原肌球蛋白在增生性瘢痕中的表达与作用研究

WestChinaMedicalJournal，Vol．25，No．7July．201025（7）华西医学2010，

烧伤整形疾病研究

原肌球蛋白在增生性瘢痕中的表达与作用研究

111112

李晨阳，马兵，许雪峰，易绍萱，彭阳，孙榆

【摘要】目的原肌球蛋白是肌球蛋白主要相关蛋白之一，在细胞骨架与运动中起着重要的作用。探讨原肌球

2008年7月48例患者不同收集2006年3月-

有助于揭示瘢痕挛缩的产生机制。方法蛋白在增生性瘢痕中的作用，

——原肌球蛋白基因特异片段，时期增生与非增生瘢痕组织标本，利用基因芯片筛选出的瘢痕相关基因—制备成寡核苷酸探针与瘢痕组织切片进行原位杂交。同时，将各标本进行原代细胞培养，制备成纤维细胞爬片，进行原位杂交。结果

6个月的增生性瘢痕中表达均明显强于9、12个月增生性瘢痕及非增生性瘢痕，原肌球蛋白基因在3、阳性细

瘢痕增生挛缩与细胞骨架运动的相关基因存在密切关

12个月增生性瘢痕及非增生性瘢痕。结论胞比例也高于9、

系，而原肌球蛋白可能在其中起着重要作用。

【关键词】增生性瘢痕；细胞骨架基因；原肌球蛋白【中图分类号】R619．6

【文献标志码】A

LIChen-yang1，MABing1，XUXue-feng1，YI

EffectofTropomyosinExpressiononContractionofHypertrophicScar

Shao-xuan1，PENGYang1，SUNYu2．1．DepartmentofBurnInjuryandPlasticSurgery，theFirstAffiliatedHospital，ChengduMedicalCollege，Chengdu，Sichuan610500，P．R．China；2．DepartmentofHistologyandEmbryology，theThirdMedicalUniversity，Chongqing400038．P．R．China

E-mail：dmabing@hotmail．comCorrespondingauthor：MABing，【Abstract】ObjectiveMethods

Tropomyosinisoneoftheproteinsofcytoskeletonandcellmovement．Theaimofthisstudyis

toinvestigatetheeffectofgeneexpressionoffibroblasttropomyosinontheformationandcontractionofhypertrophicscar．

Accordingtotheresultsofdifferentlyexpressedgenes，inhypertrophicscarbygenemicroarray，topomyosin，oneof

themostimportantgenes，wasselectedandmadeintooligonucleotideprobe．Twenty-fourhypertrophicscarsand24non-hypertrophicscarsand12normalskinswereusedandthesescarweretakenon3，6，9，and12monthsafterburnedbetweenMarch2006andJuly2008．Frozensectionandculturedfibroblastsweremadetodetecttheexpressionofthegenebyinsituhybridization．Results

Expressionoftropomyosinwasdefectedinscartissue，butthoseinthehypertrophicscaron3and6

Overexpressionofcytoskeletalrelativegenescausesthecontractionofscarandtropomyosin

monthsafterburnweresignificantlystrongerthanthoseinthehypertrophicscaron9and12monthsafterburnandnon-hypertrophicscar．Conclusionactsleadingandkeyfunctions．

【Keywords】Hypertrophicscar；Cytoskeletalgene；Tropomyosin

创面修复过度导致瘢痕增生与挛缩，破坏人体体

表形态或内脏位置的均衡性，并引起不同程度的功能障碍，严重影响患者的生命质量。然而，增生性瘢痕形成的分子生物学机制仍未被人们所深入了解，但与机

［1］体内环境改变等因素引起基因的异常表达相关。我们利用基因芯片技术，对烧伤后早期的增生性瘢痕

关、细胞骨架与运动、原癌基因与抑原癌基因、细胞信

［2］

号等多种基因均参与增生性瘢痕的发生。在此基

2008础上，我们利用原位杂交技术，收集2006年3月-年7月的烧伤瘢痕患者，系统动态地研究细胞骨架与

运动相关基因Tropomyosin表达变化与瘢痕组织增生收缩之间的相互关系，以深入了解该基因在增生性瘢痕发生中的作用。11．1

材料与方法

相关基因表达变化进行观察，发现细胞凋亡、免疫相

【基金项目】国家自然科学基金资助项目（30571922）

【作者单位】1成都医学院第一附属医院烧伤整形外科（成都，610500）；2第三军医大学组织胚胎学教研室

【作者简介】李晨阳（1982－），E-mail：男，四川成都人，医师，硕士，mrtianpinlee@yahoo．com．cn

【通讯作者】马兵，E-mail：dmabing@hotmail．com标本采集

烧伤瘢痕患者标本48例，男女不限，年龄2～57岁。增生性瘢痕24例，非增生性瘢痕24例；按伤后3、6、9、12个月不同时间对增生性瘢痕标本进行分组质编号。增生性瘢痕纳入标准为：早期外观发红充血、

