PCR法快速筛选重组克隆方法的改进

2003年9月

青岛大学医学院学报

ACTAACADEMIAEMEDICINAEQINGDAOUNIVERSITATIS

Vol.39,No.3September　2003

PCR法快速筛选重组克隆方法的改进

毛伟征1,孙道升2,司春祥2,隋爱华3,刘湘萍3,陈　栋1,吕振华3

(1　青岛大学医学院附属医院普外科,山东青岛　266003;　2　青岛海慈医院检验科;　3　青岛大学医学院附属医院分子生物

学中心实验室)

[摘要]　①目的　以PCR法在菌液中快速筛选重组克隆。②方法　提取小鼠巨噬细胞总RNA,反转录PCR(RTα(TNF2α)基因片段,TA克隆连接质粒载体、2PCR)获得肿瘤坏死因子2转化大肠杆菌JM109。在大肠杆菌培养中

的不同时间取样测定大肠杆菌A600值及计数。以不同数量的大肠杆菌为模板进行系列PCR扩增,获得适宜PCR扩增条件的大肠杆菌数。③结果　以菌液为模板进行PCR能够快速筛选重组体,大肠杆菌模板数在125～250个范围内,PCR对阳性克隆的扩增可获得良好结果;获得常规培养条件下转化大肠杆菌的生长曲线,A600值与大肠杆菌计数间存在显著正相关(r=0.93,P<0.001)。④结论　通过测定大肠杆菌培养液A600值推算大肠杆菌数量,以适宜的大肠杆菌模板行PCR法筛选重组克隆,快速准确并方便下游操作。

[关键词]　重组体筛选;聚合酶链反应;克隆,分子;大肠杆菌

[中图分类号]　Q784　　[文献标识码]　A　　[文章编号]　167224488(2003)0320228203AMODIFICATIONOFRAPIDPCRSCREENINGFORRECOMBINANTCLONE　MAOWei2zheng,SUNDao2sheng,SIChun2xiang,etal　(DepartmentofGeneralSurgery,TheAffiliatedHospitalofQingdaoUniversityMedicalCollege,Qingdao266003,China)

[ABSTRACT]　Objective　ToestablisharapidscreeningofrecombinantclonesbyPCR.　Methods　TotalRNAofmousemicrophageswasextracted.TNF2geneswereacquiredbyRT2PCR.JM109,E.colitransformedbyrecombinantplasmidwasinoculated.Ataseriesoftimespots,diluted1LofmediumwasplatedontoLBagarplate.Meanwhile,A600ofmediawasdetectedwithspectrophotometer.Coloniesonagarwerecounted.MediawithdifferentamountofE.coliwereusedasatemplate,aseriesofPCRcarriedout.　Results　PCRscreeningshowedthatanoptimizedresultcouldbeobtainedwithtemplatesofmediawithE.coliamountrangedfrom125-250.ThegrowthcurveoftransformedE.coliwassetup.TherewasasignificantlinearrelationshipbetweencoloniesandA600from4.5to7.0hoursafterinoculation.　Conclusion　TheamountofE.colicanbecalculatedthroughdetectingA600ofthemedia.ItisafastandefficientwaytoscreenrecombinantcloneswithPCR,whichtakesaproperamountofE.coliasitstemplate.

[KEYWORDS]　screening,recombinants;polymerasechainreaction;cloning,molecular;Escherichiacoli

　　外源基因经反转录PCR(RT2PCR)获得理想的PCR产物后,用定向克隆2TA克隆等方法插入载体的多克隆位点,转化大肠杆菌感受态细胞,提取重组质粒后进行限制性酶切分析和DNA测序等重组体分析。该工作颇为繁琐,费时、费力。我们在制备荧光定量PCR阳性模板测定小鼠巨噬细胞肿瘤坏死

α(TNF2α)mRNA的实验中[1],以重组体转化的因子2

大肠杆菌为模板进行了PCR扩增,通过对实验中各个参数的测定和分析,获得了对重组体筛选的快速、简便、准确方法,现介绍如下。1　材料与方法1.1　主要试剂

TRIzol试剂:GibcoBRL,LifeTechnologies公司;

