量限制了其在实际生产生活中的应用[4-5]。因此，提高BC产量成为迫切需求。最初人们通过单因素实验优化BC的培养条件，但是这种方法不能反映各因素间复杂的相互作用，且对BC产量的提高并不显著，因此寻找一种合适的优化方法来弥补单因素实验带来的缺点显得尤为重要[6]。响应面法最初是由Box和他的基金项目：天津市科技特派员项目（18JCTPJC55400）；天津市大学生创新创业训练计划资助项目（201910058052）E-mail：*********************通信作者：贺晓凌（1971—），女，博士，副教授，主要研究方向为微生物法污水处理和环境功能材料开发与利用。第3期贺晓凌，等：响应面法优化产细菌纤维素菌发酵条件-55-同事在20世纪50年代开发出的实验设计方法。经过数十年的发展和改进，响应面法已逐渐广泛应用于食品技术，机械加工和工业参数优化等诸多领域[7-8]。相比于单因素法，响应面法具有以下优点：淤实验次数更少，结果更精确；于通过曲面图和等高线图可以更直观地分析交互因素对响应值的影响；盂实际优化结果与理论优化结果基本相符[9-11]。本文中，以本实验室所筛选纤维素生产菌K.rhaeticusTJPU03为研究对象，利用响应面法分步优化培养基组分与外部条件，以实现BC产量的最大化。1材料和方法1.1菌株与培养基组成所用菌株是本实验室从腐烂水果中筛选的K.rhaeticusTJPU03。实验中用到的培养基及其配方如下，种子培养基（液体）：葡萄糖2%、蛋白胨0.5%、磷酸氢二钾0.1%、硫酸镁1.5%；发酵培养基（液体）：葡萄糖2%，蛋白胨0.5%，酵母粉0.5%，柠檬酸0.115%，磷酸氢二钠0.4%。所有培养基在接种前需使用高压灭菌锅在121益和0.12MPa条件下灭菌30min，接种操作在超净台中进行。1.2BC的生产和纯化首先，从4益冰箱中取出保存有K.rhaeticusTJPU03的固体分离培养基，将K.rhaeticusTJPU03接种于灭菌后的种子培养基，摇床（温度30益，转速120r/min）培养24h后，使用移液枪移取种子培养基中菌液并接种于发酵培养基，接种完成后，将发酵培养基置于恒温培养箱。静态条件培养14d后，从发酵培养基中取出BC膜，将其置于0.5mol/LNaOH溶液80益水浴加热6h，再用蒸馏水洗涤至pH为中性，以除去BC内残留的细菌和杂质，纯化后的BC膜呈乳白色凝胶状[12]。最后将BC膜置于60益烘箱干燥至恒重，使用分析天平称重，1.3Box-Behnken记录BC产量。实验根据Box-Behnken（BBD）原理设计实验，每个因子被设置为高、中、低3个水平（1，0，-1），各个因子变量选择范围如表1.4数据处理1所示。通过Designexpect8.0将BC产量和各因子之间的关系拟合为二次多项式。利用方差分析和显著性分析证明优化模型的可靠性。三维曲面图和等高线图分析各种因素间的交互作用。Designexpect8.0计算得出的理论最优最后，将实际BCBC产量进行产量与表1发酵培养基及外部条件各因素水平Tab.1Eightfactorsoffermentationmediumcompositionsandexternalconditionswiththreelevels优化内容因素水平发酵培养基/%葡萄糖/%1.50-12.5003.501酵母粉/%0.400.550.70蛋白胨/%0.400.550.70柠檬酸/%0.090.110.14磷酸氢二钠/%0.300.450.60外部条件温度/益262932初始pH369接种量/mL58.512对比，验证优化结果的准确性。2结果和讨论2.1发酵培养基优化由软件Designexpect8.0设计得到表2和表3。按照表2和表3中设置条件分步进行实验，首先优化发酵培养基组分，然后在最优培养基条件下，优化外部条件。为了确保数据的可靠性，每个实验重复3次并取平均值。按照表2进行46组实验（外部条件均设为0水平值：温度29益，pH值6，接种量8.5mL），可得未优化前ExpertBC实际平均产量为组分间的二次多项式：8.0拟合实验数据，得2.549BC产量与发酵培养基各6g/L，通过DesignY=0.1052.55-0.165X1+0.102X2-0.0014X3-0.064X0.311X4-40.895+0.693X5X-1X0.4495-0.346X1X2X+2X0.1113-X1X31X+0.219X0.310X2X4X5+32+-0.0820.0830.34XXX2X54X542+++0.8640.0680.622X5XX3X43X212+0.01+X22+（1）式中：Y代表响应值（BC产量）；X别代表葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、柠檬酸和磷酸氢二钠1、X2、X3、X4和X5分在发酵培养基中的含量（质量分数）。根据统计学原理，p<0.05表明模型项显著性高，由表3显著性测试结果可知，线性项X5和二次项XX1X5，3X4、X52显著性较高。去除不显著项后，将模型简化为：Y=0.8952.738X-0.165X15+0.693X1-X450.001所示。+0.6224XX33-X0.1054+0.793X4-X52（2）方差分析结果如表由表4可知，模型p值为0.0005表示模型显著性.com.cn. All Rights Reserved.-56-天津工业大学学报第39卷表2发酵培养基BBD实验优化模型及实验数据Tab.2Matrixanddataoffermentationmediumcompositionsbasedonbox-behnkendesign实验组X1：葡XX萄糖2：酵X母粉3：蛋白胨4：柠X檬酸氢二钠5：磷酸BC（g·产量L-1）/1-1-120-1