25（7）华西医学2010，WestChinaMedicalJournal，Vol．25，No．7July．2010

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硬、突出皮肤1cm以上，有典型的挛缩症状。非增生

性瘢痕的纳入标准为：突出皮肤不超过0．3cm，无收缩。另设正常皮肤对照12例。标本均在整形手术中

并立即放入液氮保存。标本获取均在手术前征切取，得患者同意。1．2主要试剂

原位杂交试剂盒购自武汉博士德公司Tropomyosin寡核苷酸探针特异性片段序列为：5'-CTTCCAGGTCACCACATTTTAGTTCAGACA-3'，5'-TGTCCTCCTTTTCAGAATACTTTTCAGATG-3'，5'-CGTTTAGTGTCTGATCCAGTGTCTGATGTA-3'。1．3

瘢痕组织切片原位杂交

操作按试剂盒说明书进行。冰冻切片厚度为

15μm。经4%多聚甲醛固定后，用新鲜配置的0．5%H2O2灭火内源性过氧化物酶，胃蛋白酶消化暴露mRNA核酸片段。预杂交液处理后，与寡核苷酸探针42℃杂交、过夜。依次滴加封闭液、碱性磷酸酶标记的生物素化过氧化物酶。BCIP/NBT试剂地高辛抗体、

USA）显色。梯度乙醇脱水，盒（Roche，透明、中性树脂镜检。以胞浆内出现明显的紫蓝色细颗粒为阳封片，

性细胞。1．4

瘢痕成纤维细胞原位杂交

取瘢痕与正常皮肤组织。剪去皮下及血液污染组

37℃、5%CO2培养至长出纤维细的DEME培养液，

胞。取5～10代细胞进行研究。将经处理的盖玻片置于直径35mm培养皿内，滴加消化的成纤维细胞悬

4%多聚继续培养至细胞90%融合。取出盖玻片，液，

按上述原位杂交方法进行实验。甲醛固定45min，

1．5统计学方法

对切片通过显微观察并照相，采用MDIOImageAnalyzer软件对图像进行分析，并用SPSS10．0软件包对结果进行方差分析。P值＜0．05为有统计学意义。22．1

结果

原肌球蛋白mRNA在烧伤后增生性瘢痕及正常

皮肤组织中的分布及特点

原肌球蛋白原位杂交阳性细胞着紫蓝色。在增生性瘢痕组织中，可见胶原纤维束间散在岛状分布的包浆呈紫蓝色着色的细胞，数量较多（图1）。而在正常皮肤组织中，见少许阳性细胞分布于表皮基底层、真皮层。原肌球蛋白基因在早期瘢痕的阳性细胞中着色较深，晚期瘢痕及正常皮肤中着色较浅（图2）。对伤后3～6个月不同时期的瘢痕组织标本进行观察后发现，

增生性瘢痕原肌球蛋白的表达无论阳性细胞的数量，均明显强于9～12个月增生性瘢痕、非增生性瘢痕和正常皮肤（表1）。2．2

成纤维细胞爬片杂交结果

成纤维细胞爬片杂交结果发现，并非所有的成纤维细胞均有阳性着色，早期增生性瘢痕的阳性细胞明显多于非增生性瘢痕，而正常皮肤阳性细胞则极少。其中3～6个月增生性瘢痕的成纤维细胞着色最深，阳性细胞数量最多（表2）。

图1

3个月增生性瘢痕中原肌球蛋白

箭头示阳性细胞

图2

正常皮

b（×400）

3

PBS洗涤，织，并剪修为5mm大小组织块，加入0.25%DispaseⅡ（Roche，USA），37℃孵育2h后，轻轻

撕去表皮。用PBS反复洗涤，将组织块尽量剪碎，加

Sigma，USA）并用锥形瓶在入Ⅰ型胶原酶（1mg/mL，

37℃恒温摇床孵育2h（80r/min），将组织悬液用100目不锈钢网过滤，离心收集细胞，加含10%小牛血清

的原位杂交结果a（×200）（×200）

肤组织内原肌球蛋白的原位杂交结果

仅少量表达于表皮基底层，

箭头示阳性细胞

表1

组织类型增生性瘢痕非增生性瘢痕正常皮肤

*

珔x±s）原肌球蛋白在各种组织各时间点的阳性表达（n=6，

瘢痕时间

6个月

#*#

3个月0．3210±0．03510．2567±0．0191

9个月

#*#

0．2968±0．02970．1774±0．0153

0．2173±0．0212

##

12个月

0．1886±0．01700．1140±0．0096#0．0178±0．0040*

0．1468±0．0128*0．0165±0．0020*

0．0210±0．0030*0．0189±0．0040*

P＜0．05；#与同一组织类型12个月时间点比较，P＜0．05与同一时间点增生性瘢痕比较，

1208

表2

WestChinaMedicalJournal，Vol．25，No．7July．201025（7）华西医学2010，

珔%，x±s）瘢痕成纤维细胞爬片原肌球蛋白阳性表达百分比（n=6，瘢痕性质

3个月21±3*

12±2

瘢痕时间6个月9个月14±4*10±3

6±1*5±1

12个月3±1*

0

（myofibroblast）的发现被认为是该领域的一个重大进展。该细胞不仅具有某些平滑肌细胞的特征，如含有丰富的肌动蛋白微丝，核膜具有多个切迹，而且又具有细胞内含有丰富的粗面内典型的成纤维细胞的特征，

