生长产卵而构成肉眼可知的菌落，即为一个单菌落应当代表原样品中的一个单细胞。统计数据菌落数，根据其吸收倍数和采样注射量即可折算出来样品中的含菌数。但是，由于试样样品往往难于全然集中成单个细胞，所以，孵出的一个单菌落也可能将源自样品中的2～3或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往相对较低，为了确切地阐释平板菌落计数的结果，现在已女性主义采用菌落形成单位（colony-formingunits,cfu）而不以绝对菌落数去则表示样品的活菌含量。

平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验（如活菌制剂），以及食品、饮料和水（包括水源水）等的含菌指数或污染程度的检测。

1．菌种：大肠杆菌菌悬液。 2．培养基：lb培养基。

3．仪器或其他用具：1ml无菌液体，无菌平皿，器皿4.5ml无菌水的试管，试管架，恒温培养箱等。

取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10、10、10（稀释度）各3套，另

-1-2-3-4-5挑6支盛存有4.5ml无菌水的试管，依次标是10、10、10、10、10、 用1ml无菌吸管吸取1ml已充分混匀的大肠杆菌菌悬液（待测样品），精确地放 -10.5ml至10的试管中，此即为10倍吸收。将多余的菌液送回原菌液中。-6-4-5-6 将10试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混匀。另取一支1ml吸管插入10试管中来回吹吸菌悬液三次，进一步将菌体分散、混匀。吹吸菌液时不要太猛太快，吸时吸管伸入管底，吹时离开液面，以免将吸管中的过滤棉花浸湿或使试管内液体外溢。用此吸 -1-2管汲取10菌液1ml，准确地放0.5ml至10试管中，此即为100倍叶唇柱

释。······其余依次类推。

摆菌液时液体不要遇到液面，即为每一支液体就可以碰触一个吸收度的菌悬液，否则吸收不准确，结果误差很大。

3．倒平板法：1）取样。用三支1ml无菌吸管分别吸取10、10和10的稀释菌悬液各1ml，对号放入编好号的无菌平皿中，每个平皿放0.2ml。不要用1ml吸管每次只靠吸管尖部吸0.2ml稀释菌液放入平皿中，这样容易加大同一稀释度几个重复平板间的操作误差。2）倒平板。尽快向上述盛有不同稀释度菌液的平皿中倒入融化后冷却至45℃左右的lb培养基约15毫升/平皿，置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀，而又不使培养基荡出平皿或溅到平皿盖上。由于细菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培养皿后，应尽快倒入融化并已冷却至45℃左右的培养基，立即摇匀，否则细菌将不易分散或长成的菌落连在一起，影响计数。3）待培养基凝固后，将平板倒置于37℃恒温培养基中培养。

4.涂敷法：涂抹平板计数法与好像平板法基本相同，所相同的就是先将培养基熔融后趁热放入无菌平板中，等待凝结后编号，然后用无菌液体汲取0.1ml菌液对号注射在相同吸收度编号的琼脂平板上（每个编号设立三个重复）。再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹光滑（图22-

3），每个稀释度用一个灭菌刮铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换刮铲。将涂抹好的平板平放于桌上20—30min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，保温培养，至长出菌落后即可计数。

培育48h后，抽出培育平板，算是出来同一吸收度三个平板上的菌落平均数，并按以下公式展开排序：

每毫升中菌落形成单位（cfu）=同一稀释度三次重复的平均菌落数×稀释倍数×5 通常挑选每个平板上生存有30～300个菌落的吸收度排序每毫升的含菌量较为最合适，同一吸收度的三个重复对照的菌落数不该差距非常大，否则则表示试验不准确。实际工作中同一

-4-5稀释度重复三个对照平板不能少于三个，这样便于数据统计，减少误差。由10、10

-6和10三个吸收度排序出来的每毫升菌液中菌落形成单位数也不该相差太大。 平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度是很重要的，一般三个连续稀释度中的第二个稀释度倒平板培养后，所出现的平均菌落数在50个左右为好，否则要适当增加或减少稀释度加以调整。

五、实验结果-4-5-6-1-1

将培养后菌落计数结果填入下表：

（1）为什么融化后的培养基必须加热至45℃左右就可以好像平板？ （2）要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键？为什么？

（3）先行比较平板菌落计数法和显微镜下轻易计数法的优缺点及应用领域。 （4）当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的而是集中在一起时，你认为问题出在哪里？

（5）用好像平板法和涂敷法计数，其平板上生出来的菌落有何相同？为什么必须培育较长时间（48h）后观测结果？