04.2902.2754300040001-1002.574050-1002.28612.67736010-10870-11100800-13.8043.69133.00461091-1
0011010-1100002.89362.381312001300-1
0-10-114.58923.202814101500-10002.460416010002.79971.95971701018000-101002.65481900102.170320-1
11000010102.2655-10003.00132221100230-1
0
-102.45122.9268240-1
13.37602500013.186726000002.107627-1000103.389828101003.4306290300-100-11112.52810-103.0221310005.3649332-101033-1000-115.6453.40023400011.99083500036100-11003.2240-10
03.85303700-103.553138-10039010-10-115.100303.0733400-1-1
003.364341-10002.108642-1002.229443000002.276644110002.40864500046-11-101000012.1818-10012.043310002.62902.79363高，相关系数R2值为0.7680表明回归方程拟合程度较高。AP（adeqprecision）为信噪比，反映外部干扰对实验模型的影响程度，AP值为8.232（>4）表明模型受干表3发酵培养基模型显著性检验Tab.3Coefficientsofregressionmodelandsignificancetestoffermentationmediumcompositions项目系数自由度标准差F值p值常数项2.55010.233--XX1-0.16510.1430X2-0.0010.1024
01.330.520X3110.14300.2590.47910.9925X4-0.10510.1430.4672X5-0.89510.1439.78伊10-50<0.0002
X1X2-0.44910.14339.370.5400.1281X1XX310.285000.70026X140.11110.28502.480X1X50.06410.28500.1500.05105.9000.0220.8236
X2X3-0.3460.69310.2850.23673X2XX4-0.311
10.2850X2510.28501.4701.1800.082
00.7770.2869X3X40.0820.62210.2850.0393X3XX5-0.3400.21910.28500.4501X4510.28504.7400.245612X0.06810.28500.590.7281X220.01010.19301.4200.1200.957632X0.31010.1932.86伊100-30.121842X0.0830.86410.19300.67115210.1930.19302.58019.990.18000.00081表4发酵培养基优化模型方差分析Tab.4Varianceanalysisoffermentationmediumcompositions来源平方和自由度均方F值p值模型26.940201.34754.140.0005残差08.145250.3258--失拟项07.401200.37012.490.1584纯误差00.744050.1488--总误差35.094
45
-
-
-
R2=0.7680CV=18.96%AP=8.232扰程度较小。变异系数CV为18.96%，说明模型离散程度小[13-15]。图1为发酵培养基组分优化模型正态残差图。由图1可知，正态残差图可观测模型残差与随机误差相互偏离程度，偏离程度越明显，则模型可信度越低[16-17]。残差数据点基本呈直线趋势，残差满足正态分布条件，说明优化模型可信度较高。利用三维曲面图和等高线图，可更直观地分析各因素间的交互作用。F值越高交互作用越明显[18-19]。根据表4.744显著性检验表，选择X1X（）X3X（响。图）两组分析其交互作用对2为发醇培养基组成对K.BCrhaeticus5F=5.9，4F=产量的影响。TJPU03图的影2（a）.com.cn. All Rights Reserved.第3期贺晓凌，等：响应面法优化产细菌纤维素菌发酵条件-57-99
90
705030101