［5］

类似平滑肌细胞一样具有收缩能力。瘢痕挛质网，

缩是一个非常复杂的病理过程，在这个过程中，肌成纤维细胞是瘢痕挛缩的动力来源，它通过胞内肌动蛋白、肌球蛋白及钙离子/钙调蛋白等构成的非肌细胞收缩系统，在外界信号的刺激下，产生强烈而持久的收缩。

6］Lieleg等［研究证实，肌动蛋白的聚合是细胞产生运

增生性瘢痕非增生性瘢痕

*

P＜0．05与非增生性瘢痕比较，

3讨论

过度瘢痕形成及瘢痕挛缩是创伤、烧伤治疗亟待

解决的重要临床问题之一。增生性瘢痕的形成是深Ⅱ度或Ⅲ度烧伤创面异常修复的结果。现已证实，多种细胞外基质分子，生长因子、细胞因子、蛋白酶类均参

［2］

与了调节增生性瘢痕相关细胞的增殖与迁移。但是，这些因素是如何导致瘢痕产生的机制尚不清楚。

动的基础。而肌成纤维细胞内的肌动蛋白有两种存在

形式，即单体（G）和聚合体（F）。在增生性瘢痕中，肌成纤维的收缩与肌动蛋白的总量无关，只与F/G的比值有关。本研究发现，增生挛缩的瘢痕中原肌球蛋白表达信号强，分布广，与瘢痕的形成与发展过程基本一致，并且在成纤维细胞爬片中阳性率高，而在非增生性瘢痕中其表达很快降到低水平，正常皮肤中则难以看

说明原肌球蛋白基因的表达与瘢痕形成与收缩明到，

显相关。但是，原肌球蛋白在瘢痕形成中产生作用的

是否是因为在瘢痕肌成纤维细胞明确机制尚不清楚，

中，由于出现原肌球蛋白构型变化而导致其与肌动蛋

白结合异常等，这些问题都有待于深入研究。这些研究的成果将有助于我们深入了解瘢痕产生的机制。

4

参考文献

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（收稿：2010-01-05

06-29）修回：2010-（本文编辑：张世雯）

伴随着人类基因组计划的实施，一些高通量的生物学

技术成果被用于疾病的机理研究，并使我们对于疾病的产生有了全新的认识。基因芯片技术就是其中之一，它可以用于同时比较分析数千条、甚至数万条基因，从而较全面地反映相关疾病的基因表达全貌。我们利用基因芯片对增生性瘢痕与正常皮肤进行基因差异表达筛选，发现97条基因在增生性瘢痕组织中表达明显异常，这些基因参与了创面过度修复、增生性瘢痕形成过程调控。为了深入了解这些基因在瘢痕形成中的作用，我们选择了差异值最大、涉及细胞骨架及细胞运动、迁移的原肌球蛋白基因进行研究。研究表明，细胞骨架分为3种蛋白质纤维，即微

微管及中等纤维。微丝专指由肌动蛋白（actin）组丝、

成的7nm纤维。微管是真核细胞所独有的结构，存在于细胞质基质，属于一种保守的成分。中等纤维在细胞质内形成一个完整的支撑网架系统。它在外面与细胞膜和细胞外基质直接联系，在内部与核表面和核基质直接联系，中间与微丝、微管及基质细胞器结合，因

［3］

此在细胞内和细胞间起着多方面的结构作用。原肌球蛋白是存在于细胞、能调节细胞功能并具有保守型的一类酸性蛋白及多肽，通常每分子由284个氨基酸组成，具有独特性质和功能。它广泛地分布于含有成熟的肌动蛋白细丝的脊椎动物的多种组织

肌动蛋白与肌球蛋白相互作用中。在横纹肌组织中，

而引起肌肉收缩与松弛，这一机制是由肌钙蛋白复合

［4］

物调节的。X衍射观察发现，骨骼肌收缩过程中，原肌球蛋白在肌动蛋白沟槽中滑动，从而通过“开关”肌动蛋白与肌球蛋白的相互作用而起到调节肌肉组织收

［5］

缩的作用。在瘢痕研究中，肌成纤维细胞

［1］vanderVeerWM，BloemenMC，UlrichMM，etal．Potentialcellular