细菌平板计数法

操作步骤

l．编号 取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6。(稀释度)各3套。另取6支盛有4.5mL无菌水的试管，依次标是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。

2．稀释 用lmL无菌吸管吸取lmL已充分混匀的大肠杆菌菌县液(待测样品)，精确地放0.5ml至10-1的试管中，此即为10倍稀释。将多余的菌液放回原菌液中。 将10-1试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混匀。另取一支lml吸管插入10- 1试管中来回吹吸菌悬液三次，进一步将菌体分散、混匀。吹吸菌液时不要太猛太快，吸时吸管伸人管底，吹时离开液面，以免将吸管中的过滤棉花浸湿或使试管内液体外溢。用此吸管吸取10-1菌液lmL，精确地放0.5mL至10-2试管中，此即为100倍稀释。„„其余依次类推。 放菌液时吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接触一个稀释度的菌悬液，否则稀释不精确，结果误差较大。

3.取样 用三支1mL无菌吸管分别吸取10-4、10-5和10-6的稀释菌悬液各lmL，对号放入编好号的无菌平皿中，每个平皿放0.2mL。 不要用lmL吸管每次只靠吸管尖部吸0.2mL稀释菌液放入平皿臼，这样容易加大同一稀释度几个重复平板间的操作误差。

4．倒平板．尽快向上述盛有不同稀释度菌液的平皿中倒入融化后冷却至45℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基约15毫升/平皿，置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀，而又不使培养基荡出平皿或溅到平皿盖上。由于细菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培养皿后，应尽快倒入融化并于已冷却至45℃左右的培养基，立即摇匀，否则细菌将不易分散或长成的菌落连在一起，影响计数。 待培养基凝固后，将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养。

5．计数 培养48h后，取出培养平板，算出同一稀释度三个平板上的菌落平均数，并按下列公式进行计算， 每毫升中菌落形成单位(cfu)=同一稀释度三次重复的平均菌落数×稀释倍数×5。 一般选择每个平板上长有30~300个菌落的稀释度计算每毫升的含菌量较为合适。同一稀释度的三个重复对照的菌落数不应相差很大，否则表示试验不精确。实际工作中同一稀释度重复对照平板不能少于三个，这样便于数据统计，减少误差。

由10-4、10-5、10-6三个稀释度计算出的每毫升菌液中菌落形成单位数也不应相差太大。 平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度是很重要的。一般以三个连续稀释度中的第二个稀释度倒平板培养后所出现的平均菌落数在50个左右为好，否则要适当增加或减少稀释度加以调整。

平板菌落计数法的操作除上述倾注倒平板的方式以外，还可以用涂布平板的方式进行。二者操作基本相同，所不同的是后者先将牛肉膏蛋白胨培养基融化后倒平板，待凝固后编号，并于37℃左右的温箱中烘烤30min，或在超静工作台上适当吹干，然后用无菌吸管吸取稀释好的菌液对号接种于不同稀释度编号的平板上，并尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于实验台上20～30min，使菌液渗入培养基表层内，然后倒置37℃的恒温箱中培养24～48h。 涂布平板用的菌悬液量一般以0.1ml较为适宜，如果过少菌液不易涂布开，过多则在涂布完后或在培养时菌液仍会在平板表面流动，不易形成单菌落。 五、实验报告 1．结果 2．将培养后菌落计数结果填入下表 2．思考题 (1)为什么融化后的培养基要冷却至45℃左右才能倒平板? (2)要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键?为什么? (3)试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点及应用。 (4)当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的而是集中在一起时，你认为问题出在哪里? (5)用倒平板法和涂布法计数，其平板上长出的菌落有何不同?为什么要培养较长时间(48h)后观察结果?

实验一 革兰染色法、细菌的特殊染色法

实验目的：掌握细菌革兰染色的原理与方法； 掌握细菌芽孢染色的基本原理与方法； 熟悉普通光学显微镜的油镜使用与保养方法。 实验材料：菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌

试剂：结晶紫、碘液、95%乙醇、番红花红、孔雀绿

实验内容：

1、 染色过程：涂片（大肠杆菌和金黄色葡萄球菌）→干燥→固定→初染（结晶紫染色1min）→媒染（碘1min）→水洗→95%乙醇脱色（1min）→复染（番红花红染色1min）→干燥→镜检（油镜）

2、 注意事项： （1）菌种应选用对数期的菌种； （2）涂片不易过厚，涂片薄而均匀为好； （3）脱色不足或脱色过度均会造成革兰染色的假阳性或假阴性，脱色时间 取决于涂片厚度、室温等。

实验二、芽孢染色 芽孢是某些细菌在生长发育的后期在细胞内形成的圆形或椭圆型的抗逆性比较强的休眠体，是细菌的一种特殊构造。

染色过程：涂片（枯草芽孢杆菌）→干燥→固定→初染（孔雀绿染色20-30min）→水洗→复染（番红花红染色1min）→干燥→镜检 注意事项： （1）涂片时，生理盐水及取菌不宜过多，涂片应尽可能均匀， （2）水洗步骤水流不宜过大，过急，以免涂片薄膜脱落。 （3）涂片在干燥过程中，不易在火焰远端加热干燥。

显微镜油镜的使用与保养

（1） 在需观察部位的玻片上滴加一滴香柏油，然后慢慢转动油镜，在转 换油镜时，从侧面水平注视镜头与玻片的距离，使镜头浸入油中而又不以压破载玻片为宜。

（2） 用双眼观察目镜，并慢慢转动粗调节器至出现模糊物象，然后用细 调节器至物象清晰为止。

（3） 如果不出现物象或者目标不理想要重找。

（4） 油镜使用完毕，先用擦镜纸沾少许乙醇将镜头上和标本上的香柏油 擦去，然后再用干擦镜纸擦干净。

注意事项：

（1） 持镜时必须是右手握臂、左手托座的姿势，不可单手提取，以免零 件脱落或碰撞到其它地方。

（2）轻拿轻放，不可把显微镜放置在实验台的边缘，以免碰翻落地。 （3）保持显微镜的清洁，光学和照明部分只能用擦镜纸擦拭，切忌口吹 手抹或用布擦，机械部分用布擦拭。

（4） 水滴、酒精或其它药品切勿接触镜头和镜台，如果沾污应立即擦净。 放置玻片标本时要对准通光孔，且不能反放玻片，防止压坏玻片或碰坏物镜。

（5）不要随意取下目镜，以防止尘土落入物镜，也不要任意拆卸各种零件，以防损坏。

（6） 使用完毕后，必须复原才能放回镜箱内，其步骤是：取下标本片， 转动旋转器使镜头离开通光孔，下降镜台，平放反光镜，下降集光器(但不要接触反光镜)、关闭光圈，推片器回位，盖上外罩，放回实验台柜内。

（7） 最后填写使用登记表。(注：反光镜通常应垂直放，但有时因集光器 没提至应有高度，镜台下降时会碰坏光圈，所以这里改为平放)