3.6708g/L降低为2.2170g/L。这可能是浓度过量的柠檬酸抑制了K.rhaeticusTJPU03活性进而导致BC产量降低。而当保持柠檬酸质量分数为0.14%，将蛋白胨质量分数从0.4%增加到0.7%时，可以观察到BC的产量又从2.2170g/L恢复至3.4573g/L。这表明蛋白胨-3.00-2.00-1.000.00
1.00
2.00
3.00
内标残差图1Fig.1发酵培养基组分优化模型正态残差图Normalplotofresidualsforfermentationmediumcompositions等高线图中，颜色由蓝至红代表响应值逐渐增加，当葡萄糖和磷酸氢二钠质量分数分别为1.5%和0.3%时，BC产量为5.2346g/L，可以推断在较低浓度的葡萄糖和磷酸氢二钠组合下BC有着较高的产量。保持磷酸氢二钠质量分数为0.3%，将葡萄糖质量分数从1.5%提的增加消除了过量柠檬酸对K.rhaeticusTJPU03生长的不利影响。综上可得，发酵培养基不仅为K.rhaeticusTJPU03提供了生长所需营养物质，而且其各组分间复杂的交互作用也对稳定K.rhaeticusTJPU03的代谢水平和提高BC产量起到了一定的作用。利用DesignExpert8.0进一步计算得出最优的发酵培养基配方：葡萄糖1.58%，酵母粉0.66%，蛋白胨0.42%，柠檬酸0.12%，磷酸氢二钠0.3%。按照最优发酵培养基配方进行实验，理论BC产量可达6.0630g/L。2.2外部条件优化外部条件BBD实验优化模型及实验数据如表5高至3.5%，这BC产量从5.2346g/L下降到3.5185g/L。可能是由于过量的葡萄糖经K.rhaeticusTJPU03代谢产生大量葡萄糖酸，代谢产物增多并降低了BC的产量[11]。从图2（b）可知，固定蛋白胨质量分数为0.4%，将.com.cn. All Rights Reserved.BC的产量从柠檬酸质量分数由0.09%增加至0.14%，0.600.520.450.370.30
1.50
Prediction6345.23457Prediction2.05749所示。在上述最优发酵培养基组分的基础上，按照表5进行17组BC生产实验，进一步研究温度，初始pH和接种量3个外部条件对BC产量的影响。利用软件将响应值（y）和外部因素（x1为温度，x2为初始pH，x3为3.114343.51854BC产量（/gL-1）·Prediction3.114342.05749Prediction3.518540.60
3.50
654321
5.234572.00
X1：葡萄糖/%2.503.00
0.520.450.370.301.50
2.00
2.503.00
3.50
（a）葡萄糖和磷酸氢二纳0.140.130.110.100.09
0.4032.8Prediction2.217032.4BC产量（/gL-1）·Prediction3.45732.832.217033.45734.02.424932.662.63.5
3.870773.0
2.5
Prediction3.63.22.0
0.13
0.110.550.63
0.70
3.67077Prediction2.424930.14
0.70
0.48
X3：蛋白胨/%0.550.63
0.100.090.40
0.48
（b）蛋白胨和柠檬酸图2Fig.2发酵培养基组成对BC产量的影响EffectoffermentationmediumcompositionsonBCproduction-58-天津工业大学学报第39卷表5外部条件BBD实验优化模型及实验数据Tab.5Matrixanddataofexternalconditionsbasedonbox-behnkendesign实验组x1：x2：初始-1pHx3：接种量1-1温度BC产量2-1
005.758（/g·L-1）3005.491645014.83472.2891110-111601.9406870-11803.9205.2349
1090106.214711-10013.783312106.0016130105.94361400005.48842151161-1-10-10-117-10000-1
5.4961.8824.3673402.74316.07338接种量）间的关系拟合为二次多项式：y=0.6675.8420.173x-1.107x1x1x222--1.4070.421-x3x210.651x3+0.031x2+0.262x2x3-x31.498-x12+（3）外部条件优化模型显著性检验结果如表6所示。表6外部条件优化模型显著性检验Tab.6Coefficientsoftheregressionmodelandsignificancetestofexternalconditions项系数自由度标准差F值p值常数项5.84212.46--xx1-1.107132.51x2-0.65111.9411.250x311.9401.83000.0000.012721xxx2-0.6670.26211.94x13-0.42112.752.75000.013
0.0450.2185
