DNA提取方法

苯酚抽提法:

苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了 DNase 的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与 DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相， 而 DNA 溶于水相。 离心分层后取出水层， 多次重复操作，再合并含 DNA 的水相， 利用核酸不溶于醇的性质， 用乙醇沉淀 DNA 。 此时DNA 是十分粘稠的物质， 可用玻璃漫漫绕成一团， 取出。 此法的特点是使提取的DNA 保持天然状态 .

革兰氏阴性菌， 如 E.coli， 一般有三种可以选择的方法。

一、水煮模板法——主要用于 PCR 反应

1、接种单菌落于 LB 或脑心平板， 连续画线， 37 摄氏度培养 18－ 24 小时。

2、 刮取 1～ 2 接种环菌苔加入 150 微升三蒸水中， 混匀， 100 摄氏度煮沸 10分钟。

3、 12000 转/分钟 离心 10 分钟， 取上清， － 20 摄氏度保存备用。

操作最简便， 对试剂条件要求低。 缺点是纯度不够高， 可能会含有 RNA、 蛋白等杂质。但是作为一般检测目的的PCR 反应模板已经足够了。

有人称扩增4kb 以下片段都可用此种方法制取模版， 编者用此类模板 PCR 可以扩增到3500bp 的片段。 编者建议： 此法得到的模版保存时间短， 强烈建议每月重新制作一次。

二、CTAB/NaCl 法

1、接种一单菌落于 5mlLB 中,30℃培养过夜,

2、 取 1ml 种子培养液接入 100ml2%LB 中,37℃、 220r/min 培养 16 小时;

3、 5000r/min 离心 10 分钟,弃去上清。

4、 加入 10mlTE 离心洗涤后,用 10mlTE 溶解菌体,混匀,-20℃保存备用。

5、 取 3.5ml 菌悬液,加入 184μl10%SDS,混匀,加入 37μl10mg/ml 蛋白酶 K,混匀,37℃温育1 小时

6、 加入 740μl5mol/LNaCl,再加入 512μlCTAB/NaCl,混匀,65℃温育 10 分钟。

7、 加入等体积的氯仿/异戊醇,混匀,10000r/min 离心 5 分钟,保留上清。

8、上清中加入等体积的酚∶ 氯仿∶ 异戊醇(25∶ 24∶ 1),混匀,10000r/min 离心5 分钟,保留上清。

9、 加入 0.6 倍的异丙醇,混匀,10000r/min 离心 5 分钟,收集 DNA 沉淀,用 70%乙醇离心洗涤 DNA 沉淀。

10、 用 1mlTE溶解DNA,加入终浓度为 20μg/mlRNaseA,4℃保存。

CTAB/NaCl 法提取的 DNA 纯度较高， 蛋白杂质较少， 保存时间长， 编者更喜欢把终浓度为20μg/ml RnaseA 加在第 5 步温育的时候， 这样最后没有RnaseA 污染。 每一步操作细致一些， 得到的 DNA 可用于 Southern blot。

（二）、CTAB/NaCl 法

1、接种一单菌落于 5mlLB 中,30℃培养过夜,

2、 取 1ml 种子培养液接入 100ml2%LB 中,37℃、 220r/min 培养 16 小时;

3、 5000r/min 离心 10 分钟,弃去上清。

4、 加入 10mlTE 离心洗涤后,用 10mlTE 溶解菌体,混匀,-20℃保存备用。

5、 取 3.5ml 菌悬液,加入 184μl10%SDS,混匀,加入 37μl10mg/ml 蛋白酶K,混匀,37℃温育 1 小时

6、 加入740μl5mol/LNaCl,再加入 512μlCTAB/NaCl,混匀,65℃温育 10分钟。

7、 加入等体积的氯仿/异戊醇,混匀,10000r/min 离心 5 分钟,保留上清。

8、 上清中加入等体积的酚∶ 氯仿∶ 异戊醇(25∶ 24∶ 1),混匀,10000r/min离心 5 分钟,保留上清。

9、 加入 0.6 倍的异丙醇,混匀,10000r/min 离心 5 分钟,收集 DNA 沉淀,用70%乙醇离心洗涤 DNA 沉淀。

10、 用 1mlTE溶解DNA,加入终浓度为 20μg/mlRNaseA,4℃保存