反转录试剂盒:Promaga公司;TaqDNA聚合酶:华美

生物工程公司;RsaⅠ限制性内切酶:Promaga公司;PCR纯化试剂盒:Roche公司;质粒:pGEM2TEASYVECTORSYSTEMⅡ,Promaga公司;大肠杆菌:E.coliJM109,大连宝生物公司。1.2　引物

α(NM-013693)序列资根据GenBank中小鼠TNF2料自行设计引物,上、下游引物分别为:5′2CACAA2GATGGTGGGACAGTGAC23′和5′2GACA2GAGGGAAGCTGACCACTC23′。扩增片段长度149bp。1.3　目的基因

α基因片段,从小鼠巨噬细胞提取总小鼠TNF2

RNA,反转录为cDNA,然后经PCR扩增、回收纯化获得。

[收稿日期]2003203216;　[修订日期]2003204220

[作者简介]毛伟征(19622),男,博士,副主任医师,硕士生导师。

3期毛伟征,孙道升,司春祥,等1PCR法快速筛选重组克隆方法的改进229

α基因连接、1.4　TNF2转化

αcDNA的PCR产物电紫外线灯光下切取TNF2

泳条带,称质量后用QIA凝胶提取试剂盒提纯PCR产物,将纯化的PCR产物经过T4连接酶与pGEM2TEasyVector质粒连接,制备重组质粒。用氯化钙制

片段行RsaⅠ酶切,酶切后获得128bp大小的片段

(见图2)。

备新鲜的大肠杆菌(JM109)感受态细胞并进行质粒的转化[2]。将已转化的感受态细胞转移到含有20mmol/LMgSO4和60mg/L氨苄青霉素的SOB琼脂

α重组质粒的培养基上,37℃16h,出现含有TNF2菌落。

1.5　大肠杆菌PCR筛选重组阳性克隆

α重组质粒菌150mLLB中接种一个含有TNF2

落,37℃300r/min摇床培养。自培养后4.5h起,

每隔5～7min取样100μL,分别稀释2～8万倍取1μL涂LB琼脂平板,至培养后7h,共取样19次,同时对每次取样测A600值。将大肠杆菌培养板置37℃温箱,24h后计数培养板上的大肠杆菌个数,然后通过换算得出1L培养液中含有的大肠杆菌数量。以不同的大肠杆菌数量为模板,在30μL反应体系中加入10×反应缓冲液3μL,25mmol/LMgCl2溶液3.6μ下游L,dNTP3μL,TaqDNA聚合酶0.3μL,上、引物各0.9μL。反应条件:94℃5min;94℃30s,65℃30s,72℃30s,共40个循环;72℃延伸10min。后在20g/L琼脂糖凝胶中电泳。作为模板的

图1　不同数量细菌为模板PCR扩增结果均见目的基因,125～250个细菌的条带较好

大肠杆菌数分别为5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、125、150、175、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、4000、6000、8000、1.0万、1.5

万、2.0万、3.0万、4.0万、4.5万、5.0万、10.0万。1.6　PCR产物的纯化回收及酶切鉴定

PCR产物以纯化试剂盒回收扩增片段,用Rsa

α插入序列Ⅰ(其酶切的位点为:GT′CA,可将TNF2切成128bp和15bp两个片段)在37℃下酶切4h,α片段进行确在20g/L琼脂糖凝胶中电泳,对TNF2认。2　结　　果

2.1　目的基因的PCR筛选

α酶切结果图2　TNF2

α带,Ts(3个相同)为128bpM为PCR标准带;T为149bp的TNF2酶切后条带

2.2　不同培养时间大肠杆菌A600值及数量

以不同数量的大肠杆菌为模板行PCR扩增,

α的149bp片PCR产物电泳图中均显示有符合TNF2

段,但扩增结果与大肠杆菌数量有关,大肠杆菌数量在125～250个范围内时,目的基因片段产量高、特异性好。大肠杆菌数量少,产物量低,判读较困难;大肠杆菌数量多,则非特异性扩增明显,并出现菌体