x2x305.912.35000.16940.9133x12-1.4980.03112.7522x1031.340.42000.000232-1.4070.17312.6812.682.6827.6200.53880.00132由表6可知，大部分项如x（p<0.05）。1、x这表明二次方程具有2、x1x2、x12和x32，均具有较高的显著性足够的代表性来反映BC产量与3个外部因素间的关系。表7为外部条件优化模型的方差分析结果。由表7可知，p值为0.0014，表明模型的显著性较高。相关系数R2值为0.9431接近于1，表明模型相关性高。变异系数CV值为12.05%，反映模型离散程表7外部条件优化模型方差分析Tab.7Varianceanalysisofexternalconditions来源平方和自由度均方F值p值模型35.016093.89112.900.0014残差02.112070.302--失拟项01.661030.55404.920.0790纯误差00.451040.113--总误差37.128
16
-
--
R2=0.9431CV=12.05%AP=9.900度较小。信噪比AP值为9.9（>4）表明模型受外部因素干扰较小。图3为正态残差图。由图3可见，数据点呈直线分布，说明实验误差范围合理，模型可信度高。99
90
705030101
-3.00-2.00-1.000.001.002.003.00
内标残差图3外部条件优化模型正态残差图Fig.3Normalplotofresidualsforexternalconditions由表6显著性检验表，根据F值大小选择交互作用最高的2组（x1x3，x2x3），并分析其对BC产量的影响。等高线图与三维曲面图如图4所示。5图4（ag/LmL升至9）mL所示，时，BC保持初始产量从5.028pH值为63，将接种量从从TJPU036.664。但是，4g/L当接种量继续升高至g/L增加到降至5.4916g/L。12这mL表明时，K.BCrhaeticus的产量6.6644TJPU03的最适接种量为图可以观察到，生长速度最快，当初始pH有利于9mL左右，此时K.rhaeticus值由BC3升至生产。从三维曲面9时，BC产量整体呈下降趋势。这是由于K.rhaeticusTJPU03属于醋酸菌属，在酸性条件下更有利于其生长[20]。如图4（b）等高线图所示，8~10当温度和接种量分别设置为接种量为mL范围时，9mL时，BCBC产量最高。产量高达例如，6.073当温度为27~296g/L。当温度和28益益和，接种量超出或低于此范围，BC产量开始下降。排除其他交互作用和因素影响，根据等高线中红色区域大小和形状，10expectmL时，推测温度和接种量范围分别为BC产量可达到最大值。最后，通过27~29益和8~pH当温度为28.52益Design，初始产量为值为8.06.7143.0模拟，接种量为BC生产实验，6g/L。8.87mL时，BC的理论最大.com.cn. All Rights Reserved.第3期12.0011.0010.009.008.007.006.005.00
3.00
Prediction5.02864贺晓凌，等：响应面法优化产细菌纤维素菌发酵条件·BC产量（/gL-1）Prediction5.49156Prediction4.251065.49158-59-4.251066.664425.02864Prediction6.6644265576543213.66402Prediction3.664024.005.00
x2：初始pH
6.007.008.009.00
（a）初始pH和接种量12.0011.0010.009.008.007.006.005.00
26.00
Prediction5Prediction4.72786BC产量（/gL-1）·Prediction1.6717434.7278663.36116Prediction95%ClLow95%ClHigh95%ClLow95%ClHighSEMeanSEPredX1X26.073625.502046.64524.654677.492570.2417230.60007528.009.0047654321
6.073621.671743.361161.988493.50
Prediction31.9884927.0028.00
温度/益x1：29.0030.0031.0032.00
（b）温度和接种量.com.cn. All Rights Reserved.图4外部条件对BC产量的影响Fig.4EffectofexternalconditionsonBCproduction2.3验证优化结果为了验证响应面法优化结果的可靠性和精确性，按照优化方案，在最优发酵培养基组分和外部条件下进行3次BC生产实验，与BC平均产量为6.7432g/L，软件模拟出的理论最高BC产量6.7146g/L基本一致，说明软件优化结果可信度高。并且K.rhaeticusTJPU03在最优发酵条件下BC产量比未优化前的2.5496g/L提高164.48%。化前提高164.48%。此种方法也可应用于工业化生产通过提高BC的产量，推广其在材料、生物、医疗、BC，良品等领域的应用，以产生更大的经济效益。参考文献：[1]cterialcelluloseasprecursorofcarbonandcompositeswith447-467.FORESTIML，V魣ZQUEZA，BOURYB.Applicationsofba-metaloxide，metalsulfideandmetalnanoparticles：Areview[2][3]DOURADOF，GAMAM，RODRIGUESAC.Areviewonthe3结论ofrecentadvances[J].CarbohydratePolymers，2017，157：toxicologyanddieteticroleofbacterialcellulose[J].ToxicologyReports，2017，4：543-553.Bacterialcelluloseinbiomedicalapplications：Areview[J].In原97-106.ULLAHH，SANTOSHA，KHANT.ApplicationsofbacterialWONGKH，LIGQ，LIKM，etal.OptimisationofpuerariaPICHETHGF，PIRICHCL，SIERAKOWSKIMR，etal.本文采用响应面法设计了K.rhaeticusTJPU03培养优化实验，方差分析和显著性分析表明优化模型拟合程度高，具有良好显著性。通过三维曲面图和等高线图分析各因素间交互作用对BC产量的影响，这些交互作用对维持K.rhaeticusTJPU03正常生长和代谢水平有着显著的作用。根据响应面法获得的优化方案，K.rhaeticusTJPU03在培养温度为28.52益、初始pH值为3.0、接种量为8.87mL的优化发酵培养基（葡萄糖酵母粉0.66%，蛋白胨0.42%，柠檬酸0.12%，磷1.58%，酸氢二钠0.3%）中，实际BC产量可达6.7432g/L，与软件预测值基本一致。优化效果显著，BC产量比未优ternationalJournalofBiologicalMacromolecules，2017，104：[4][5]celluloseinfood，cosmeticsanddrugdelivery[J].Cellulose，（4）：2016，232291-2314.isoflavonoidsbyresponsesurfacemethodologyusingultrason原ic-assistedextraction[J].FoodChemistry，2017，231：231-237.-60-天津工业大学学报第39卷[6]beamTORABIA，KOLAHANF.OptimizingpulsedNd：YAGlasertensileweldingmethodologystrengthprocessandforsimulatedthinparametersAISI316LsheettoattainusingmaximumresponseultimatesurfaceLaserMOHITETechnologyBV，KAMALJA，2018，103annealingK：K300-310.algorithm[J].Optics&[7]mization，PATILSV.Statisticalopti原productionofculturePANESAR，2012byGluconoacetobacterconditionsforenhancedPS，，CHAVAN19（5）：1655-1666.hanseniibacterialNCIMcellulose2529[J].[8]Cellulosetionofmicrobialcellulose：ResponseY，CHOPRAsurfaceHK，etal.Produc原[9]proach[J].BILGIE，CarbohydrateBAYIRE，SENDEMIR-URKMEZPolymers，2012，87（1methodology）A：，930-934.ap原mizationetal.Opti原xylinus[10]ofFANBiologicalusingofbacterialcelluloseproductionbyGluconacetobacterMacromoleculescarobandharicot，2016bean，90[J].：International2-10.JournalcelluloseX，GAOmaceusingfromYKomagataeibacterbeverage，HEWindustrialY，etal.Productionofnanobacterialmers，2016，151：1068-1072.xylinuswaste[J].ofCarbohydratecitruspeelandPoly原po原[11]tionPARMARpomaceof茁using-cyclodextrinI，SHARMAresponsesurface-basedS，RUPASINGHEmethodology[J].flavonolextractionHPV.fromOptimiza原apple[12]Science魻ZDIKICIERLERandTechnology，2015，52（4）2202-2210.ESENO，YEMI覶IOG：JournalofFood姚LUF，SAYGING譈M譈KcidylolivepomaceesterA.Effectsformationofprocessduringparameterssteamdistillationon3-MCPDofoliveandoilgly原-and2016，242（5）oil[J].