αRNA污染,而且影响结果判断(图1)。纯化的TNF2

历时2.5h,每5～7min取大肠杆菌培养液,以

培养时间为x轴,以细菌个数为y轴,作图3、4。由图3可以看出常规条件培养下大肠杆菌生长速率有一定规律,即:在取样的第1～7时间点(即细菌培养后4.5～5.5h),大肠杆菌繁殖缓慢,在第7～16时间点(即细菌培养后5.5～6.7h),大肠杆菌呈指数生长,在第16～19时间点(即细菌培养后6.7～7.0h),大肠杆菌繁殖又进入缓慢的平台期。由图

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4可以看出细菌A600值与细菌数量间存在极显著正相关(r=0.93,P<0.001),直线回归方程为:y=56.30×(A600值)-14.48。

筛选,但其质粒有自身环化的可能,经过质粒和酶切分析后可能得到的是不含插入片段的“空质粒”,浪费人力、物力和时间。本项工作建立在大肠杆菌直接PCR扩增和酶切分析等工作的基础上,探索简便快速的重组质粒筛选方法。利用计数大肠杆菌培养早期的对数生长期,较为准确的大肠杆菌计数方法,将不同数量的转化大肠杆菌作为DNA模板进行PCR筛选,由于模板在PCR反应体积中所占比例小,对PCR反应体系几乎无干扰,获得了满意的PCR反应结果,模板为125～250个大肠杆菌的PCR反应体系中,可获得良好的、特异性的反应产物。

重组质粒插入片段经过PCR验证的重组质粒转化大肠杆菌培养物可随即进行大容量培养,重组质粒提取后可直接进入下游工作,节约人力、物力和时间。

本实验显示,细菌培养液A600值与细菌数量间存在着明确的相关性(图4),取样测定A600值后,将数值代入方程式,即可计算出细菌数量,取125～250

图3　转化E.coliJM109生长曲线

图4　各取样点细菌培养液A600值与细菌个数相关关系

3　讨　　论

构建重组质粒转化的大肠杆菌后,直接在α2互

补2插入失活平板上挑取菌落作为模板进行PCR筛选较为省时、省力[3,4]。Sathe等[3]将含有重组质粒大肠杆菌经过94℃变性1min以后,用倒置显微镜观察,发现大部分细胞破裂,释放出DNA,可将其作为PCR的模板,而不需要抽提、纯化质粒DNA。我

α片段时,将含有们在用JM109克隆目的基因TNF2

重组体的大肠杆菌作为模板直接进行PCR扩增,经电泳分析显示,不同数量的大肠杆菌模板均可见到大小一致的149bp阳性条带(图1)。为了验证大肠杆菌PCR的正确性,我们纯化回收了149bp阳性条

α片段带,进行酶切鉴定,结果证实了该条带为TNF2

(图2),表明大肠杆菌PCR用于筛选重组阳性克隆是一种简单、快速、可靠的方法。

转化重组质粒的大肠杆菌虽然可因表达抗生素抗性基因能在氨苄青霉素培养基上生成菌落而初步　　　　　　

个大肠杆菌作模板即可行PCR筛选。

在大肠杆菌培养阶段通过对多个菌落的重组质粒进行筛选,能避免浪费,该方法可行,值得推广应用。此外,JM109是常用工程菌株,常用于重组质粒的转化,本实验通过对JM109培养不同时段的大肠杆菌计数,了解了大肠杆菌的繁殖规律,对制备大肠杆菌感受态细胞时间的掌握,以及制备基因工程产品时,外源基因在JM109中的表达条件提供了有益的参考。

[参考文献]

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[4]生秀杰,周伟强,姜　莉,等.应用以菌落模板的聚合酶链反应技术筛选重组阳性克隆[J].中华检验医学杂志,2002,25:

239.

(本文编辑　马伟平)