：805-813.EuropeanFoodResearchandTechnology，[13]KRUSONGSW，KERDPIBOONS，PORNPUKDEEWATTANAbacterial，etal.Luffaogy，2016cellulosesponge，production[J].offsetsthenegativeJournalofeffectsAppliedofaerationMicrobiol原on[14]YADAVAM121，（SURESH6）：1665-1672.agglomerationusingresponseN.Statisticalsurfacemethodologyoptimization[J].ofcoal-oiltionalJournalofCoalPreparationandUtilization，2018Interna原，38[15]（陈海超，4）：192-206.王延斌，熊强.醋酸菌发酵产细菌纤维素培养基和培养条件的优化[J].食品工业科技，2018，39（3）：117-121CHEN，126.tationHC，WANGYB，XIONGcellulosemediumofGluconacetobacterandcultureconditionsQ.Optimizationhensenniiofstrain[J].producingoffermen原Sciencebacterialand[16]（TechnologyCAMPANOinChinese）ofC.FoodIndustry，2018，39（3）：117-121，126，BALEAA，BLANCOA，etal.Enhancementof[17]严峰，Athereview[J].fermentation杨博然，Celluloseprocess刘耀龙，，2016and等，properties.响应面法优化单氮杂苯并23（1）：57-91.ofbacterialcellulose：冠-5接枝聚砜[J].天津工业大学学报，2017，36（6）：54-59.15-YANtionF，YANGBR，LIUYL，etal.Experimentaloptimiza原polymersofpolysulfone[18]jinSTUMPFPolytechnicbyresponse-graft-monoazabenzo-15-crown-5etherTR，UniversitysurfaceYANGXY，，2017methodology[J].ZHANG，36（J6）C：，54-59Journaletal.（IninsituChineseofTian原and）ex.situsuemodificationsengineeringofbacterialcelluloseforapplicationsintis原[19]2018，82：372-383.[J].MaterialsScienceandEngineering：C，varianceSHABANA，SHALABYMA.Modelingandoptimizingofmethodologyamplification[J].Computersinsupply&IndustrialchainusingEngineeringresponse，surface120：392-400.2018，[20]李艳，发酵培养基优化张俊娜，李志西，[J].西北农业学报，等.利用菠萝酒合成细菌纤维素的LIY，ZHANGJN，LIZX，etal.Optimization2013，22（of7）fermentation：84-89.medium[J].ActaforAgriculturaebacterialcellulosesynthesizedfrompineapplewine（7）：84-89（inChineseBoreali-Occidentalis）.Sinica，2013，22本文引文格式：贺晓凌，张先楠，孟红艳，等.响应面法优化产细菌纤维素HE菌发酵条件XL，ZHANG[J].天津工业大学学报，XN，MENGHY，et2020，39（3）：54-60.mentationtionconditionsforenhancedbacterialal.Optimizationcelluloseproduc原offer原Universitybyusing，2020response，39（3surface）：54-60method（inChinese[J].Journal）.ofTiangong.com.cn. All Rights Reserved.
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